CN106511577B - 一种抗菌毛白杨叶总黄酮的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌毛白杨叶总黄酮的制备方法，所述抗菌毛白杨叶总黄酮的制备方法包括以下步骤：首先称取3kg毛白杨叶，加70％乙醇回流提取3次，料液比为1∶10，合并提取液，减压干燥得粗提物；然后将粗提物溶解在1500ml的蒸馏水中，用101大孔吸附树脂进行吸附，水洗脱至无色；再用40％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味后定容至2000ml；最后溶液缓慢过聚酰胺层析柱，用蒸馏水洗至无色，再用90％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压蒸干得纯度为98％的毛白杨叶总黄酮。本发明采用101大孔吸附树脂联合聚酰胺层析技术进行黄酮部位富集，获得样品纯度高，方法简单实用。
Description
技术领域
本发明属于药学技术领域，尤其涉及一种抗菌毛白杨叶总黄酮的制备方法。
背景技术
毛白杨叶是一种民间草药，在民间和临床上用于治疗重度褥疮的骨髓炎，疗效显著。临床研究表明褥疮、骨髓炎会导致严重的感染，金黄色葡萄球菌是诱发感染的主要菌种。大量研究表明黄酮类广泛具有抗菌作用，毛白杨叶富含黄酮类成分，其可能是发挥抗菌药效的主要物质基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗金黄色葡萄球菌的毛白杨叶总黄酮的制备方法，旨在解决毛白杨叶抗菌药效部位不明确和粗提物治疗疾病质量不可控的问题。
本发明是这样实现的，一种抗菌毛白杨叶总黄酮的制备方法，所述抗菌毛白杨叶总黄酮的制备方法包括以下步骤：
首先称取3kg毛白杨叶，加70％乙醇回流提取3次，料液比为1∶10，合并提取液，减压干燥得粗提物；
然后将粗提物溶解在1500ml的蒸馏水中，用101大孔吸附树脂进行吸附，水洗脱至无色；再用40％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味后定容至2000ml；
最后溶液缓慢过聚酰胺层析柱，用蒸馏水洗至无色，再用90％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压蒸干得毛白杨叶总黄酮。
本发明的另一目的在于提供一种最小浓度为0.08mg/ml对金黄色葡萄球菌有抑制作用的抗菌毛白杨叶总黄酮。
本发明的另一目的在于提供一种最小浓度为1.2mg/ml对耐甲氧西林葡萄球菌有抑制作用的抗菌毛白杨叶总黄酮。
本发明提供的抗菌毛白杨叶总黄酮的制备方法，黄酮类化合物的结构有许多酚醛氢氧根，酚羟基可以选择性地吸附树脂从水和非水系统主要通过氢键相互作用，因此结合D101大孔树脂和聚酰胺树脂从原油中提取总黄酮类化合物浓缩的草药，由紫外光谱的总类黄酮含量为98％，用101大孔吸附树脂进行吸附低成本、高安全性、效率高、简单。本发明采用大孔树脂联合聚酰胺技术使毛白杨叶总黄酮的纯度达到98％。
附图说明
图1是本发明实施例提供的抗菌毛白杨叶总黄酮的制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例的抗菌毛白杨叶总黄酮的制备方法包括以下步骤：
S101：称取3kg毛白杨叶，加70％乙醇(料液比为1；10)回流提取3次，合并提取液，减压干燥得粗提物；
S102：将粗提物溶解在1500ml的蒸馏水中，用101大孔吸附树脂进行吸附，水洗脱至无色；再用40％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味后定容至2000ml；
S103：溶液缓慢过聚酰胺层析柱，用蒸馏水洗至无色，再用90％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压蒸干得毛白杨叶总黄酮。
通过以下的实验对本发明的应用效果作详细的说明：
1总黄酮抗菌活性研究
微量稀释法测定最小抑菌浓度
取金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作为实验菌株。
1)菌悬液的制备：
(1)菌液培养：取待测菌保存液10ul加入1ml LB液体培养基，置于37℃(MRSA为35℃)摇床过夜培养16h左右至对数期。
(2)OD600值测定：利用紫外分光光度仪测定OD值，LB液体培养基调整菌液浓度使其OD600值落在0.08-0.1之间，此时菌液浓度约为108CFU/ml。
(3)上样菌液稀释：将待测菌液在步骤(2)所得稀释倍数的基础上再稀释1000倍，此时菌液浓度约为105CFU/ml，此时菌液即为上样菌液。
2)抗菌药物制备：
参照NCCLS标准。用ddH2O作为药物的稀释液，药物浓度x mg/ml。溶解后用0.22um孔径的滤膜过滤。
3)药敏试验操作：
无菌96孔板第1-11列加入灭菌LB液体培养基100ul。
无菌96孔板第1列加入药物100ul(药物x mg/ml)，逐次倍比稀释至第11列。
无菌96孔板每一孔加入菌液100ul，终体积200ul(每菌株进行一次重复，即一株菌做两行，一块板可做四株菌)。
无菌96孔板第12列上4孔加200ul/孔灭菌LB液体培养基做阴性对照，下4孔加200ul菌液做阳性对照。
药液和菌液上样完毕后，盖好板盖，37℃温箱培养20h。
用酶标仪测定OD值，观察结果。
4)琼脂扩散法
(1)取菌株接种于LB琼脂平板，37℃(MRSA为35℃)培养16小时，然后挑取LB琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊，调整浊度至0.5麦氏单位。
(2)用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布整个LB琼脂培养基表面，保证涂均匀。
(3)待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用无菌镊子取无菌纸片贴在平板表面。用每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。在一张纸片上用加样枪加入低浓度药物、高浓度药物、生理盐水和阳性对照药敏纸片各40ul。
(4)孵育16小时后取出，手持培养皿于黑色背景上方约几英寸，无反光的黑色背景，采用反射光照明。用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录。结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。
2实验结果：
毛白杨叶提取物制备，采用大孔树脂结合聚酰胺柱层析制备得毛白杨叶总黄酮，紫外检测含量为98.0％。
抑菌作用
采用微量稀释法测定毛白杨叶总黄酮最小抑菌浓度(表1)，对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度分别为0.08mg/ml、1.2mg/ml。
表1
琼脂扩散法测定总黄酮对2种菌株的抑制(表2)，毛白杨叶总黄酮对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。
表2
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种抗菌毛白杨叶总黄酮的制备方法，其特征在于，所述抗菌毛白杨叶总黄酮的制备方法包括以下步骤：
首先称取3kg毛白杨叶，加70％乙醇回流提取3次，料液比为1∶10，合并提取液，减压干燥得粗提物；
然后将粗提物溶解在1500ml的蒸馏水中，用101大孔吸附树脂进行吸附，水洗脱至无色；再用40％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无醇味后定容至2000ml；
最后溶液缓慢过聚酰胺层析柱，用蒸馏水洗至无色，再用90％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压蒸干得毛白杨叶总黄酮；
采用大孔树脂结合聚酰胺柱层析制备得毛白杨叶总黄酮，紫外检测含量为98.0％；
所述抗菌毛白杨叶总黄酮的制备方法中，黄酮类化合物的结构有许多酚醛氢氧根，酚羟基可以选择性地吸附树脂从水和非水系统主要通过氢键相互作用，结合D101大孔树脂和聚酰胺树脂从原油中提取总黄酮类化合物浓缩的草药。
2.一种最小浓度为0.08mg/ml对金黄色葡萄球菌有抑制作用的抗菌毛白杨叶总黄酮。
3.一种最小浓度为1.2mg/ml对耐甲氧西林葡萄球菌有抑制作用的抗菌毛白杨叶总黄酮。
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