CN106519010A - 黄体生成素重组蛋白饲料添加剂的制备及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄体生成素重组蛋白饲料添加剂的制备及其使用方法；本发明将金钱鱼的LH基因的cDNA序列全长，通过原核表达得到了金钱鱼LH重组蛋白，以及通过制作饲料的工艺制作饲料。本发明通过对模式生物青鳉的实验发现，投喂添加有黄体生成素LH重组蛋白的饲料可以使其性腺发育产生积极的变化。本发明制得的金钱鱼LH重组蛋白菌体可用作鱼类蛋白饲料添加剂，在于对鱼类的性腺发育产生促进作用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种黄体生成素重组蛋白饲料添加剂的制备及其使用方法。
背景技术
现有的单细胞蛋白饲料的制作方法，是通过微生物及某些发酵菌类产生单细胞蛋白，又称生物菌体蛋白或微生物蛋白，是指酵母菌、真菌、霉菌、非致病性细菌等单细胞微生物体内所产生的菌体蛋白质，含量为40％-80％。单细胞蛋白饲料不仅蛋白质含量高，还含有脂肪、碳水化合物、核酸、维生素和无机盐，以及动物机体所必需的各种氨基酸，特别是植物饲料中缺乏的赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸含量较高，生物学价值大大优于植物蛋白饲料。另外，单细胞蛋白饲料生成周期短、效率高。例如，酵母菌繁殖一代的时间是1-3h；细菌是0.5-2h；藻类是2-6h。在同一时间内，微生物合成蛋白质的能力比植物快几倍到几万倍，比动物快几十倍到几十万倍。
研究显示，日粮中赖氨酸与精氨酸的比率较高，会对动物生长产生不良影响，氨基酸的不平衡必然导致动物体合成蛋白质效率低下，进而生长受到影响；可以额外添加晶体氨基酸或者通过原料间的互补来解决这一问题。对单细胞蛋白质日粮的研究结果还表明，单细胞蛋白质日粮的消化率比常规蛋白质源的日粮低10％～15％，主要有以下两个原因：①细菌多糖(如asmuramate和二氨基庚二酸)会与日粮蛋白质结合从而阻碍蛋白质的消化；②单细胞蛋白质制品中含有一些不可消化的物质，如葡聚糖和甘露聚糖，这些都可降低日粮干物质的消化率。
单细胞蛋白中核酸含量很高，尤其是RNA的含量高。细菌蛋白中标RNA含量为13％～22％，而酵母蛋白质中RNA含量为6％～41％。由于核酸含量如此之高，所以肝脏中嘌呤的代谢率会增高，结果就会产生大量尿酸从而导致尿石形成以及其他代谢紊乱。因此，限制单细胞蛋白饲料在动物日粮的应用很有必要。例如，1995年，欧盟对单细胞蛋白-甲烷蛋白在饲料中的添加比例作出规定：猪饲料中的使用限量为8％，牛饲料中限量为8％，咸水鲑鱼饲料中限量为33％，淡水鲑鱼饲料中限量为19％。氨基酸不平衡也是单细胞蛋白面临的一个问题。单细胞蛋白质制品，尤其是用酵母蛋白，其中赖氨酸的含量都很高而精氨酸含量却很低。
随着水产养殖规模不断地扩大，为了稳定的保证数量的生产模式，确保繁殖、生长的效率，很多药物投入到生产行业中，这无疑会对环境以及人体造成一定伤害。现有的饲料并不能对鱼类特定功能产生积极的影响，只能在一定程度上保证其生殖、生长。目前生产单细胞蛋白饲料的技术方法比较单一，原料虽然丰富，蛋白制作工艺和其利用范围相对狭窄的微生物细菌迫切地需要改进。
此外，在使用微生物单细胞蛋白时，安全性是至关重要的。由于目前使用微生物单细胞蛋白产品为多菌种的混合物，所以，对微生物菌种的监控是保证产品安全的关键。其次，利用转基因技术能够培育出高产、高蛋白的菌株，但由此培育出的菌株其安全性问题还有待于进一步研究。第三，有害微生物、氢氰酸、重金属(汞、铅)等对单细胞蛋白饲料的污染也是影响单细胞蛋白饲料安全性的重要因素。研究发现，利用石油衍生物生产的单细胞蛋白饲料饲喂动物时，可能对其有一定毒害作用。
目前单细胞蛋白饲料的制作主要是微生物发酵生产蛋白饲料，方法包括固态、液态、吸附在固体表面的膜状培养以及其它形式的固定化细胞培养等。常规发酵以固态发酵和液体深层发酵为主。在实际的微生物工业生产中，选择固态发酵工艺还是液态发酵工艺，取决于所用菌种、原料、设备及所需产品和技术等。
未来单细胞蛋白饲料主要有以下几个研究方向：①新菌种的培育和应用：饲用微生物如乳酸菌类等具有各种酶类，能参与各种代谢活动，对动物的营养状态、生理功能、免疫反应、衰老过程等都有影响，目前世界许多国家的生物学家都在对饲用微生物进行基础研究，以期培育出比现有菌种更有效的新菌种；②利用微生物的生物学特性和代谢产物，生产丰富且种类繁多的微生物饲料；③微生物饲料优良菌种的筛选和分子育种，通过不断发掘新的微生物饲料菌种和改良现有的菌种，使产量增加、质量改善、功能加强、酶活性提高、效益增多，DNA重组、诱导变异和选择方法学等现代技术使得获得新的特异的有更好特性的菌种成为可能；④研究建立饲用微生物的分子克隆体系。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的目前生产单细胞蛋白饲料的技术方法比较单一，原料虽然丰富，蛋白制作工艺和其利用范围相对狭窄的微生物细菌迫切地需要改进等不足，提供一种黄体生成素重组蛋白饲料添加剂的制备及其使用方法；具体涉及一种DNA分子重组质粒的构建、重组蛋白的诱导过表达，以及作为饲料添加剂的使用方法。
单细胞蛋白饲料属生物发酵制品，其营养成分及饲料利用率受发酵工艺、发酵基础和环境温度等因素影响较大，在日粮配制中必须充分考虑其营养成分构成，合理确定添加比例方能取得较佳的饲养效果。目前，单细胞蛋白饲料的制作工艺，偏向于微生物发酵，是将不同原料，在有限种类的微生物发酵作用下进行生产。
本发明是针对鱼类性腺生长发育，利用RT-PCR和RACE等分子生物操作技术，首先克隆得到黄体生成素(LH)的DNA序列全长，然后通过酶切等技术进行重组质粒的构建，再将重组质粒转化导入到大肠杆菌内，然后在IPTG作用下进行重组蛋白的诱导表达，最后将收集的菌体适温烘干、磨制成粉，然后与普通饲料原料混合制备单细胞蛋白饲料。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种黄体生成素重组蛋白饲料添加剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1、克隆获得金钱鱼黄体生成素LH基因序列全长，与pGEM-T Easy载体连接后转化至DH5α感受态细胞，扩增培养之后，提取包含目的基因LH和载体pGEM-T Easy的质粒；
S2、选择酶切位点NdeI(238)，XhoI(158)分别对步骤S1提取得到的质粒DNA进行双酶切，回收有效片段，纯化；
S3、将步骤S2回收、纯化得到的目的基因的回收产物导入BL-21表达感受态细胞；摇菌、挑菌，选取有效菌液进行诱导培养，SDS、Western验证蛋白表达，-80℃甘油保存有效菌液；
S4、取步骤S3获得并保存的pET-LH/BL菌液振荡培养，进行重组蛋白诱导表达；挑取单克隆菌落进行扩增培养，收集沉淀，得黄体生成素重组蛋白菌体，即所述重组蛋白饲料添加剂。
优选的，步骤S2中，根据pET-28a+载体选择酶切位点NdeI(238)，XhoI(158)。
优选的，步骤S3中，所述摇菌、挑菌，选取有效菌液进行诱导培养具体为：加入LB液体培养基，摇菌；将所摇得的菌液进行离心收集后涂于卡那霉素(Kana+)的LB平板进行挑菌，置于含卡那霉素(Kana+)的LB液体培养基中再次摇菌，选取有效菌液进行诱导培养。
优选的，所述诱导培养具体为：将有效菌液以1∶100转接到LB培养基中，37℃，200rpm，进行大量培养2-3h；当细菌长到OD＝0.4-0.6后，加入IPTG工作液至其终浓度为1mM，37℃诱导培养6-8h，收集菌液。
优选的，步骤S4中，所述震荡培养具体为：每100ul的pET-LH/BL菌液接于1ml含卡那霉素(Kana+)的LB液体培养基中，37℃，振荡培养0.5～1.5h。
优选的，步骤S4中，所述挑取单克隆菌落进行扩增培养具体为：待振荡培养的菌液变浑吸取适量涂于含卡那霉素(Kana+)的LB固体平板培养基上，37℃培养10-14h；挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素(Kana+)LB液体培养基中，置于200rpm，37℃摇床，持续摇菌6-8h，使得大肠杆菌得以大量扩增培养。
优选的，所述含卡那霉素(Kana+)LB液体培养基中卡那霉素终浓度为50ug/ml；接种比例为体积比1∶100。
优选的，步骤S4中，4℃，10000g离心15min收集沉淀；之后还包括将沉淀置于低温烘箱中，60-70℃烘干8-12h的步骤。
更优选的，将烘干所得沉淀研磨至超微粉末，与α-淀粉混合均匀后，按20wt％-30wt％比例混入普通鱼用饲料原料中，混合均匀制成油性颗粒饲料。
本发明还涉及一种前述的方法制得的重组蛋白饲料添加剂的使用方法，所述方法包括将黄体生成素重组蛋白菌体与α-淀粉混合均匀后，按20wt％-30wt％的比例混入普通鱼用饲料原料中，混合均匀制成油性颗粒饲料。
优选的，所述饲料添加剂为鱼用饲料添加剂。
优选的，所述黄体生成素重组蛋白菌体与α-淀粉的重量用量比5.5～7∶1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)目前，单细胞蛋白饲料的制作工艺，偏向于微生物发酵，是将不同原料，在有限种类的微生物发酵作用下进行生产；现有的饲料并不能对鱼类特定功能产生积极的影响，只能在一定程度上保证其生殖、生长；本发明利用DNA分子重组原理构建新的菌种，满足自然选种的不足，对鱼类性腺生长发育产生积极影响。
2)本发明方案填补了国内外利用黄体生成素(LH)重组质粒的构建制备单细胞蛋白饲料添加剂的技术空白，为微生物饲料优良菌种的筛选和分子育种，以及不断发掘新的微生物饲料菌种和改良现有的菌种提供了新的方法和工艺、技术路线，使产量增加、质量改善、功能加强、酶活性提高、效益增多，并且DNA重组、诱导变异和选择方法学等现代分子技术使得获得新的特异的有更好特性的菌种成为可能，故而可以研究建立饲用微生物的分子克隆体系。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为LH克隆PCR琼脂糖电泳图；
图2为表达前菌落验证PCR电泳图；
图3为双酶切LH、pET-28a、pET-LH电泳图；
图4为重组pET-LH质粒全长电泳图，为pET-LH胶回纯化电泳图；
图5为pET-LH重组蛋白Western检测图谱，其中，a为pET-LH蛋白印迹转膜ECL显色拍摄图，b为pET-LH蛋白印迹转膜ECL显色拍摄图；
图6为青鳉雌性实验组的石蜡切片H.E.染色示意图，其中，a、b、c、d、e分别为实验组的5条雌性青鳉的卵巢10×下的石蜡切片H.E.染色示意图；
图7为雌性对照组的石蜡切片H.E.染色示意图，其中，a、b、c、d、e分别为对照组的5条雌性青鳉的卵巢10×下的石蜡切片H.E.染色示意图；
图8为青鳉雄性实验组的石蜡切片H.E.染色示意图，其中，a、b、c、d、e分别为实验组的5条雄性青鳉的精巢20×下的石蜡切片H.E.染色示意图；
图9为雄性对照组的石蜡切片H.E.染色示意图，其中，a、b、c、d分别为对照组中4条雄性青鳉的精巢20×下的石蜡切片H.E.染色示意图；e为另一条雄性青鳉的精巢40×下的石蜡切片H.E.染色示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
本实施例涉及一种黄体生成素重组蛋白的扩增表达及其作为饲料添加剂的用途；具体包括如下步骤：
1)先利用RT-PCR和RACE技术，克隆获得金钱鱼LH(黄体生成素)基因序列全长，通过与pGEM-T Easy载体(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)16℃连接过夜，然后再转化至DH5α感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)，然后摇菌3-6h后，进行菌落PCR验证，将有效菌液接种到新鲜的LB液体培养基中，使用足够的LB液体培养基让大肠杆菌大量扩增培养。
图1为LH克隆PCR琼脂糖电泳图，由图1可知，LH片断大小700bp左右。
2)提取质粒：上述摇菌包括转入目的基因和表达载体的感受态细胞，扩增培养之后，先将扩增培养的大肠杆菌离心收集，然后利用Takara质粒抽提试剂盒大量提取目的基因和载体的质粒。
3)双酶切：根据pET-28a+载体(北京全式金生物技术有限公司)选择酶切位点NdeI(238)，XhoI(158)分别对提取的质粒DNA进行双酶切，将目的片段和表达质粒用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经琼脂糖电泳检测后，2％琼脂糖胶跑胶，用Promega胶回试剂盒回收有效片段。
4)纯化：通过琼脂糖进行胶回，目的基因回收的是较小的片段，质粒则是较大的片段。
5)连接：将目的基因和质粒的回收产物连接，以10∶1的比例，16℃连接过夜。琼脂糖电泳鉴定正确后，将连接产物导入BL-21表达感受态细胞(BL21(DE3)感受态细胞天根生化科技(北京)有限公司)中，加入装有新鲜1mlLB液体培养基的1.5ml的EP管中，摇菌。
6)酶切检测：对连接产物分别进行双酶切和单酶切(都是2个)检测。将携带有目的基因和载体的质粒的菌液，接种于50mlLB液体培养基(Amp+工作液浓度50ug/ml)，37℃，200rpm，摇菌6-8h，双酶切组与单酶切组互相做对照。
图3为双酶切LH、pET-28a、pET-LH电泳图；由图3可知，因为购买pET-28a载体片段大小为5369bp，图中pET-LH大小约为6000bp，符合酶切意图。
7)将所摇得的菌液进行离心收集，然后涂于Kana+的LB平板，每组10样进行挑菌，置于装有1ml Kana+的LB液体培养基的1.5mlEP管中摇菌3-6h，进行菌落PCR验证，选取上述步骤中的有效菌液进行接下来的接种工作。
8)将上述菌液以1∶100转接到新的LB中，37℃，200rpm，进行大量培养2-3h；当细菌长到OD＝0.4-0.6后，加入IPTG工作液至其终浓度为1mM，37℃诱导培养6h，收集菌液(做对照组，无IPTG)。
9)蛋白检测：4℃，12,000g离心5min，收集细菌沉淀，1×PBS漂洗(注意不要溶解)，然后溶解沉淀，加2×LoadingBuffer，100℃煮沸5min，冷却至室温，然后10,000g离心10min，取5ul上清进行SDS-PAGE电泳。考染或WesternBlot分析，出现目的条带，蛋白丰度较高，进行诱导蛋白扩增培养。
图2为表达前菌落验证PCR电泳图，由图2可知，根据片断大小同图1，所选用菌液为正确菌液。
10)重组蛋白诱导表达：取7)中(有效菌液)-80℃保存的pET-LH/BL和pET-28a/BL冻存菌液100ul接于装有1ml含卡那霉素(Kana+)的新鲜LB液体培养基的1.5mlEP管中，37℃，振荡培养1h。
11)待菌液变浑，随后吸取适量菌液涂于含卡那霉素(Kana+)的LB固体平板培养基上，37℃培养10-14h。
12)挑取单克隆菌落接种于1ml含卡那霉素(Kana+)LB液体培养基的1.5mlEP管中，37℃，振荡培养8-10h以让大肠杆菌大量扩增(生长至大肠杆菌对数生长期)。
13)菌液PGR验证后，将含有目的基因插入片段的菌液以1∶100(v/v)的比例接种于400ml新鲜(Kana+终浓度50ug/ml)LB液体培养基中。该步骤可以根据需要扩大培养基的使用量。
图4为重组pET-LH质粒全长电泳图，由图4可知，pET-LH大小约为6000bp，酶切正确，回收产物为目的片段。
图5为pET-LH重组蛋白Western检测图谱，由图5可知，蛋白表达丰度较高，大小约为16kDa。
14)置于200rpm，37℃摇床，持续摇菌6-8h，使得大肠杆菌得以大量扩增培养。
15)重组蛋白饲料添加剂：收集大肠杆菌沉淀，4℃，10000g离心15min；将沉淀置于低温烘箱中，60-70℃烘干8-12h。
16)将烘干所得大肠杆菌沉淀研磨至超微粉末。并将超微粉末与α-淀粉按照适当比例混合均匀，再按20％比例混入普通鱼用饲料原料中，混合均匀制成油性颗粒饲料，颗粒粒径大小适于鱼类食用。
挑选模式生物青鳉进行投喂验证试验，分为2组(①饲料中未添加重组蛋白，即对照组；②饲料中添加重组蛋白，即实验组)，分别投喂出膜20d青鳉幼鱼，并于40d后进行样品采集，再进行组织学切片和H.E.染色检测效果。
石蜡切片，H.E.染色
1)A.实验组(♀)，如图6所示，卵黄颗粒已基本成熟，卵接近排放。
B.对照组(♀)，如图7所示，卵母细胞发育基本处于II-III期。
2)A.实验组(♂)，如图8所示，精小叶已基本成熟，精液已部分排出。
B.对照组(♂)，如图9所示，精小叶正逐渐成熟。
由图6-9可以观察得到，青鳉投喂验证实验结果：①雌性中，实验组卵巢发育成熟度明显高于对照组；②雄性中，实验组精巢发育成熟度略高于对照组。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (9)
1.一种重组蛋白饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、克隆获得金钱鱼黄体生成素LH基因序列全长，与pGEM-T Easy载体连接后转化至DH5α感受态细胞，涂板挑菌，扩增培养之后，提取包含目的基因LH和载体pGEM-T Easy的质粒；
S2、选择酶切位点NdeI(238)，XhoI(158)分别对步骤S1提取得到的质粒DNA进行双酶切，回收有效片段，纯化；
S3、将步骤S2回收、纯化得到的目的基因的回收产物导入BL-21表达感受态细胞；摇菌、挑菌，选取有效菌液进行诱导培养，SDS、Western验证蛋白表达，一80℃甘油保存有效菌液；
S4、取步骤S3获得并保存的pET-LH/BL菌液振荡培养，进行LH重组蛋白诱导表达；挑取单克隆菌落进行扩增培养，收集沉淀，得黄体生成素重组蛋白菌体，即所述重组蛋白饲料添加剂。
2.如权利要求1所述的重组蛋白饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤S2中，根据pET-28a+载体选择酶切位点NdeI(238)，XhoI(158)。
3.如权利要求1所述的重组蛋白饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述摇菌、挑菌，选取有效菌液进行诱导培养具体为：加入LB液体培养基，摇菌；将所摇得的菌液进行离心收集后涂于卡那霉素的LB平板进行挑菌，置于含卡那霉素的LB液体培养基中再次摇菌，选取有效菌液进行诱导培养。
4.如权利要求1或3所述的重组蛋白饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述诱导培养具体为：将有效菌液以1∶100转接到LB培养基中，37℃，200rpm，进行大量培养2-3h；当细菌长到OD＝0.4-0.6后，加入IPTG工作液至其终浓度为1mM，37℃诱导培养6-8h，收集菌液。
5.如权利要求1所述的重组蛋白饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述震荡培养具体为：每100ul的pET-LH/BL菌液接于1ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，振荡培养0.5～1.5h。
6.如权利要求1所述的重组蛋白饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述挑取单克隆菌落进行扩增培养具体为：待振荡培养的菌液变浑，涂于含卡那霉素的LB固体平板培养基上，37℃培养10-14h；挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素LB液体培养基中，置于200rpm，37℃摇床，持续摇菌6-8h。
7.如权利要求6所述的重组蛋白饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述含卡那霉素LB液体培养基中卡那霉素终浓度为50ug/ml；接种比例为体积比1∶100。
8.一种如权利要求1所述的方法制得的重组蛋白饲料添加剂的使用方法，其特征在于，所述方法包括将黄体生成素重组蛋白菌体与α-淀粉混合均匀后，按20wt％-30wt％的比例混入普通鱼用饲料原料中，混合均匀制成油性颗粒饲料。
9.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述黄体生成素重组蛋白菌体与α-淀粉的重量用量比为5.5～7∶1。
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