CN106518279B - 含有巨大芽孢杆菌的缓释增效褐藻脲铵氮肥的生产方法 - Google Patents

含有巨大芽孢杆菌的缓释增效褐藻脲铵氮肥的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种含有巨大芽孢杆菌的缓释增效褐藻脲铵氮肥的生产方法，将烘干后的褐藻磨成粉末，褐藻粉末按照一定的比例加入水中，装入发酵罐后，灭菌；种子液制备：筛选得到一株能够产纤维素酶的发酵菌株YIC～BM1巨大芽孢杆菌，接种至液体培养基培养一定时间；将种子液加入发酵罐中，发酵后，调整发酵条件，保存一定时间后，再次调整发酵条件并补充种子液，调整三次后，将发酵液干燥得到巨大芽孢杆菌菌剂，将该菌剂与粉粹后的尿素微粒以及铵态氮肥混合并通过反击式造粒机造粒，低温烘干得成品。本发明发酵过程稳定可控，适于规模化生产。产品含海藻提取物、功能菌种，缓释增效，提高氮肥利用率，提质增产。

Description

含有巨大芽孢杆菌的缓释增效褐藻脲铵氮肥的生产方法
技术领域
本发明涉及一种肥料的生产方法。
背景技术
我国的氮肥生产量和消费量均居世界首位，但肥料利用率低却是制约我国农业发展的一大瓶颈。数据表示，2011年我国氮肥施用量2400万吨，因肥料利用率低，氮肥通过挥发、 淋溶和径流等途径损失数量巨大，直接损失肥料约1000万吨，折合人民币约340亿元。同时，随之带来土壤肥力下降、农作物品质降低、环境污染严重等后果。因此提高肥料利用率，降低肥料流失，受到国内外农业工作者广泛的关注。
按原理和工艺的不同，长效氮肥（或缓效氮肥)）可粗分为两大类：包膜类和非包膜类。聚合物包膜肥料是典型的也是目前国际公认的控效肥料，这类肥料的基本特点是其养分释放具有较好的调控性，但存在生产成本较高，工艺较为复杂，长效性不稳定等问题；改性（型）肥料是一类非包膜肥料，它通过采取某种制造手段，或加入某种添加剂，或加入某种载体，改变水溶性肥料的性质，从而达到控制或延缓肥料中养分释放的目的。但依然存在添加剂容易被分解，容易流失的问题。
以上两种缓释原理都是利用化学技术包覆或者化学添加，都具有一定的化学残留与污染。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种含有巨大芽孢杆菌的缓释增效褐藻脲铵氮肥的生产方法，通过生物发酵将褐藻提取物、功能菌种与脲铵氮肥有机结合，使肥料具有缓释增效，提质增产的功效。生产工艺稳定可控，绿色环保，适于规模化生产。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种含有巨大芽孢杆菌（拉丁文分类命名：Bacillus megaterium）的缓释增效褐藻脲铵氮肥的生产方法，其特征在于按照以下步骤进行：
先将尿素颗粒破碎为30～40目的尿素微粒，将尿素微粒、铵态氮肥、巨大芽孢杆菌菌剂按照质量比30～50:30～50:1～5混合均匀，经辊压机辊压成型为片状，降至常温后造粒；
所述铵态氮肥是氯化铵、硝铵磷、硫酸铵和碳酸氢铵中的一种或任意比例的两种以上；
所述巨大芽孢杆菌菌剂按照以下步骤制备而成：
1）、制备褐藻粉末：将烘干后的褐藻磨成粉末；
2）、制备产品A：褐藻粉末与水按照质量比1～10:100装入发酵罐中，在100～150℃条件下灭菌15～35min，得到产品A；
并制备种子液：将巨大芽孢杆菌接种至液体培养基，在25℃～40℃培养20～30小时；巨大芽孢杆菌与培养基之间的体积比为1～10:100；
3）、制备产品B：将种子液加入到产品A中得到产品B，其中种子液与产品A的质量比为1～10:100；
4）、制备产品C：在温度为25℃～40℃，pH5～9的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为6～10天，得到产品C；
5）、制备产品D：调整产品C的pH至5.0～6.0，温度至3～10℃，保存3h～72h，得到产品D；
6）、制备产品E:调整产品D的温度至25℃～40℃，pH至5～9，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为1～10:100，保存3h～72h，得到产品E；
7）、制备产品F：调整产品E的pH至5.0～6.0，温度至3～10℃，保存3h～72h，得到产品F；
8）、制备产品G：调整产品F的温度至25℃～40℃，pH至5～9，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为1～10:100，保存3h～72h，得到产品G；
9）、制备巨大芽孢杆菌菌剂：将产品G干燥成粉末得到巨大芽孢杆菌菌剂；
其中巨大芽孢杆菌，其保藏单位的简称为YIC～BM1，其保藏号为CGMCC No.12156。
所述液体培养基按照以下质量比配成：褐藻酸钠5份、硫酸铵5份、硫酸镁1份、磷酸氢二钾2份、硫酸亚铁0.01份、琼脂20份和蒸馏水1000份。
步骤2）所述褐藻粉末和水的质量比为4:100；灭菌温度115℃，灭菌时间25min；制备种子液时，巨大芽孢杆菌接种至液体培养基中，在30℃培养24小时，得到种子液，巨大芽孢杆菌和培养基的体积比例为5:100；步骤3）中，种子液与产品A的质量比为10:100；步骤5）和步骤7）中，温度为5℃，保存时间为12h。
步骤4）、步骤6）和步骤8）中，温度为30℃，pH为6.5～7.0；步骤4）发酵时间为8天；步骤6）和步骤8）保存时间为12h；步骤6）中补充的种子液与产品D的质量比以及步骤8）中补充的种子液与产品F的质量比均为5:100。
步骤5）、步骤6）步骤7）和步骤8）中，调整温度均为每小时调整3℃。
所述褐藻是指鼠尾藻，铜藻和马尾藻中的一种或任意比例的两种以上。
本发明具有以下有益技术效果：区别于现有的缓释技术，本发明制备的是一种生物缓释氮肥。众所周知，微生物具有调节土壤理化性质，改良土壤的作用，对氮肥的缓释增效作用却关注很少，本发明发现将自主筛选的巨大芽孢杆菌YIC～BM1与脲铵氮肥相结合，表现出明显的缓控释作用，明显减少了氮肥的施用量，提高了肥料的利用率。
1）、本发明筛选的巨大芽孢杆菌具有较强的生存能力，其生长代谢能够抑制脲酶的产生
和硝化细菌的繁殖，从而减缓尿素的氨化作用与铵态氮的硝化作用，使得氮素营养缓慢释放从而达到缓控释的作用，提高了肥料的利用率。该工艺相对于化学缓控技术更加环保，更加长效。
2）、本发明将褐藻与脲铵氮肥有机结合，褐藻被离解产生的褐藻酸钠具有很强的保水
保肥的功效，其分子结构含有大量的羧基能够跟铵根离子结合从而进一步加强了脲铵氮肥的缓控释作用。
3）、本发明通过筛选得到一株海洋来源的巨大芽孢杆菌YIC～BM1，具有很强的产纤维
素酶的能力，能够很容易破坏褐藻细胞壁结构促使胞内营养物质的流出。该菌株在发酵过程中，还可以产生褐藻寡糖等易于植物吸收的次生代谢产物，有促进植物根系发育，提高作物产量的功效。
4）、本发明的产品具有较高的有效活菌数，菌种具有较强的环境适应能力，能够在土壤
中大量繁殖，起到缓冲土壤酸碱度，增强作物抗性，改良土壤环境的作用。
5）、本发明采用的菌种具有高耐盐性、耐高温性，可以直接与复混肥无机盐复配，克服了传统菌剂在高盐环境长期存放过程中大量死亡的弊端，大大延长了肥料的保质期。而这种高盐的环境使得其他杂菌不能生存，极大的降低了杂菌率，保证了肥料的高质量。
6）、本发明造粒工艺绿色，安全、条件温和，可以有效降低缩二脲的含量，降低其对作物的毒害作用。
附图说明
图1是显微观察YIC～BM1菌株的革兰氏染色及聚集成团现象图。
图2基于16SrDNA序列构建的YIC～BM1菌株系统发育树示意图。
图3是不同温度对YIC～BM1菌株产酶的影响的示意图。
图4是不同pH对YIC～BM1菌株产酶的影响示意图。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步说明本发明。
实施例1：
将洗净烘干后的新鲜鼠尾藻磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比2:100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌30min，得到产品A；并制备种子液：将巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基培养20小时；所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCC No.12156；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为2:100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为1:100，得到产品B； 在温度为20℃，pH5.5～6.0的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为7天，得到产品C；调整产品C的pH至5.0～6.0，并以每小时20℃的温度变化调整温度至5℃，保存24h，得到产品D；以每小时20℃的温度变化调整产品D的温度至20℃，pH至5.5～6.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为1:100，保存24h，得到产品E；调整产品E的pH至5.0～6.0，并以每小时20℃的温度变化调整温度至5℃，保存24h，得到产品F；以每小时20℃的温度变化调整产品F的温度至20℃，pH至5.5～6.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为1:100，保存24h，得到产品G；将产品G干燥后得到巨大芽孢杆菌菌剂；
将尿素颗粒用复合肥专用三轴细碎机破碎为30～40目的尿素微粒。将尿素微粒、氯化铵、巨大芽孢杆菌菌剂按照质量比45:45:10混合均匀，经辊压机辊压成型为片状，降至常温；采用反击式造粒方式进行造粒得成品。
实施例2：
将洗净烘干后的新鲜铜藻和新鲜马尾藻按照质量比1:1复配，磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比6:100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A；并制备种子液：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，在35℃培养24小时；所述产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCC No.12156；产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5:100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为10:100，得到产品B；在温度为35℃，pH6.0～6.5的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为8天，得到产品C；调整产品C的pH至5.5～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品D；以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至35℃，pH至6.0～6.5，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为6:100，保存12h，得到产品E；调整产品E的pH至5.5～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品F；以每小时3℃的温度变化调整产品F的温度至35℃，pH至6.0～6.5，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为6:100，保存12h，得到产品G；将产品G干燥后得到巨大芽孢杆菌菌剂。
将尿素颗粒用复合肥专用三轴细碎机破碎为30～40目的尿素微粒。将尿素微粒、硫酸铵、巨大芽孢杆菌菌剂按照质量比45:45:10混合均匀，经辊压机辊压成型为片状，降至常温；采用反击式造粒方式进行造粒得成品。
对比例1：
不添加菌剂，海藻不通过发酵制备的产品
将洗净烘干后的新鲜鼠尾藻磨成50～60目粉末；将尿素颗粒用复合肥专用三轴细碎机破碎为30～40目的尿素微粒。将尿素微粒、氯化铵、磨好的海藻粉末按照质量比45:45:10混合均匀，经辊压机辊压成型为片状，降至常温；采用反击式造粒方式进行造粒得成品。
对比例2：
不添加菌剂和海藻的脲铵氮肥
将尿素颗粒用复合肥专用三轴细碎机破碎为30～40目的尿素微粒。将尿素微粒、氯化铵、按照质量比50:50混合均匀，经辊压机辊压成型为片状，降至常温；采用反击式造粒方式进行造粒得成品。
产品指标检测结果见表1。
表1：产品检测结果
结果表明：区别于传统的脲铵氮肥，本发明制备的产品中不仅含有很高含量的有效活菌，而且含有高含量的海藻提取物，包括海藻酸和褐藻寡糖。同时降低了缩二脲的含量。
将产品对春小麦做了相应的肥效对比实验。
实验方法：所有处理肥料均一次性施入，均匀撒于小区表面，深翻上下土 20cm左右，机械播种，出苗后重新确定小区位置。麦田的常规管理均同常规。化学除草、除虫、合理灌溉、保证充足水分，在P、K同一水平上进行比较。结果如表2所示。
表2：春小麦施肥对比实验结果
实验表明：使用实施1样品的春小麦，提高了农作物产量，实现了10%以上的增收，而且增强了农作物的抗寒性。可显著提高土壤中微生物的含量，有效调节土壤的pH值，降低了土壤容重，有效改良了土壤性能。
所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCC No.12156；保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分类命名为：Bacillus megaterium。
所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的生物特性如下：
纤维素培养基：羟甲基纤维素钠15g，硝酸铵1g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾2g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
液体发酵培养基：羟甲基纤维素钠10g，蛋白胨3g，酵母粉0.5g，硝酸铵2g，硫酸镁0.3g，磷酸二氢钾2g，氯化钙0.3g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.4。
YIC～BM1菌株在纤维素培养基平板上生长48h后，菌落圆形，白色，表面平整。显微镜观察菌株为革兰氏阳性，杆状，能运动，产芽孢。生长温度范围20～40℃，PH范围6-10，NaCl浓度范围0～20%，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH 7.5。触酶，氧化酶，半乳糖苷酶阳性，吲哚，VP实验阴性，不还原硝酸；能够利用葡萄糖，甘露糖，乳糖，棉子糖，蔗糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇，山梨醇。根据其生理生化特征，将该菌株鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。
图1看出，YIC～BM1菌株为革兰氏阳性菌；
图2看出，YIC～BM1菌株的亲缘关系与巨大芽孢杆菌最近；
图3看出，YIC～BM1菌株的最适产酶温度为35℃；
图4看出，YIC～BM1菌株的最佳产酶pH为6.0。

Claims (6)

1.一种含有巨大芽孢杆菌（拉丁文分类命名：Bacillus megaterium）的缓释增效褐藻脲铵氮肥的生产方法，其特征在于按照以下步骤进行：
先将尿素颗粒破碎为30～40目的尿素微粒，将尿素微粒、铵态氮肥、巨大芽孢杆菌菌剂按照质量比30～50:30～50:1～5混合均匀，经辊压机辊压成型为片状，降至常温后造粒；
所述铵态氮肥是氯化铵、硝铵磷、硫酸铵和碳酸氢铵中的一种或任意比例的两种以上；
所述巨大芽孢杆菌菌剂按照以下步骤制备而成：
1）、制备褐藻粉末：将烘干后的褐藻磨成粉末；
2）、制备产品A：褐藻粉末与水按照质量比1～10:100装入发酵罐中，在100～150℃条件下灭菌15～35min，得到产品A；
并制备种子液：将巨大芽孢杆菌接种至液体培养基，在25℃～40℃培养20～30小时；巨大芽孢杆菌与培养基之间的体积比为1～10:100；
3）、制备产品B：将种子液加入到产品A中得到产品B，其中种子液与产品A的质量比为1～10:100；
4）、制备产品C：在温度为25℃～40℃，pH5～9的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为6～10天，得到产品C；
5）、制备产品D：调整产品C的pH至5.0～6.0，温度至3～10℃，保存3h～72h，得到产品D；
6）、制备产品E：调整产品D的温度至25℃～40℃，pH至5～9，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为1～10:100，保存3h～72h，得到产品E；
7）、制备产品F：调整产品E的pH至5.0～6.0，温度至3～10℃，保存3h～72h，得到产品F；
8）、制备产品G：调整产品F的温度至25℃～40℃，pH至5～9，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为1～10:100，保存3h～72h，得到产品G；
9）、制备巨大芽孢杆菌菌剂：将产品G干燥成粉末得到巨大芽孢杆菌菌剂；
其中巨大芽孢杆菌，其保藏单位的简称为YIC～BM1，其保藏号为CGMCC No.12156。
2.如权利要求1所述的含有巨大芽孢杆菌的缓释增效褐藻脲铵氮肥的生产方法，其特征在于：所述液体培养基按照以下质量比配成：褐藻酸钠5份、硫酸铵5份、硫酸镁1份、磷酸氢二钾2份、硫酸亚铁0.01份、琼脂20份和蒸馏水1000份。
3.如权利要求1所述的含有巨大芽孢杆菌的缓释增效褐藻脲铵氮肥的生产方法，其特征在于：步骤2）所述褐藻粉末和水的质量比为4:100；灭菌温度115℃，灭菌时间25min；制备种子液时，巨大芽孢杆菌接种至液体培养基中，在30℃培养24小时，得到种子液，巨大芽孢杆菌和培养基的体积比例为5:100；步骤3）中，种子液与产品A的质量比为10:100；步骤5）和步骤7）中，温度为5℃，保存时间为12h。
4.如权利要求1所述的含有巨大芽孢杆菌的缓释增效褐藻脲铵氮肥的生产方法，其特征在于:步骤4）、步骤6）和步骤8）中，温度为30℃，pH为6.5～7.0；步骤4）发酵时间为8天；步骤6）和步骤8）保存时间为12h；步骤6）中补充的种子液与产品D的质量比以及步骤8）中补充的种子液与产品F的质量比均为5:100。
5.如权利要求1所述的含有巨大芽孢杆菌的缓释增效褐藻脲铵氮肥的生产方法，其特征在于：步骤5）、步骤6）步骤7）和步骤8）中，调整温度均为每小时调整3℃。
6.如权利要求1至5之任意一项所述的含有巨大芽孢杆菌的缓释增效褐藻脲铵氮肥的生产方法，其特征在于：所述褐藻是指鼠尾藻，铜藻和马尾藻中的一种或任意比例的两种以上。
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