CN106497993B - 还原型辅酶q10及化妆品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种还原型辅酶Q10及化妆品，所述还原型辅酶Q10由人的细胞系或细胞株作为生产还原型辅酶Q10的母本，通过在生物培养剂DMEM培养液中进行细胞培养，获得含有大量还原型辅酶Q10的细胞液后进行加酸液处理、离心分离、喷雾干燥、有机溶剂萃取浓缩、冷却结晶得到。本发明还原型辅酶Q10，与现在已公开的还原型辅酶Q10相比较，制备过程中不添加碱性物质，性质稳定，不会被空气的氧氧化；既没有还原剂的残留物，也没有任何抗氧化剂，保护剂等化学残留，是一种高品质的还原型辅酶Q10；能用于食品，药品，化妆品，或者可用于针剂，输液之用，对人体没有免疫原性反应。

Description

还原型辅酶Q10及化妆品
技术领域
本发明涉及一种还原型辅酶Q10，尤其涉及一种还原型辅酶Q10及化妆品。
背景技术
辅酶Q10自上世纪中期被科学家发现、并确认其化学结构以来，它在人体生理和生命过程中的重要作用也日渐被我们所认识。
辅酶Q10又名泛醌10，是一种脂溶性醌，在室温下是橙黄色结晶物，熔点48℃，无臭无味，其结构类似于维生素K，因其母核六位上的侧链(聚异戊二烯基的聚合度为10而得名)是一种醌类化合物。它的另一种形式为还原型辅酶，生理功能主要来源于醌基的氧化还原特性和类异戊二烯侧链的物理特性。
随着人类对生命科学研究的日益深入，自Harman于1956年提出了衰老的自由基学说以来，越来越多的实验资料从不同方面证实了自由基氧化损伤生物大分子是造成机体衰老和多种老年性疾病发生的原因。而用抗氧化剂能够有效地清除自由基，具有延缓衰老的功能。
上世纪80年代初，瑞典Ernster揭示出类维生素物质辅酶Q10的抗氧化作用和自由基清除作用。1972年Harman阐述了线粒体的功能与衰老的关系，最新关于线粒体衰老在机体衰老过程作用的报告认为：氧自由基对线粒体DNA的损伤程度较对核DNA高16倍。其原因可能与线粒体基质中DNA更易接近内源性氧自由基，并且线粒体内DNA修复机制远不如核DNA。因此推论，随着年龄的增长线粒体DNA内亚单位受自由基损伤增大。
在人的肌体内93％是还原型辅酶Q10，7％是氧化型辅酶Q10，起上述2个主要作用的辅酶Q10是属于还原型辅酶Q10。所以生产还原型辅酶Q10是对人体有直接的积极意义，特别是天然的还原型辅酶Q10。但是，由于还原型辅酶Q10容易被分子氧氧化，目前还未见具有工业规模生产还原型辅酶Q10技术方面的报道。
此外，由于还原型辅酶Q10是氧化型辅酶Q10的二电子还原体，因此在目前公诸于世的众多涉及还原型氧辅酶Q10制作技术中，都是通过用还原剂将氧化型辅酶Q10作为原料，还原生成还原型辅酶Q10。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种还原型辅酶Q10。
本发明的解决的技术问题之二是提供一种应用还原型辅酶Q10制备的化妆品。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种还原型辅酶Q10，由人的细胞系或细胞株作为生产还原型辅酶Q10的母本，通过在生物培养剂DMEM培养液中进行细胞培养，获得含有大量还原型辅酶Q10的细胞液后进行加酸液处理、离心分离、喷雾干燥、有机溶剂萃取浓缩、冷却结晶得到。
优选地，所述的酸液为酸的水溶液，其中酸的摩尔浓度为0.1-1mol/L。
优选地，所述的酸为L-抗坏血酸、柠檬酸、L-苹果酸中一种或多种的混合物。
更优选地，所述的酸由L-抗坏血酸、柠檬酸、L-苹果酸混合而成，所述L-抗坏血酸、柠檬酸、L-苹果酸的摩尔比为(1-3)：(1-3)：(1-3)。
优选地，所述的有机溶剂为2,3-丁二醇、乙二醇、1,2-丁二醇中一种或多种的混合物。
更优选地，所述的有机溶剂由2,3-丁二醇、乙二醇、1,2-丁二醇混合而成，所述2,3-丁二醇、乙二醇、1,2-丁二醇的质量比为(1-3)：(1-3)：(1-3)。
优选地，所述的酸液体积为细胞液体积的0.5-5％。
优选地，所述的有机溶剂体积为细胞液体积的45-95％。
所采用的人的细胞系或细胞株为：肺部细胞系、肝部细胞系、肾部细胞系、胃肠部细胞系、真皮细胞系、尿道细胞系、生殖细胞系、淋巴细胞系、骨细胞系、骨骼肌细胞系、脐带细胞系、间叶干细胞系、内皮细胞系中的任一种。
本发明还提供了一种应用上述还原型辅酶Q10制备的化妆品，所述还原型辅酶Q10直接加入到化妆品中，其加入量为化妆品组成物总量的0.01-15wt％。
所述的化妆品包括具有清洁、护肤、营养、美容功能常用化妆品；其中清洁类化妆品包括皂类洗涤剂、液体洗涤剂、清洁霜，尤其指香皂、透明皂、清洁奶液、泡沫液；所述的护肤类包括膏霜类和脂类，尤其是指雪花霜、护肤霜、奶液、防水霜、防晒霜、精华乳；所述的营养类是指人参霜、珍珠霜、银耳霜、灵芝霜、雀斑霜、粉刺霜。
具体的，在本发明中：
L-抗坏血酸，CAS号：50-81-7。
柠檬酸，CAS号：77-92-9。
L-苹果酸，CAS号：97-67-6。
2,3-丁二醇，CAS号：123513-85-9。
乙二醇，CAS号：107-21-1。
1,2-丁二醇，CAS号：584-03-2。
本发明还原型辅酶Q10，与现在已公开的还原型辅酶Q10相比较，制备过程中不添加碱性物质，性质稳定，不会被空气的氧氧化；既没有还原剂的残留物，也没有任何抗氧化剂，保护剂等化学残留，是一种高品质的还原型辅酶Q10；能用于食品，药品，化妆品，或者可用于针剂，输液之用，对人体没有免疫原性反应。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
还原型辅酶Q10制备：
(1)选用人体肝細胞系Fa2N-4(ATCC-5566)作为生产还原型辅酶Q10的母本材料。
(2)取2.2L DMEM培养液(采用友康恒业生物科技(北京)有限公司提供的货号为CM0103的DMEM(高糖)含L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠细胞培养液)在121℃下灭菌10分钟，加入占培养液体积10％的生产还原型辅酶Q10的人体肝細胞系Fa2N-4(ATCC-5566)，在温度为37℃，CO2体积分数为5％的环境下，搅拌转数为300转/分条件下培养48小时，得到细胞液。
(3)向培养液中加入30mL酸液搅拌混合均匀，使用Mulitibeads shocker B300振荡，搅拌1小时，使细胞体破碎，然后在3000转/分下离心分离10分钟，收集得到含细胞湿物体，用去离子水洗涤3次后得到196g洗净细胞体。
(4)在洗净细胞体中加入25g的去离子水使之成为浆状，通过喷雾干燥机(采用上海桂戈实业有限公司提供的型号为GG-6000Y的喷雾干燥机)在温度为60℃，蒸发水量为1600mL/h的条件下喷雾干燥处理后获得干燥的细胞体。
(5)向干燥的细胞体中加入有机溶剂1000mL，在50℃下以转速300转/分搅拌30分钟后，在3000转/分下离心分离10分钟，除去有机溶剂相；再次加入有机溶剂500mL，在50℃下以转速300转/分搅拌30分钟后，过滤(采用南京聚康医药化工有限公司提供的型号为FPV403000的1000mL真空式过滤器，PVDF聚偏氟乙烯膜，膜孔径为0.45μm)，得到提取液。
(6)将提取液由常温24℃开始降温，降温速率为2℃/h(即1小时降温2℃)，降温10小时至4℃，使还原型辅酶Q10析出，将上层有机溶剂倒去，得到还原型辅酶Q10的湿结晶，再在温度为35℃、压力为10mmHg的条件下减压干燥6小时。得到实施例1的还原型辅酶Q10。
所述的酸液为酸的去离子水溶液，其中酸的摩尔浓度为0.24mol/L。将酸加入去离子水中混合均匀即得酸液。
所述的酸由L-抗坏血酸、柠檬酸、L-苹果酸按摩尔比为1：1：1混合均匀得到(即酸液中L-抗坏血酸、柠檬酸、L-苹果酸的摩尔浓度均为0.08mol/L)。
所述的有机溶剂由2,3-丁二醇、乙二醇、1,2-丁二醇按质量比为1：1：1混合均匀得到。
实施例2
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述的酸由柠檬酸、L-苹果酸按摩尔比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例2的还原型辅酶Q10。
实施例3
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述的酸由L-抗坏血酸、L-苹果酸按摩尔比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例3的还原型辅酶Q10。
实施例4
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述的酸由L-抗坏血酸、柠檬酸按摩尔比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例4的还原型辅酶Q10。
实施例5
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述的有机溶剂由乙二醇、1,2-丁二醇按质量比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例5的还原型辅酶Q10。
实施例6
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述的有机溶剂由2,3-丁二醇、1,2-丁二醇按质量比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例6的还原型辅酶Q10。
实施例7
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述的有机溶剂由2,3-丁二醇、乙二醇按质量比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例7的还原型辅酶Q10。
实施例8(弹力乳霜)
还原型辅酶Q10：9.0g
人血清蛋白：0.3g
水溶性维生素E：50g
甘油：10g
橄榄油：5g
水：25.7g
制备方法：将上述各个组分加入高压匀质机中，匀质化2小时后，得到弹力乳霜。该乳霜中含有的还原型辅酶Q10可以增加肌肤的保湿度，减缓胶原蛋白的流失，让肌肤明亮度增加，改善细纹的状况，使肌肤更有弹性，减缓胶原蛋白流失，增加肌肤弹性，延缓老化，增加肌肤明亮度，保湿。
实施例9(活力营养水)
还原型辅酶Q10：7.9g
PEG-30氢化蓖麻油(PEG-30Hydrogenated castor oil)：2.1g
还原型谷光苷肽：12g
甘油：12g
乙醇：6.2g
水：59.8g
制备方法：将上述各个含量组分加入匀质机中48溶解；在匀质机中高压均质。室温静止。取水相即得呈透明状态、含有还原型辅酶Q10的活力营养水。这种含还原型辅酶Q10的活力营养水以清新水质，为肌肤提供清新，水质的营养能量。其中的还原型辅酶Q10成分能帮助细胞内的糖分、脂肪等营养物质燃烧，产生能量，令细胞倍添活力。新功效：直接为皮肤细胞注入再生能量，抗氧化，增弹性，促进毛孔紧致复原。
测试例1
将实施例1-7制备的还原型辅酶Q10进行称量。各实施例得到的还原型辅酶Q10重量见表1。
表1：还原型辅酶Q10重量表
Figure BDA0001109503420000061
Figure BDA0001109503420000071
比较实施例1与实施例2-4，实施例1(L-抗坏血酸、柠檬酸、L-苹果酸复配)还原型辅酶Q10产量明显优于实施例2-4(L-抗坏血酸、柠檬酸、L-苹果酸中任意二者复配)；比较实施例1与实施例5-7，实施例1(2,3-丁二醇、乙二醇、1,2-丁二醇复配)还原型辅酶Q10产量明显优于实施例5-7(2,3-丁二醇、乙二醇、1,2-丁二醇中任意二者复配)。
测试例2：
将实施例1-7制备的还原型辅酶Q10的纯度进行测试，采用高效液相色谱法，Waters2695高效液相色谱仪，色谱柱：SYMMETRY C18(Waters制)，250mm(长度)，4.6mm(内径)、流动相：C2H5OH：CH3OH＝4：3(v：v)、检测波长：210nm、流速：1mL/min、还原型辅酶Q10的保留时间：9.1min。实验结果见表2。
表2：纯度测试结果表
纯度，％
实施例1 99.95
实施例2 99.53
实施例3 99.61
实施例4 99.58
实施例5 99.71
实施例6 99.64
实施例7 99.67
比较实施例1与实施例2-4，实施例1(L-抗坏血酸、柠檬酸、L-苹果酸复配)纯度明显优于实施例2-4(L-抗坏血酸、柠檬酸、L-苹果酸中任意二者复配)；比较实施例1与实施例5-7，实施例1(2,3-丁二醇、乙二醇、1,2-丁二醇复配)纯度明显优于实施例5-7(2,3-丁二醇、乙二醇、1,2-丁二醇中任意二者复配)。

Claims (1)

1.一种还原型辅酶Q10的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选用人体肝细胞系Fa2N-4作为生产还原型辅酶Q10的母本材料；
(2)取2.2L DMEM培养液在121℃下灭菌10分钟，加入占培养液体积10％的生产还原型辅酶Q10的人体肝细胞系Fa2N-4，在温度为37℃，CO2体积分数为5％的环境下，搅拌转数为300转/分条件下培养48小时，得到细胞液；
(3)向培养液中加入30mL酸液搅拌混合均匀，然后在3000转/分下离心分离10分钟，收集得到含细胞湿物体，用去离子水洗涤3次后得到198g洗净细胞体；
(4)在洗净细胞体中加入25g的去离子水使之成为浆状，通过喷雾干燥机在温度为60℃，蒸发水量为1600mL/h的条件下喷雾干燥处理后获得干燥的细胞体；
(5)向干燥的细胞体中加入有机溶剂1000mL，在50℃下以转速300转/分搅拌30分钟后，在3000转/分下离心分离10分钟，除去有机溶剂相；再次加入有机溶剂500mL，在50℃下以转速300转/分搅拌30分钟后，过滤，得到提取液；
(6)将提取液由常温24℃开始降温，降温速率为2℃/h，降温10小时至4℃，使还原型辅酶Q10析出，将上层有机溶剂倒去，得到还原型辅酶Q10的湿结晶，再在温度为35℃、压力为10mmHg的条件下减压干燥6小时，得到所述还原型辅酶Q10；
所述的酸液为酸的去离子水溶液，其中酸的摩尔浓度为0.24mol/L，将酸加入去离子水中混合均匀即得酸液；
所述的酸由L-抗坏血酸、柠檬酸、L-苹果酸按摩尔比为1：1：1混合均匀得到；
所述的有机溶剂由2,3-丁二醇、乙二醇、1,2-丁二醇按质量比为1：1：1混合均匀得到。
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