CN106508187A - 一种茄子耐冷性快速鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对茄子耐冷性快速鉴定的方法，利用低温处理种子发芽对茄子的耐冷性进行快速鉴定，测定低温条件下的种子发芽势、发芽率和发芽指数，并通过其综合隶属函数值进行种子耐冷性的快速鉴定。此外，活力指数能较客观地反映种子耐冷性。表明本发明可适于大量品种资源的初步筛选。利用低温对茄子叶中丙二醛(MDA)含量的影响进行验证,进一步说明低温发芽鉴定茄子的耐冷性是一种既简便又科学的方法,这为快速鉴定作物的耐冷性提供了一条简便、可靠的有效途径。耐冷性隶属函数值是用综合指标评定植物的耐冷性，其评定结果与实际更为接近。因而应用本发明可通过低温发芽综合隶属函数值简单、快捷、准确的鉴定茄子耐冷性。
Description
技术领域
本发明属于茄子抗逆性鉴定的技术领域，涉及到筛选茄子耐冷性的方法和耐冷性评价体系，具体是一种茄子耐冷性快速鉴定的方法。
背景技术
茄子(Solanum melongena L.)是世界十大蔬菜作物之一，在世界大多数地区都有栽培，尤其以亚洲、欧洲、非洲、北美洲等地区种植广泛。中国是世界上最大的茄子生产国，也是茄子的次生起源中心，其栽培面积约占世界的50％。2013年，我国茄子的种植面积为80.1万公顷，总产量达到2845.58万吨。茄子营养价值高，维生素和矿物质丰富，特别是维生素E、P以及铁元素的含量较高。此外，茄子含有多种生物碱，具有广泛的药用价值。
随着茄子早春栽培面积的增加，生产上要求茄子幼苗具有极强的抗寒性，秋延后栽培也需要抗寒性强的种质，生产上急需耐冷品种。目前，国内关于茄子品种或材料耐冷性鉴定的研究多集中在生理指标测定方面，而对于快速鉴定指标与方法的研究鲜有报道。因此，开展茄子品种资源耐冷性快速鉴定研究，对大量品种资源的筛选及茄子的耐冷育种具有重要意义。所以，本发明针对茄子材料的发芽率、发芽势和发芽指数等指标进行茄子品种耐冷性鉴定，以探索茄子的耐冷性鉴定的快速方法，为茄子耐冷育种提供参考。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种简单、快捷、准确的茄子耐冷性鉴定方法，该法可真实有效地鉴定茄子资源的耐冷性，有利于加速茄子耐冷育种。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：测定低温条件下的种子发芽率、发芽势和发芽指数，对其做综合隶属函数值分析，同时活力指数、下胚轴伸长速率和茄子叶MDA含量可进行分析验证。
低温条件下的种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数和下胚轴伸长速率分别是置于18℃人工气候箱中，对照组置于25℃人工气候箱中，在黑暗中发芽。茄子叶MDA含量测定将3片真叶茄子分别进行5℃低温和22～25℃室温处理。
本发明涉及一种茄子耐冷性快速鉴定的方法，包括以下步骤：
步骤一：温汤浸种后对种子进行18℃低温和25℃常温发芽处理；
步骤二：测定18℃和25℃发芽处理条件下各品种种子发芽率、发芽势和发芽指数；
步骤三：单一指标与综合指标的鉴定
通过步骤二测定的各品种茄子发芽率、发芽势和发芽指数来计算相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数，
相对发芽率＝18℃发芽率/25℃发芽率
相对发芽势＝18℃发芽势/25℃发芽势
相对发芽指数＝18℃发芽指数/25℃发芽指数
并用公式(1)分别计算各品种的相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数三者的耐冷隶属函数值Xij，每个品种的3种耐冷隶属函数值累加可得该品种的综合隶属函数数值，利用综合隶属函数值比较不同茄子品种之间的耐冷性，若综合隶属函数值越高，则表明茄子耐冷性越强；所述耐冷隶属函数值Xij用模糊数学隶属函数值方法，计算公式为：
公式:
表示第i种的第j指标的耐冷隶属函数值，Xij表示第i种的第j指标的数值，Xjmax表示j指标的最大数值，Xjmin表示j指标的最小数值。所述的指标是指相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数等。
步骤一中，具体操作如下：茄子种子采用常规55℃温汤浸种，再用1％次氯酸钠消毒5min，最后冲洗洁净。用沙布包好，将其放在30℃左右的温水中浸泡8h，浸泡结束后再洗净置于空气中4h，注意与空气充分接触。准备好培养皿，在其中放好两层滤纸。将每个培养皿中加入少量的水，把茄子种子均匀地放入，再将培养皿盖上盖，分别置于18℃、25℃人工气候箱中，使其在黑暗中发芽。
步骤二中，观察供试材料的发芽情况，每日记录发芽数量，统计发芽材料的胚根、胚轴长度。采用的标准是胚根的长度超过种子长度的一半，即胚根伸长约为0.5mm。对照温度设为25℃，在实验进行的第10天对发芽势进行统计，第18天对发芽率进行统计。并计算出相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数。计算公式分别为：
发芽势(％)＝10d内正常发芽种子数/供试种子数×100％
发芽率(％)＝发芽终期全部正常发芽种子数/供试种子数×100％
发芽指数(GI)＝∑Gt/Dt式中:Gt为浸种后t日的发芽数，Dt为相应的发芽日数。
相对发芽率＝18℃发芽率/25℃发芽率
相对发芽势＝18℃发芽势/25℃发芽势
相对发芽指数＝18℃发芽指数/25℃发芽指数
步骤三中，利用综合隶属函数值可以比较茄子材料的耐冷性。通过利用公式计算相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数的隶属函数值，可以对茄子耐冷性进行量化分析。利用隶属函数值公式并对单一隶属函数值进行累加计算综合隶属函数值，数学公式综合隶属函数值可以定量比较茄子的耐冷性，更具有说服力。
对本发明的结果可进行活力指数、下胚轴伸长速率和茄子叶MDA含量的耐冷性分析验证：
当茄子幼苗长出3片真叶时，拔除长势较弱的植株，进行低温处理，分别进行5℃低温和22～25℃室温处理，待茄子幼苗长至4叶1心的时候，利用硫代巴比妥酸(TBA)反应法进行MDA提取与测定。
将4叶1心的茄子幼苗移到室内，把各植株的第2、3、4叶剪下来，注意从上往下剪，剪好后分别用自来水、蒸馏水冲洗干净后放入30℃的人工气候箱中，晒干幼苗表面的水分。剪取叶片，称取1g，加入2ml10％的TCA和少量石英砂，混合研磨至匀浆后再加入8mlTCA继续研磨，匀浆后放于离心机内，以4000r·min-1的速度离心10min，量取上清液2ml后加样品提取液(对照试验中加2ml的蒸馏水)，再加入2ml 0.6％TBA溶液，混合均匀后放在沸水浴上加热，加热15min，待其迅速冷却后进行新一次的离心，最后吸取上清液分别测定532、600和450nm波长下的吸光度。
针对茄子育种材料耐冷性鉴定存在的局限性，发明人建立了一种茄子耐冷性快速鉴定的方法，测定低温条件下的种子发芽势、发芽率和发芽指数，并通过其综合隶属函数值进行种子耐冷性的快速鉴定。该法通过精确的数字手段处理模糊的函数值，并作出科学、合理和准确的量化评价。同时，通过活力指数、下胚轴伸长速率和MDA含量来提高耐冷性鉴定的准确性和可靠性。因而应用本发明可通过低温发芽综合隶属函数值简单、快捷、准确的鉴定茄子耐冷性。
附图说明
图1是发芽的平均隶属函数值。
图2是下胚轴伸长速率比值。
图3是对照组和低温处理组茄子叶MDA含量。
图4是MDA含量增加率。
具体实施方式
下面结合具体方案实施例，进一步阐述本发明的步骤与快速鉴定方法。
实施例
1.供试材料
供试茄子材料由扬州大学园艺与植物保护学院提供，试验选取5个品种：黑马墨茄、苏州牛角茄、二苠茄、洛阳早青茄、安阳紫冠茄。并设置多个重复。
2.试验方法
(1)测定发芽率、发芽势与发芽指数，活力指数与下胚轴伸长速率
采用55℃温汤浸种，再用1％次氯酸钠消毒5min，最后冲洗洁净。用沙布包好，将其放在30℃左右的温水中浸泡8h，浸泡结束后再洗净置于空气中4h，注意与空气充分接触。准备好培养皿，在其中放好两层滤纸。将培养皿中加入少量的水，把茄子种子均匀地放入，再将培养皿盖上盖，分别置于18℃、25℃人工气候箱中，使其在黑暗中发芽。在实验进行的第10天对发芽势进行统计，第18天对发芽率进行统计。其中计算公式分别为：
发芽势(％)＝10d内正常发芽种子数/供试种子数×100％
发芽率(％)＝发芽终期全部正常发芽种子数/供试种子数×100％
发芽指数(GI)＝∑Gt/Dt式中:Gt为浸种后t日的发芽数，Dt为相应的发芽日数。
活力指数(GRI)＝发芽率×胚根长度
胚轴伸长速率(PAR)＝胚轴长度/天数
(2)MDA含量的测定
将4叶1心的茄子幼苗的第2、3、4叶剪下来，注意从上往下剪，剪好后分别用自来水、蒸馏水冲洗干净后放入30℃的人工气候箱中，晒干幼苗表面的水分。剪取叶片，称取1g，加入2ml10％的TCA和少量石英砂，混合研磨至匀浆后再加入8mlTCA继续研磨，匀浆后放于离心机内，以4000r·min-1的速度离心10min，量取上清液2ml后加样品提取液(对照试验中加2ml的蒸馏水)，再加入2ml 0.6％TBA溶液，混合均匀后放在沸水浴上加热，加热15min，待其迅速冷却后进行新一次的离心，最后吸取上清液分别测定532、600和450nm波长下的吸光度。计算公式为：
丙二醛浓度＝6.45*(OD532-OD600)-0.56*OD450
丙二醛质量＝丙二醛浓度*3/样品鲜重(g)
3.试验结果
(1)综合隶属函数值分析
18℃和25℃两种温度下的发芽势和发芽指数在茄子品种间表现出很大的差异，同一品种不同温度间也是如此，说明18℃是一个适合区分茄子不同品种抗寒性的适宜温度，利用这个温度下测量的发芽势和发芽指数可以代表该品种茄子抗寒性的大小。同时，这两种温度下，茄子发芽率没有表现出很大差异，说明对于茄子来说，在这两种温度条件下都能正常生长，是茄子种子发芽的有效温度，18℃是适合耐冷性鉴定的发芽温度。
总体来看，发芽指数比发芽势下降的幅度较大，说明可将茄子发芽指数作为其耐冷指标。不同茄子品种的发芽指数与对照相比，降低的幅度越大，说明低温处理对其影响也越大，也就是该种茄子的耐低温性越弱。
相对发芽率、相对发芽指数和发芽势在比较不同品种的发芽情况的时候更准确，所以利用18℃和25℃下相对发芽率、相对发芽指数和相对发芽势构建一个综合活力指标，三者隶属函数平均值代表种子活力及其生活力大小。从图1可以得出不同茄子之间的综合隶属函数值存在明显差异，在低温条件下，这个值可以较准确的反映茄子种子发芽的速率和幼苗的长势，以此来鉴定供试茄子品种的耐冷性强弱。平均隶属函数值越大，表明低温胁迫后该茄子品种的胁迫变化较小，即耐冷性更强，反之亦然。由表1可知5种茄子的综合隶属函数值，图1客观显示出5种茄子材料耐冷性的大小顺序为：洛阳早青茄、二苠茄、安阳紫冠茄、黑马墨茄、苏州牛角茄。
表1茄子种子发芽参数及其相对值隶属函数值
Table1 Germination indexes and relative integrate subjection value ofeggplant
(2)活力指数、下胚轴伸长速率分析
由表2可知，在25℃条件下，5种茄子品种间的活力指数差异不明显，与茄子的耐冷性相关不显著；18℃条件下，品种间种子活力指数的差异较明显，但耐冷性强的品种下降幅度小于耐冷性弱的品种。同时，幼苗下胚轴伸长速率的比值越大的品种，表明该茄子品种幼苗耐低温能力越强。因此，利用图2显示茄子在25℃和18℃下的下胚轴伸长速率比值，通过比值可以相对表明茄子耐冷性强弱，由图2可知耐冷性由强到弱的的顺序是：洛阳早青茄，二苠茄，安阳紫冠，黑马墨茄，苏州牛角。与综合隶属函数值的分析相一致。
表2不同温度处理下茄子种子活力指数及下胚轴伸长的比值
Table2 Relative vigor indexes and the rates of hypocotyls of eggplantunder different temperature
(3)MDA含量与耐冷性分析
植物细胞膜的破坏是因为植物体内发生了脂质过氧化作用，当发生脂质过氧化作用时，其细胞中产生的超氧物自由基诱导膜质中的不饱和脂肪酸，从而造成细胞膜受损伤。丙二醛(MDA)正是膜脂过氧化过程中的分解产物，叶片中MDA的含量可用来表示细胞膜损伤程度的大小。对表3中的数据进行作图与计算，可以从图3和图4中客观反应茄子在18℃和25℃下的MDA含量情况，从图3、4可知，在低温胁迫下，茄子叶片MDA含量明显增加，增加5.73％至182.84％。而且品种间的差异显著。洛阳早青茄较小，耐冷性较强。
表3低温处理对茄子叶片中MDA含量的影响
Table3 Effect of low temperature stress on MDA contents in leaves ofeggplant
综上所述，本发明建立的一种茄子耐冷性快速鉴定的方法，耐冷性隶属函数值是用几个指标综合评定植物的耐冷性，可以弥补使用单个指标鉴定的局限性，而且相对发芽率、相对发芽指数和发芽势在比较不同品种的发芽情况的时候更准确，活力指数和MDA含量也验证了综合隶属函数值的准确性，所以它的评价更为确切，方案实施过程中操作简单易行，所以说综合隶属函数值是最简单、快捷、准确的鉴定抗冷性的方法和指标。
以上就是对本发明具体实施例的详细描述，上述评价结果与供试材料实际观察相一致，可见，本发明适用于茄子耐冷性快速鉴定的方法。
Claims (4)
1.一种茄子耐冷性快速鉴定方法，其特征在于：测定低温条件的种子发芽率、发芽势和发芽指数，并对其做综合隶属函数值，通过比较综合隶属函数值快速鉴定茄子耐冷性。
2.如权利要求1所述的一种茄子耐冷性快速鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：温汤浸种后对种子进行18℃低温和25℃常温发芽处理；
步骤二：测定18℃和25℃发芽处理条件下各品种种子发芽率、发芽势和发芽指数；
步骤三：单一指标与综合指标的鉴定；
通过步骤二测定的各品种茄子发芽率、发芽势和发芽指数来计算相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数，
相对发芽率＝18℃发芽率/25℃发芽率
相对发芽势＝18℃发芽势/25℃发芽势
相对发芽指数＝18℃发芽指数/25℃发芽指数
并用公式(1)计算相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数三者的耐冷隶属函数值，每个品种的3种耐冷隶属函数值累加可得该品种的综合隶属函数数值，利用综合隶属函数值比较不同茄子材料之间的耐冷性，若综合隶属函数值越高，则表明茄子耐冷性越强；所述耐冷隶属函数值Xij用模糊数学隶属函数值方法，计算公式为：
公式:
表示第i种的第j指标的耐冷隶属函数值，Xij表示第i种的第j指标的数值，Xjmax表示j指标的最大数值，Xjmin表示j指标的最小数值。
3.如权利要求2所述的一种茄子耐冷性快速鉴定的方法，其特征在于步骤一中，所述操作如下：筛选茄子种子，采用常规催芽方法，先用55℃温汤浸种，再用1％次氯酸钠消毒5min，最后冲洗洁净。用沙布包好，将其放在30℃左右的温水中浸泡8h，浸泡结束后再洗净置于空气中4h，注意与空气充分接触。准备好培养皿，在其中放好两层滤纸；将培养皿中加入少量的水，把茄子种子均匀地放入，再将培养皿盖上盖，分别置于18℃、25℃人工气候箱中，使其在黑暗中发芽。
4.如权利要求2所述的一种茄子耐冷性快速鉴定的方法，其特征在于步骤二中，观察供试材料的发芽情况，每日记录发芽数量，统计发芽材料的胚根、胚轴长度；在实验进行的第10天对发芽势进行统计，第18天对发芽率进行统计。
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