CN106483222A - 一种食物中四环素类含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食物中四环素类含量的检测方法,包括如下步骤:(1)25~150nM适配子探针与四环素类抗生素充分混合得到样品,将样品超声振荡提取,再用固相萃取小柱处理,10~40℃反应25~35min后,加入25~150nM DNA引物,并在37℃反应10~60min;加入100~300nM环状DNA模板,25~40℃反应0.5~2h,分别加入2~10U/μLPhi29 DNA聚合酶。本发明食物中四环素类含量的检测方法大大简化了检测步骤,降低了操作难度。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法,具体是一种食物中四环素类含量的检测方法。
背景技术
四环素类药物(TCs)具有广谱高效的杀菌抗生功效,可以与大多数药物或饲料添加剂混用,已被广泛应用于畜禽生产中。但过量使用不可避免的造成了严重的药物残留,成为严重危害人类健康的食品安全隐患之一。为此世界各国对TCs残留的检测十分关注。欧盟第675/92号令中初步规定在肌肉及牛奶中的四环素类化合物的总量不得超过100μg/kg,在肾脏、肝脏及鸡蛋中分别不得超过600μg/kg、300μg/kg及200μg/kg。日本肯定列表制度规定奶和鸡蛋中四环素类化合物的总量分别不得超过100ng/mL和400ng/mg。已报道的四环素类药物残留的检测方法有微生物法、薄层色谱法、高效液相测定法、高效液相色谱-串联质谱法、毛细管电泳、电化学分析、化学发光、酶联免疫法、胶体金免疫法等,仪器检测方法对待测样品的前处理要求高,操作繁琐,需要精密仪器设备。免疫学方法具有快速、灵敏、特异性高等特点,是四环素类药物残留检测的有效方法之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食物中四环素类含量的检测方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种食物中四环素类含量的检测方法,包括如下步骤:(1)25~150nM适配子探针与四环素类抗生素充分混合得到样品,将样品超声振荡提取,再用固相萃取小柱处理,10~40℃反应25~35min后,加入25~150nM DNA引物,并在37℃反应10~60min;加入100~300nM环状DNA模板,25~40℃反应0.5~2h,分别加入2~10U/μLPhi29 DNA聚合酶,0.25~1mMdNTPs在25~40℃反应5h,水浴加热到60~70℃保温10~20min,终止反应;(2)20~200nM染料标记的DNA探针与2~20µg/mL石墨烯混合反应10~60min,4℃保存备用;(3)取步骤(1)滚环扩增产物与步骤(2)制备的20~200nM石墨烯基分子信标混合,体积比1:5~12,室温下测定体系中标记染料的荧光强度随时间变化曲线,测定体系中染料的荧光强度时间变化曲线,根据标准曲线外标法检测样品中四环素类抗生素的含量。
作为本发明进一步的方案:所述超声振荡提取时先使用缓冲溶液将所述样品混匀,超声后再振荡提取,离心分离,然后将上清液转入固相萃取小柱处理。
作为本发明进一步的方案:所述的固相萃取小柱是用等体积的甲醇、水和缓冲溶液平衡的固相萃取小柱。
作为本发明再进一步的方案:所述标准曲线是用不同浓度的所述样品分别配制为标准溶液,用液相色谱-串联质谱法检测其色谱峰面积,相对于浓度绘制而得的标准曲线。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明食物中四环素类含量的检测方法大大简化了检测步骤,降低了操作难度。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中,一种食物中四环素类含量的检测方法,包括如下步骤:(1)25~150nM适配子探针与四环素类抗生素充分混合得到样品,将样品超声振荡提取,再用固相萃取小柱处理,10~40℃反应25~35min后,加入25~150nM DNA引物,并在37℃反应10~60min;加入100~300nM环状DNA模板,25~40℃反应0.5~2h,分别加入2~10U/μLPhi29 DNA聚合酶,0.25~1mMdNTPs在25~40℃反应5h,水浴加热到60~70℃保温10~20min,终止反应;(2)20~200nM染料标记的DNA探针与2~20µg/mL石墨烯混合反应10~60min,4℃保存备用;(3)取步骤(1)滚环扩增产物与步骤(2)制备的20~200nM石墨烯基分子信标混合,体积比1:5~12,室温下测定体系中标记染料的荧光强度随时间变化曲线,测定体系中染料的荧光强度时间变化曲线,根据标准曲线外标法检测样品中四环素类抗生素的含量。所述超声振荡提取时先使用缓冲溶液将所述样品混匀,超声后再振荡提取,离心分离,然后将上清液转入固相萃取小柱处理。所述的固相萃取小柱是用等体积的甲醇、水和缓冲溶液平衡的固相萃取小柱。所述标准曲线是用不同浓度的所述样品分别配制为标准溶液,用液相色谱-串联质谱法检测其色谱峰面积,相对于浓度绘制而得的标准曲线。
实施例1:
本发明食物中四环素类含量的检测方法,包括如下步骤:(1)25nM适配子探针与四环素类抗生素充分混合得到样品,将样品超声振荡提取,再用固相萃取小柱处理,10℃反应25min后,加入25nM DNA引物,并在37℃反应10min;加入100nM环状DNA模板,25℃反应0.5h,分别加入2U/μLPhi29 DNA聚合酶,0.25mMdNTPs在25℃反应5h,水浴加热到60℃保温10min,终止反应;(2)20nM染料标记的DNA探针与2µg/mL石墨烯混合反应10min,4℃保存备用;(3)取步骤(1)滚环扩增产物与步骤(2)制备的20nM石墨烯基分子信标混合,体积比1:5,室温下测定体系中标记染料的荧光强度随时间变化曲线,测定体系中染料的荧光强度时间变化曲线,根据标准曲线外标法检测样品中四环素类抗生素的含量。所述超声振荡提取时先使用缓冲溶液将所述样品混匀,超声后再振荡提取,离心分离,然后将上清液转入固相萃取小柱处理。所述的固相萃取小柱是用等体积的甲醇、水和缓冲溶液平衡的固相萃取小柱。所述标准曲线是用不同浓度的所述样品分别配制为标准溶液,用液相色谱-串联质谱法检测其色谱峰面积,相对于浓度绘制而得的标准曲线。
实施例2:
本发明食物中四环素类含量的检测方法,包括如下步骤:(1)150nM适配子探针与四环素类抗生素充分混合得到样品,将样品超声振荡提取,再用固相萃取小柱处理,40℃反应35min后,加入150nM DNA引物,并在37℃反应60min;加入300nM环状DNA模板,40℃反应2h,分别加入10U/μLPhi29 DNA聚合酶,1mMdNTPs在40℃反应5h,水浴加热到70℃保温20min,终止反应;(2)200nM染料标记的DNA探针与20µg/mL石墨烯混合反应60min,4℃保存备用;(3)取步骤(1)滚环扩增产物与步骤(2)制备的200nM石墨烯基分子信标混合,体积比1:12,室温下测定体系中标记染料的荧光强度随时间变化曲线,测定体系中染料的荧光强度时间变化曲线,根据标准曲线外标法检测样品中四环素类抗生素的含量。所述超声振荡提取时先使用缓冲溶液将所述样品混匀,超声后再振荡提取,离心分离,然后将上清液转入固相萃取小柱处理。所述的固相萃取小柱是用等体积的甲醇、水和缓冲溶液平衡的固相萃取小柱。所述标准曲线是用不同浓度的所述样品分别配制为标准溶液,用液相色谱-串联质谱法检测其色谱峰面积,相对于浓度绘制而得的标准曲线。
实施例3:
本发明食物中四环素类含量的检测方法,包括如下步骤:(1)25~150nM适配子探针与四环素类抗生素充分混合得到样品,将样品超声振荡提取,再用固相萃取小柱处理,10~40℃反应25~35min后,加入25~150nM DNA引物,并在37℃反应10~60min;加入100~300nM环状DNA模板,25~40℃反应0.5~2h,分别加入2~10U/μLPhi29 DNA聚合酶,0.25~1mMdNTPs在25~40℃反应5h,水浴加热到60~70℃保温10~20min,终止反应;(2)20~200nM染料标记的DNA探针与2~20µg/mL石墨烯混合反应10~60min,4℃保存备用;(3)取步骤(1)滚环扩增产物与步骤(2)制备的20~200nM石墨烯基分子信标混合,体积比1:5~12,室温下测定体系中标记染料的荧光强度随时间变化曲线,测定体系中染料的荧光强度时间变化曲线,根据标准曲线外标法检测样品中四环素类抗生素的含量。所述超声振荡提取时先使用缓冲溶液将所述样品混匀,超声后再振荡提取,离心分离,然后将上清液转入固相萃取小柱处理。所述的固相萃取小柱是用等体积的甲醇、水和缓冲溶液平衡的固相萃取小柱。所述标准曲线是用不同浓度的所述样品分别配制为标准溶液,用液相色谱-串联质谱法检测其色谱峰面积,相对于浓度绘制而得的标准曲线。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (4)
1.一种食物中四环素类含量的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)25~150nM适配子探针与四环素类抗生素充分混合得到样品,将样品超声振荡提取,再用固相萃取小柱处理,10~40℃反应25~35min后,加入25~150nM DNA引物,并在37℃反应10~60min;加入100~300nM环状DNA模板,25~40℃反应0.5~2h,分别加入2~10U/μLPhi29 DNA聚合酶,0.25~1mMdNTPs在25~40℃反应5h,水浴加热到60~70℃保温10~20min,终止反应;(2)20~200nM染料标记的DNA探针与2~20µg/mL石墨烯混合反应10~60min,4℃保存备用;(3)取步骤(1)滚环扩增产物与步骤(2)制备的20~200nM石墨烯基分子信标混合,体积比1:5~12,室温下测定体系中标记染料的荧光强度随时间变化曲线,测定体系中染料的荧光强度时间变化曲线,根据标准曲线外标法检测样品中四环素类抗生素的含量。
2.根据权利要求1所述的食物中四环素类含量的检测方法,其特征在于,所述超声振荡提取时先使用缓冲溶液将所述样品混匀,超声后再振荡提取,离心分离,然后将上清液转入固相萃取小柱处理。
3.根据权利要求1所述的食物中四环素类含量的检测方法,其特征在于,所述的固相萃取小柱是用等体积的甲醇、水和缓冲溶液平衡的固相萃取小柱。
4.根据权利要求1所述的食物中四环素类含量的检测方法,其特征在于,所述标准曲线是用不同浓度的所述样品分别配制为标准溶液,用液相色谱-串联质谱法检测其色谱峰面积,相对于浓度绘制而得的标准曲线。
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