CN106538377A

CN106538377A - 一种提高三系杂交稻中不育系纯度的方法及其应用

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Publication number: CN106538377A
Application number: CN201610981794.3A
Authority: CN
Inventors: 方军; 朴钟泽; 白建江; 杨瑞芳
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2016-11-08
Publication date: 2017-03-29

Abstract

一种提高三系杂交稻中不育系纯度的方法及其应用，该方法通过杂交、回交将抗除草剂基因导入三系杂交稻的保持系B中，获得所述抗除草剂基因纯合的保持系Br；以保持系Br作为父本、以对应保持系的除草剂敏感的不育系A作为母本杂交，获得具有抗除草剂基因的不育系Ar，该不育系Ar是抗除草剂基因的杂合体；种植不育系Ar，在秧苗期喷洒除草剂，自交或花粉污染的杂苗死亡，存活的植株为纯度很高的具有抗除草剂基因的不育系。本发明所述方法可以简单、经济地去除不育系中的杂苗，保证在生产杂交稻种子的过程中不育系水稻苗的纯度，减少杂交稻制种的风险和成本。

Description

一种提高三系杂交稻中不育系纯度的方法及其应用

技术领域

本发明属于三系杂交稻制种技术领域，具体涉及一种提高三系杂交稻中不育系纯度的方法及其应用。

背景技术

杂交稻培育与推广是我国水稻研究领域具有里程碑意义的育种技术革新，是超级稻选育的主要途径。三系法杂交水稻为世界水稻发展做出巨大贡献。杂交稻的制种纯度风险是杂交稻领域不容忽视的问题，我国每年消耗大量人力物力以降低风险。杂交稻制种纯度是杂交稻高产的必要保障，纯度降低的一个原因是不育系不纯。

为了保证不育系纯度，不育系制种时必须采取隔离措施，将制种田块与其他水稻田块隔离，防止其他水稻花粉飘逸到制种田中导致制种纯度降低。人为操作不当也会降低制种纯度，引发制种风险。此外，在杂交稻制种过程中需要对不育系杂苗进行人工去除，消耗大量的人力物力。部分纯度低的不合格种子流入市场，导致农户损失，引发农户与种子公司争端，出现社会不稳定因素和粮食安全问题。

我国科学家培育了转基因抗除草剂保持系水稻品系，但是转基因水稻在我国无法推广种植，目前只能处于实验室阶段。因此，一种可以推广的、简单易操作、成本低的提高三系杂交稻不育系纯度的方法对于减少制种纯度风险，降低杂交稻制种成本具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高三系杂交稻中不育系纯度的方法及其应用，该方法无需制种隔离及人工去杂，也可显著提高不育系纯度，具有可推广、简单易操作、成本低等优点，应用于三系杂交稻制种工艺中可大大提高水稻制种纯度。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种提高三系杂交稻中不育系纯度的方法，其包括如下步骤：

1)以含有抗除草剂基因的水稻“CL55”为父本，三系杂交稻的保持系B为母本进行杂交，后代喷洒除草剂，去除假杂交植株，获得抗除草剂杂合体；之后，该抗除草剂杂合体与保持系B反复回交，直至获得与保持系B农艺性状一致的保持系，回交过程中喷洒除草剂，去除假杂交植株；然后，该保持系进行自交，再种植自交后代种子，喷洒除草剂，去除假杂交植株，单株收获，获得后代种子；单株种植后代种子，喷洒除草剂筛选后代，100％存活的植株为抗除草剂基因纯合的保持系Br；

2)以步骤1)获得的保持系Br作为父本、以对应保持系的除草剂敏感的不育系A作为母本杂交，获得具有抗除草剂基因的不育系Ar，该不育系Ar是抗除草剂基因的杂合体；

3)种植步骤2)获得的不育系Ar，在秧苗期喷洒除草剂，自交或花粉污染的杂苗死亡，存活的植株为纯度很高的具有抗除草剂基因的不育系。

进一步，步骤1)中抗除草剂基因为乙酰乳酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示。

上述步骤1)、步骤3)中，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。

又，所述咪唑啉酮类除草剂为咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟或甲基咪草烟。

优选的，所述咪唑啉酮类除草剂为甲氧咪草烟或甲基咪草烟。

本发明中所述乙酰乳酸合成酶基因具有咪唑啉酮类除草剂抗性，该基因来源于水稻品种“CL55”(保藏号：CGMCC No.9348；保藏日期：2014年7月14日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)。

本发明所述提高三系杂交稻中不育系纯度的方法在三系杂交稻制种中的应用。

本发明通过将非转基因抗除草剂基因导入三系杂交稻的保持系中，获得的水稻保持系为非转基因除草剂基因的纯合体，该保持系的农艺性状与原保持系一致，并可以稳定遗传；以此纯合体的保持系为父本、对应的除草剂敏感的不育系为母本进行杂交，获得具有抗除草剂基因的不育系，该不育系为非转基因除草剂基因的杂合体，其与原不育系的农艺性状保持一致。在杂交稻制种过程中，在不育系苗期喷洒除草剂去除杂苗，显著提高存活的不育系的纯度。

本发明所述方法可以简单、经济地去除不育系中的杂苗，保证在生产杂交稻种子过程中不育系水稻苗的纯度，减少杂交稻制种的风险和成本。

本发明的有益效果：

(1)本发明将不含抗除草剂基因的不育系和含抗除草剂基因的保持系杂交获得抗除草剂不育系，在杂交水稻制种过程中，抗除草剂不育系苗期喷洒除草剂可以去除不含本发明非转基因抗除草剂基因的杂苗，存活的植株为纯度很高的含抗除草剂基因的不育系，显著提高制种不育系的纯度，进而提高水稻制种纯度。

(2)本发明巧妙地使用非转基因抗除草剂保持系水稻进行不育系育种，使不育系水稻具有抗除草剂特性，通过在秧田喷洒除草剂的方法去除非不育系杂苗，使不育系的杂苗数降至≤1％。本发明不需要制种隔离、谨慎操作和人工去杂即可提高不育系纯度，降低不育系制种人力物力成本，提高制种利润。

(3)本发明使用的保持系携带非转基因抗除草剂基因，生产和种植不受国家转基因法规的限制，可以在我国大面积生产和大规模种植，易于生产和推广。

附图说明

图1为本发明实施例的育种提纯流程示意图。

图2为本发明实施例2制备抗除草剂基因杂合不育系的田块种植分布示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。

下列实施例中如无特殊说明，均为《水稻分子育种技术指南》(科学出版社，2012年)所记载的方法。咪唑烟乙酸除草剂为山东先达公司的“豆说好”，稀释浓度为稀释200倍，终浓度除草剂用量为500毫升。甲基咪草烟除草剂为德国巴斯夫公司的“百垄通”，稀释浓度为稀释1000倍，终浓度除草剂用量为500毫升。甲氧咪草烟除草剂为美国氰胺公司的“金豆”，稀释浓度为稀释100倍，终浓度除草剂用量为500毫升。

本领域技术人员可以理解，本发明实施例中的保持系品系“B”和“Br”系列、相对应的不育系品系“A”和“Ar”、以及恢复系品系“R1”可以为任意三系法杂交稻的保持系、不育系和恢复系。

本发明实施例的育种提纯流程如图1所示。

实施例1制备非转基因抗除草剂基因纯合的保持系

为了获得非转基因抗除草剂基因纯合的保持系，通过杂交、回交、多次回交的方法将抗除草剂基因导入保持系B中，获得有抗除草剂基因的保持系Br，实验步骤如下：

1)以水稻品种“CL55”为父本，保持系品系“B”为母本，杂交获得后代“Br1”种子。

2)种植“Br1”种子，喷洒除草剂“百垄通”，去除假杂交稻苗，获得杂交植株“Br1”。以杂交植株“Br1”为父本，保持系品系“B”为母本，杂交获得后代“Br2”种子。

3)种植“Br2”种子，喷洒除草剂“百垄通”，去除假杂交稻苗，获得杂交植株“Br2”。以杂交植株“Br2”为父本，保持系品系“B”为母本，杂交获得后代“Br3”种子。

4)种植“Br3”种子，喷洒除草剂“百垄通”，去除假杂交稻苗，获得杂交植株“Br3”。以杂交植株“Br3”为父本，保持系品系“B”为母本，杂交获得后代“Br4”种子。

5)种植“Br4”种子，喷洒除草剂“百垄通”，去除假杂交稻苗，获得杂交植株“Br4”。以杂交植株“Br4”为父本，保持系品系“B”为母本，杂交获得后代“Br5”种子。

6)种植“Br5”种子，喷洒除草剂“百垄通”，去除假杂交稻苗，获得杂交植株“Br5”。以杂交植株“Br5”为父本，保持系品系“B”为母本，杂交获得后代“Br6”种子。

7)种植“Br6”种子，喷洒除草剂“百垄通”，去除假杂交稻苗，获得杂交植株“Br6”。种植保持系品系“B”种子，作为对照，在杂交植株“Br6”生长发育过程中，选择与保持系品系“B”农艺性状相同的植株，获得后代“Br7”种子。

8)种植“Br7”种子，自交，获得自交后代“Br8”种子。

9)单株种植“Br8”种子，喷洒除草剂“百垄通”，去除假杂交稻苗。单株收获，获得后代“Br9”种子，各个单株种子分别编号为“Br9-1”、“Br9-2”、“Br9-3”、“Br9-4”、“Br9-5”、“Br9-6”、“Br9-7”、“Br9-8”。

10)选取每个单株“Br9”种子40粒，分别单株种植，喷洒除草剂“百垄通”，死亡植株数量为：“Br9-1”：40株；“Br9-2”：0株；“Br9-3”：40株；“Br9-4”：10株；“Br9-5”：40株；“Br9-6”：40株；“Br9-7”：0株；“Br9-8”：10株。其中死亡40株的“Br9-1”、“Br9-3”、“Br9-5”、“Br9-6”不含除草剂基因，死亡10株的“Br9-4”、“Br9-8”为除草剂基因杂合体，死亡0株的“Br9-2”、“Br9-7”为除草剂基因纯合体的保持系即为非转基因抗除草剂基因纯合的保持系。

实施例2制备非转基因抗除草剂基因杂合的不育系

为了获得非转基因抗除草剂基因杂合的不育系，实验步骤如下：

1)将实施例1得到的除草剂基因纯合体的保持系“Br9-2”，对应的除草剂敏感的不育系品系“A”(该不育系品系“A”为常规不育系品系，按照常规方法由对除草剂敏感的保持系“B”与对除草剂敏感的不育系“A”杂交获得)进行非隔离种植(种植分布按照图2所示)，进行非隔离种植。

2)在水稻开花期，拍打“Br9-2”植株，使花粉落到不育系品系“A”上，即保持系“Br9-2”为父本、不育系品系“A”为母本进行杂交，收获不育系种子“Ar”。

3)种植不育系种子“A”和步骤2)收获的不育系种子“Ar”，对比两者生长发育情况和农艺性状。结果显示，“A”和“Ar”的生长发育与农艺性状相同。因此，不育系种子“Ar”可以作为不育系进行杂交。

实施例3喷洒除草剂提高不育系纯度

为了提高不育系纯度，进行实验步骤如下：

1)在1号、2号、3号、4号田块分别单株种植不育系种子“Ar”500株，在苗期进行除草剂处理。其中，1号田块为对照，不喷洒除草剂；2号田块喷洒“豆说好”除草剂；3号田块喷洒“金豆”除草剂；4号田块喷洒“百垄通”除草剂。

2)喷洒除草剂后15天，进行水稻植株生长发育的检测，具体为测量植株的高度。测量结果为：以1号田块中植株高度为100％，2号田块中植株高度为75％，3号田块中植株高度为90％，4号田块中植株高度为92％。由此说明，“豆说好”除草剂对水稻植株的生长抑制较大，而“金豆”和“百垄通”除草剂对水稻植株的生长抑制较小。

3)在不育系开花期检测各个田块中的杂苗数，检测结果分别为：1号田块中杂苗数为30％，2号田块中杂苗数为小于1％，3号田块中杂苗数为小于1％，4号田块中杂苗数为小于1％。由此说明，喷洒除草剂后可以大幅度减少不育系中的杂苗，实现简单、有效、低成本清除杂苗的目的，显著提高不育系的纯度。

实施例4三系水稻杂交制种

1)种植不育系种子“Ar”，在苗期进行喷洒“百垄通”除草剂处理，去除自交或花粉污染的杂苗。此过程避免人工除杂过程中需要的鉴别技术和工人除杂时的导致的踩苗、漏苗等损失，节约大量的人工成本，同时，提高除杂的效率和效果。

2)在插秧期，间隔种植不育系稻苗“Ar”和恢复系稻苗“R1”。

3)在水稻穗期，根据不育系农艺性状计算杂苗数，结果表明田块中杂苗数为小于1％。

4)在水稻花期，赶花粉进行水稻杂交。

5)收获杂交稻种子。

Claims

1.一种提高三系杂交稻中不育系纯度的方法，其包括如下步骤：

1)以含有抗除草剂基因的水稻“CL55”为父本，三系杂交稻的保持系B为母本，进行杂交，后代喷洒除草剂，去除假杂交植株，获得抗除草剂杂合体；之后，该抗除草剂杂合体与保持系B反复回交，直至获得与保持系B农艺性状一致的保持系，回交过程中喷洒除草剂，去除假杂交植株；然后，该保持系进行自交，再种植自交后代种子，喷洒除草剂，去除假杂交植株，单株收获，获得后代种子；单株种植后代种子，喷洒除草剂筛选后代，100％存活的植株为抗除草剂基因纯合的保持系Br；

2)以步骤1)获得的保持系Br作为父本、以对应保持系的除草剂敏感的不育系A作为母本，进行杂交，获得具有抗除草剂基因的不育系Ar，该不育系Ar是抗除草剂基因的杂合体；

3)种植步骤2)获得的不育系Ar，在秧苗期喷洒除草剂，自交或花粉污染的杂苗死亡，存活的植株为高纯度的具有抗除草剂基因的不育系。

2.根据权利要求1所述的提高三系杂交稻中不育系纯度的方法，其特征在于，步骤1)中抗除草剂基因为乙酰乳酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

3.根据权利要求1或2所述的提高三系杂交稻中不育系纯度的方法，其特征在于，步骤1)、步骤3)中，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。

4.根据权利要求3所述的提高三系杂交稻中不育系纯度的方法，其特征在于，所述咪唑啉酮类除草剂为咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟或甲基咪草烟。

5.根据权利要求3或4所述的提高三系杂交稻中不育系纯度的方法，其特征在于，所述咪唑啉酮类除草剂为甲氧咪草烟或甲基咪草烟。

6.如权利要求1-5任一项所述的提高三系杂交稻中不育系纯度的方法在三系杂交稻制种中的应用。