CN106460037A

CN106460037A - 确定5‑氟尿嘧啶风险的方法

Info

Publication number: CN106460037A
Application number: CN201580011724.9A
Authority: CN
Inventors: 戴维·克尔; 伊恩·汤姆林森; 丹·罗兹马林; 克莱尔·帕利斯
Original assignee: Oxford Innovation Co Ltd, University of
Current assignee: Oxford Innovation Co Ltd, University of; Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2014-03-04
Filing date: 2015-03-02
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2035-03-02
Also published as: US20170073765A1; CN106460037B; ES2811835T3; WO2015132569A1; EP3114235B1; EP3114235A1; GB201403820D0; DK3114235T3; US10774385B2

Abstract

本发明提供了用于预测受试者中5‑氟尿嘧啶(FU)毒性风险的测定。可筛选存在至少一种TYMS多态性和/或至少一种DPYD多态性的受试者。提供了合适的TYMS和DPYD多态性。一种或多种多态性的存在表明了发生FU毒性的风险增加；阴性结果可表明了发生FU毒性的风险降低。

Description

确定5-氟尿嘧啶风险的方法

技术领域

本发明涉及测定。更具体地，本发明涉及用于预测化疗剂毒性的测定。描述了用于实现该测定的试剂和试剂盒。

5-氟尿嘧啶(FU)通常被用作用于治疗癌症比如结肠直肠癌(CRC)、乳腺癌和其他实性肿瘤的化疗剂。基于FU的给药方案包括团注和静脉灌注给药和口服卡培他滨，卡培他滨是在恶性组织中优先转化为FU的前体药物。对具有CRC患者的常见治疗为卡培他滨([1-(3,4-二羟基-5-甲基四氢呋喃-2-基)-5-氟-2-氧代-1H-嘧啶-4-基]氨基甲酸戊基酯)。

向FU添加奥沙利铂或伊立替康可提高效力，以及联合给药方案FOLFOX(deGramont A et al.,J Clin Oncol 18(16):2938-47(2000),通过引用并入本文)、XELOX(Cassidy J et al.,J Clin Oncol 22(11):2084-91(2004),通过引用并入本文)和FOLFIRI(Douillard JY et al.,Lancet 355(9209):1041-7(2000),通过引用并入本文)是治疗癌症的标准疗法。

因此FU是化疗的支柱。但是，FU毒性是常见的，有10-30％的患者经受着多种重度毒性，该毒性可定义为使用NCI不良反应常见毒性标准(CTCAE)3.0版本测量的3级或更高：

卡培他滨通过抑制胸腺嘧啶的生产和通过转换为并入DNA和RNA的代谢物而引起细胞毒性(Noordhuis P et al.,Nucleosides Nucleotides&Nucleic Acids 23:1481-1484(2004),通过引用并入本文)。正如其他的基于5-FU的化疗方案，大约三分之一的卡培他滨患者遭受了药物诱导不良事件的剂量限制水平。

FU毒性通常包括症状比如腹泻，恶心和呕吐，粘膜炎/口腔炎，骨髓抑制，中性粒细胞减少，血小板减少和手足综合征(HFS)。最常见的剂量限制的卡培他滨毒性是HFS和腹泻。毒性的频率和类型存在着很大的变异，其取决于用药方案，以及总的来说存在着与FU使用相关联的0.5-1.0％死亡率(使用CTCAE 3.0版本测量的5级)(Grem JL.,Investigationalnew drugs 18(4):299-313(2000)；和Twelves C et al.,The New England journal ofmedicine 352(26):2696-704(2005),二者通过引用并入本文)。毒性的发作可以是快速的，这导致了在单一治疗和灌注与团注5-FU的联合方案中患者死亡率为0.5％至2％，(SaltzLB et al.,J Clin Oncol.25(23):3456-3461(2007)，通过引用并入本文)，以及对于卡培他滨方案死亡率为上述数目的半数。患者间毒性差别可通过临床因素如患者年龄、性别、本地临床实践和饮食进行说明(Stein BN et al,.Cancer 75(1):11-17(1995)；Cassidy Jet al,.Ann Oncol.13(4):566-575(2002)；Haller DG et al.,J Clin Oncol.26(13):2118-2123(2008),各自通过引用并入本文)。然而，毒性多变性依然是无法解释的。

因此，很多注意力都集中在鉴定可预测FU毒性的生物标记或测定(Boisdron-Celle M et al.,Cancer letters 249(2):271-82(2007)；和Saif MW et al.,Journal ofthe National Cancer Institute 101(22):1543-52(2009),二者均通过引用并入本文)。然而，FU代谢是复杂的，其具有多个酶促反应和中间体，如图1所示。

卡培他滨激活和随后5-FU作用和降解的生物化学途径完全建立了，并提供了25个候选基因，其中变异可能会影响5-FU毒性(图1)(Longley DB et al.,Nat Rev Cancer 3(5):330-338(2003)；Thorn CF et al.,Pharmacogenet Genomics 21(4):237-242(2011)；West CM et al.,Nat Rev Cancer 4(6):457-469(2004)；Miwa M et al.,Eur J Cancer34(8):1274-1281(1998),各自通过引入并入本文)。当在消化道中吸收时，卡培他滨在肝脏中部分转化为5-FU，然后在CRC位点优先转化为5-FU。在肝脏中许多5-FU在激活之前由二氢嘧啶脱氢酶(DPYD)降解。作为药物合理设计激活的部分，5-FU在肿瘤中进一步激活为细胞毒性化合物，所述细胞毒性化合物通过与核苷酸前体竞争结合胸苷酸合成酶(TYMS)来抑制DNA合成。存在着毒性的各种来源，包括通过合并导致直接DNA/RNA破坏的肿瘤外替代的激活途径，激活化合物的不期望运输，药物靶点的可变表达和药物降解水平减少。

在先前的研究中，严重的二氢嘧啶脱氢酶(DPYD)缺乏与致死的FU使用已经联系起来(Van Kuilenburg AB et al.,Eur J Cancer 33(13):2258-64(1997)，通过引用并入本文)。从此以后，多态性不断扩大的数目和参与FU代谢的基因中罕见变体已被建议作为影响不良事件的风险，包括MTHFR 677C>T(Afzal S et al.,Clin Cancer Res 17(11):3822-9(2011),通过引用并入本文)；和TYMS等位基因(Lecomte T et al.,Clin Cancer Res 10(17):5880-8(2004)),通过引用并入本文)。TYMS风险等位基因是北欧人群中是常见的。然而，尽管存在TYMS等位基因影响mRNA表达水平的一些证据(Mandola MV et al.,Cancerresearch 63(11):2898-904(2003)；和Zhang Q et al.,Chinese medical journal 124(2):262-7(2011),二者通过引用并入本文)，现有的数据受以下的限制：如报道和测试毒性的不一致；不同的FU方案患者的汇集；和功能不同多态性的联合分析。

旨在鉴定FU毒性风险的商业可得的试剂盒不是最优的，并且该试剂盒倾向于鉴定常见的多态性，从而将几乎每一个测试受试者归类为处于风险中。甚至不包括该常见多态性的试剂盒通常也提供几乎等于29％的敏感性。

因此，目前不存在预测不良事件的可靠方式，原因在于不清楚哪个(如果有的话)基因变体成为FU毒性的良好预测指标。

因此，存在着确认关于哪些基因变体真正预测FU不良事件的需求。存在着预测FU毒性的临床生物标记和测定的需求。

本发明专注于一个或多个上述需求。特别是，本发明人已经发现了预测FU毒性的临床生物标记和相关测定的结合。

因此，本发明提供了筛选受试者中5-氟尿嘧啶(FU)毒性风险的方法，包括筛选存在选自以下a和/或b的至少一种多态性的受试者：

a.选自由5'VNTR 2R/3R rs45445694,3'UTR 6bp ins-del rs16430和rs2612091组成的组的TYMS多态性；和/或

b.选自由*2A rs3918290,2846T>A rs67376798,rs12132152,rs12022243,rs7548189,p.Ala551Thr组成的组的DPYD多态性，

也可筛选DPYD多态性的功能等同的变体。

阳性结果(即存在一种或多种上述提及的多态性)表明了发生FU毒性的风险增加。阴性结果(即不存在筛选的多态性)可表明发生FU毒性的风险降低。

在一个实施方案中，本发明提供了筛选受试者中5-氟尿嘧啶(FU)毒性风险的方法，包括筛选存在选自以下的至少一种多态性的受试者：

b.选自由*2A rs3918290,2846T>A rs67376798,rs12132152,rs12022243,rs7548189,p.Ala551Thr组成的组的DPYD多态性，和其功能等同的变体；

其中，与不具有所述至少一种多态性的受试者相比，所述至少一种多态性的存在表明了发展FU毒性的风险增加。

其中与具有所述至少一种多态性的受试者相比，阴性结果表明了发展FU毒性的风险降低。

a.选自由5'VNTR 2R/3R rs45445694,3'UTR 6bp ins-del rs16430andrs2612091组成的组的TYMS多态性；和/或

b.选自由*2A rs3918290,2846T>A rs67376798,rs12132152,rs12022243,rs7548189,p.Ala551Thr和它们功能等同的变体组成的组的DPYD多态性；

其中，存在一种或多种所述多态性表明了发展FU毒性的风险增加以及阴性结果表明了发展FU毒性的风险降低。

TYMS 5'VNTR 2R/3R多态性可由rs45445694定义，和3'UTR 6bp ins-del多态性由rs16430定义。DPYD*2A多态性可由rs3918290定义，和2846T>A多态性由rs67376798定义。rs数目指的是dbSNP ID。

上述方法可高度预测FU毒性。该方法可包括筛选上述多态性的任何组合。因此，筛选可以是任何TYMS多态性5’2R/3R,3'UTR 6bp ins-del和rs2612091，和任何DPYD多态性*2A,2846T>A,rs12132152,rs7548189,p.Ala551Thr和其功能等同的变体。

本发明的方法可包括筛选存在TYMS多态性rs2612091；和存在DPYD多态性*2A,2846T>A,rs12132152,rs7548189,p.Ala551Thr。已经出人意料的发现本方法提供了高达27％的敏感性(sensitivity)、91％的特异性、60％的阳性预测值和71％的阴性预测值。

本发明的方法可包括筛选存在TYMS多态性5'VNTR 2R/3R和3'UTR 6bp ins-del；和存在DPYD多态性*2A和2846T>A。已经出人意料的发现该方法提供了高达58％的敏感性、63％的特异性、47％的阳性预测值(PPV)和72％的阴性预测值。

因此，本发明的方法与基于使用市售试剂盒的方法相比表现出了显著的改进。

受试者可以是癌症患者。该患者可以具有实性肿瘤癌症比如结肠直肠癌(CRC)或乳腺癌。该受试者可正在经受(或已经经受)FU化疗。可选地，该方法可在将要经受FU化疗的受试者中进行。

FU化疗可以是FU单一治疗，比如卡培他滨单一治疗。然而术语“FU化疗”包含基于FU独自或与一种或多种其他试剂如FOLFOX,XELOX或FOLFIRI联合的任何治疗。

筛选TYMS和/或DPYD多态性的存在可以在来自受试者的样品中进行。该样品可以是流体样品，例如唾液、血液、血清或血浆样品。该样品可以是固体样品，比如来自活组织检查的样品。

筛选与2846A,*2A rs12132152,rs7548189或p.Ala551Thr具有等同功能效果的DPYD变体也包含在本发明的范围内。此类变体可使用已有的基因测序或本技术领域已知的直接功能测定来筛选。

本发明的方法允许密切监测其中存在一种或多个上述多态性并因而处于增加的毒性风险中的受试者。本发明的方法可因此包括在阳性结果的情况下，即其中检测到一种或多种上述的多态性，监测受试者FU毒性症状的步骤。

FU毒性风险可以是高等级FU毒性，即根据NCI不良事件常见毒性标准(CTCAE)3.0版本等级为3+。高等级FU毒性可以是总体毒性(global toxicity)。高等级FU毒性可包含腹泻、恶心呕吐、黏膜炎/口腔炎、骨髓抑制、中性粒细胞减少、血小板减少和手足综合症(HFS)。

可使用计分检验来鉴定TYMS和DPYD多态性，其测试区域内的变体的独立效果。这个检验可包括用毒性对于个体携带高风险等位基因的数目进行逻辑回归，并相应地向受试者分配基因得分(如从0至4)。下面为示例，基因风险得分＝ΣβiNi，其中βi为逻辑回归模型中与总体毒性显著相关的第i个SNP的贝塔系数，以及Ni为该个体在该位置携带有害等位基因的数目。

还可使用组检验来鉴定DPYD多态性。这个检验可包括罕见变体的联合组评价，其中基于酶功能，或DPYD 2846A或DPYD*2A的载体均被归为“变体”类，以及其他的被归为“野生型”类。

这个评价可包括与2846A,*2A,rs12132152,rs7548189和/或p.Ala551Thr具有等同功能效果的DPYD变体。

本发明还提供了用于本发明方法的能够检测例如在来自于患者的样品中上述TYMS和/或DPYD多态性存在的一种或多种试剂。

上述试剂可存在于试剂盒中。因此，本发明提供了包括一种或多种上述能够检测上述TYMS和/或DPYD多态性存在的试剂的试剂盒。

筛选至少一种多态性的存在可包括本领域已知的测序方法如PCR。

表格列表

表1：挑选的DPYD和TYMS多态性与卡培他滨相关毒性(等位基因模型，毒性等级0-2对3+)之间的关联

示出了对于给予卡培他滨患者的两种TYMS和DPYD变体的固定效果荟萃分析和合并逻辑分析结果。每个所携带的毒性等位基因(范围为每位患者0-2种等位基因)，首先提供了每一多态性的个体效果，其中比值比(OR)描述了经历毒性等级3+(总体、腹泻或HFS)的患者的比例提高。对于两种TYMS多态性，逻辑模型示出了这两种多态性促进了患者的风险。该风险是由TYMS“得分”检验荟萃分析评估的，其中OR显示了经历高毒性等级的患者比例提高，来自5’VNTR或3’UTR多态性的每一推定毒性等位基因(范围为每一患者0-4个等位基因)。对于功能DPYD多态性，OR显示了具有*2A或2846罕见等位基因的效果。N＝所研究的患者总数，TAF＝推定毒性相关等位基因的频率，和S＝研究的数目。以斜体显示测试等位基因。

表2：QUASAR2患者特征

显示了对于总计1046个个体的来自QUASAR2研究人群的患者特征，所述患者随机接受单独卡培他滨(47％)或者卡培他滨和贝伐单抗(53％)，包含大量的等级3+毒性事件。

表3：QUASAR2中的毒性频率

显示了QUASAR2研究的毒性频率，等级为0-4，包含未报道的等级。

表4：SCP研究中的毒性频率

这组患者被选择高毒性和低毒性(即少数等级2)以及仅仅收集腹泻和HFS毒性数据。

表5：候选基因区域汇总

从其中鉴定变体的25个候选卡培他滨/5-FU途径基因，其存在于一种或多种Hap300/370,Hap610或外显子组阵列。

表6：挑选的QUASAR2中基因变体和卡培他滨毒性之间的关联

显示了二元或连续变量测量的总体和所挑选的个体毒性的关联。TAF为毒性关联等位基因的频率。每一结果单元的第一行是OR，第二行是95％CIs和第三行是每一等位基因模型的p值。

表7：检验TYMS rs2612091,5’VNTR和3’UTR单倍型对于一个多态性的独立效果

在PLINK中执行单倍型分析(Purcell S et al.,American Journal of HumanGenetics 81(3):559-75(2007)通过引用并入本文)使用“--independent-effect”命令，其中轮流地对于每一多态性，分析等位基因与毒性的关联，而保持其他多态性基因型不变。该检验产生了每一该检验的p值并随后对于多态性的总p值，该总p值显示了该多态性是否与毒性具有稳定关联，而不考虑单倍型基因型的背景。前3个面板显示了分别变化5’VNTR等位基因,3’UTR等位基因和rs2612091的效果。总体上仅仅rs2612091显示了显著效果。后2个面板显示了2种-多态性分析，其中变化rs2612091而使5’VNTR和3’UTR保持不变。注意的是没有显示一些罕见单倍型。

表8：SCP研究中挑选的变体和毒性之间的关联

数据如表6所示。

表9：卡培他滨/5-FU途径基因的集合检验分析

集合检验使用25种卡培他滨/5-FU途径基因中每一种的25kb内的SNPs和ENOSF1。在分析之前，已知的DPYD 2846和*2A变体和新鉴定的DPYD rs12132152,DPYD rs7548189和TYMS rs2612091，以及与这些SNPs连锁不平衡r²>0.1的任何(包括TYMS 5’VNTR和3’UTR多态性)均被去除。通过在等位基因模型下使用逻辑回归单独检验每一SNP的关联来进行检验，调整年龄、治疗分支和性别，交换结果数据并重新测试10000次，然后将观察到的p值分布与每一集合随机分配毒性数据的那些进行比较(即所有SNPs的每一基因或交叉)。

表10：挑选的DPYD变体的具有毒性等级4的QUASAR2个体的基因型

对于毒性，D＝腹泻，V＝呕吐，H＝HFS，N＝中性粒细胞减少，P＝血小板减少，M＝黏膜炎，S＝口腔炎。所示的变体为(i)由本研究鉴定的那些(rs12132152,rs12022243,rs2612091,DPYD A551T)，(ii)在Rosmarin等人的荟萃分析中显示与5-FU毒性关联的DPYD等位基因(2846A>T和*2A)(Rosmarin et al.,Journal of clinical oncology:officialjournal of the American Society of Clinical Oncology(2014),出版中，通过引用并入本文)和(iii)来自于Caudle等人的潜在DPYD毒性等位基因(Caudle et al.,Clinicalpharmacology and therapeutics 94(6):640-5(2013),incorporated herein byreference)。所示的基因型为主要等位基因纯合子(0)，杂合子(1)和次要的或变异的等位基因纯合子(2)。空白单元指的是缺失数据。显示了对严重毒性提供貌似合理说明的等位基因。注意的是*4和*5DPYD等位基因与2A或2846T>A完全连锁不平衡(D’＝1.0)。

表11：QUASAR2中DPYD编码区域变体和卡培他滨毒性之间的关联

显示了存在于标签SNP或外显子组阵列上的多态性和罕见变体，以及在QUASAR2的两个分支的荟萃分析中与毒性关联的概括统计。MAF＝次要等位基因频率。

检验基因由斜体表示

表1

表2

表3

表4

表5

表6

表6(接上页)

表7

表8

表9

表10

表11

示图列表

图1 FU代谢途径

卡培他滨是口服的5-FU前体药物，其被合理设计以便细胞毒性代谢物FdUMP,FdUTP and FUTP的浓度在恶性细胞中比在正常细胞中高。大多数药物激活是通过共同的前体药物激活途径发生的(图1a)。另外，在结肠肿瘤细胞和来自多个其他组织的细胞中，5-FU能通过交替的激活途径转化为活性化合物(图1b)。通常当5-FU退出靶向组织并随后激活时，假如非靶向组织暴露在激活的卡培他滨/5-FU(如FdUMP和FUTP)则可发生毒性。由细胞释放进入血液循环中的5-FU可通过肝脏迅速代谢(图1c)。主要途径以实线示出；备选途径以虚线示出。

图2：FOLFOX患者中TYMS多态性荟萃分析的森林图(等位基因模型，等级0-2对3+总体毒性)

示出了两种TYMS多态性对来自FOLFOX治疗的总体3+级FU相关毒性的个别效果，所述效果是不显著的(TYMS 5’2R p＝0.26；TYMS 3’6bp-ins allele p＝0.8)。每一试验由方形表示，其中心表示比值比(OR)，示出了经受高毒性患者的的比例增加，对于拥有的每一测试等位基因(范围为0-2每一患者，每一多态性)，而水平线表示95％置信区间(CIs)。方形的尺寸与试验贡献的信息量直接成比例。菱形表示纳入研究的总OR，其中心表示OR以及边缘表示95％CI。使用固定效果模型，p-het＝异质性检验的p值，meta＝荟萃分析。

图3：在QUASAR2卡培他滨患者中，TYMS 5’VNTR 2R/3R,TYMS 3’UTR 6bp ins-del,DPYD 2846T>A和DPYD*2A多态性的FU毒性接受者操作特性(ROC)(receiver operatingcharacteristics)分析

标记了两个敏感性/特异性截断点：在图的左下角那个对应着正确分类的患者的最大比例，敏感度为4％，特异性为100％以及阳性预测值为86％，主要是归因于罕见的DPYD变体；其他的截断点由于并入TYMS基因型而影响更多的患者，并对应于敏感度为58％，特异性为63％以及阳性预测值为47％.

图4 DPYD和TYMS与卡培他滨相关毒性相关的区域图

示出了与总体等级012v34卡培他滨相关毒性和组分毒性表型的关联，对于(a)DPYD和(b)TYMS/ENOSF1中区域侧翼顶部标签SNPs。x轴显示染色体坐标，同时y轴显示关联显著性的p值，在对数标尺上。圆圈表示了包含在我们1,456-SNP测试板中的SNPs，而方块表示精细地图的SNPs。紫色圆圈代表最佳关联的标签SNPs，以及如每个图例所示颜色表示与该SNP的相关性。对于TYMS/ENOSF1,最显著的HFS 01v2v34SNP(也是第三显著总体012v34SNP)是rs2741171。通过LocusZoom进行做图。

图5近(a)TYMS/ENOSF1和(b)DYPD(left＝D’；right＝R²)的所选变体之间的LD。

示出了对于TYMS的来自Haploview EM算法的单倍型频率。

图6 QUASAR2中，总体等级012v34卡培他滨相关毒性的的接受者操作特性(ROC)分析

来自QUASAR2试验的938位卡培他滨患者的接受者操作特性(ROC)分析，分析了总体卡培他滨/5-FU相关等级012v34毒性。包含在模型中的变体为先前鉴定的DPYD2846T>A(rs67376798)和DPYD*2A(rs3918290)和新鉴定的毒性变体DPYD A551T,DPYD rs12132152,DPYD rs7548189and TYMS rs2612091。曲线下面积(AUC)为0.66％(95％CI0.63-0.70)。线条标记了截断点，在该截断点最大比例的患者被正确分类(69％)，敏感度为27％(95％CI23-33％)，特异性为91％(95％CI 88-93％),PPV为60％(95％CI 52％-68％),和NPV为71％(95％CI 68％-74％)。

实施例

将通过以下实施例对本发明做进一步的阐明，其旨在仅仅作为本发明的示例而不是限制。

实施例1

作为概述，检查候选多态性与来自下述试验(“QUASAR2”)的患者中的卡培他滨毒性之间的关联。然后进行荟萃分析，将这些数据与来自先前公布的研究的那些数据相结合，两者都是卡培他滨和其他FU方案。最后，鉴定预测FU毒性的多态性，以及计算该检验的敏感度、特异性和预测值。

a.在QUASAR2试验中检验候选FU途径毒性变体

i.患者和研究特性

QUASAR2研究(http://www.octo-oxford.org.uk/alltrials/infollowup/q2.html；http://www.controlled-trials.com/ISRCTN45133151/)为在CRC II/III期切除之后，辅助卡培他滨(希罗达)(1250mg/m²每三周第1-14天每天两次，总计8个周期)+/-贝伐单抗(7.5mg/kg每三周)的III期随机对照试验。患者在2005年7月至2011年12月之间于123个UK位点和81个非UK位点进入本研究。在自2010年7月起收集血液的1119个患者中，选择1046个用于基于临床数据和知情同意的可用性的研究。

ii.FU毒性评价

在每一治疗周期之后使用NCI不良事件常见毒性标准(CTCAE)3.0版本对不良事件进行分级。个别分析常见FU相关毒性——腹泻、恶心呕吐、黏膜炎/口腔炎、中性粒细胞减少、血小板减少和HFS，并且还结合分析作为“总体”毒性。不良事件可分为低级(CTCAE等级0/1/2)和高级(在任何治疗周期CTCAE等级3/4/5)。高血压和蛋白尿显然与贝伐单抗相关(倍高的发生率)并不包含在分析中。两个研究组之间的FU相关毒性发生率没有重大差异，并将这些组合进行分析。

iii.鉴定基因变体以检验与卡培他滨毒性的关联

为鉴定用于QUASAR2中检验的合适的FU途径多态性，对文献进行了系统回顾。在PubMed和谷歌学术搜索(Google Scholar)中进行了139个检索，首先使用检索词“毒性”与“5-氟尿嘧啶”、“5-FU”或“卡培他滨”的组合。然后重复该检索，使用相同的检索词与初始检索中鉴定的先前已检验与FU毒性关联的8个基因的符号组合(24个单独检索)。

从生成的出版物，回顾了参考和引用文章，与初始检索词结合检索任何新的基因和所有的多态性。如果研究有如下则考虑将所述研究包含在内：(i)已经使用基于FU的方案；(ii)已经分析与FU毒性相关的基因多态性和/或罕见变体；和(iii)以及报道一种或多种如上所列的6种常见FU毒性。总计有49个出版物符合这些标准，随后将这些出版物进一步限定在那些具有以下的出版物：(i)样本大小≥30个患者；(ii)白种人参与者；和(iii)前瞻性设计用于收集毒性数据。

这保留了来自总计28个研究的7种基因中的59种多态性，如在以下公开的：Boisdron-Celle M et al.,Cancer letters 249(2):271-82(2007)；Schwab M et al.,JClin Oncol 26(13):2131-8(2008)；Afzal S et al.,Clin Cancer Res 17(11):3822-9(2011)；Lecomte T et al.,Clin Cancer Res 10(17):5880-8(2004)；Cohen V et al.,Clin Cancer Res 9(5):1611-5(2003)；Largillier R et al.,Clin Cancer Res 12(18):5496-502(2006)；Morel A et al.,Molecular cancer therapeutics 5(11):2895-904(2006)；Gross E et al.,PloS one 3(12):e4003(2008)；Salgado J et al.,Oncologyreports 17(2):325-8(2007)；Capitain O et al.,Pharmacogenomics J 8(4):256-67(2008)；Martinez-Balibrea E et al.,Eur J Cancer 44(9):1229-37(2008)；Ribelles Net al.,Current drug metabolism 9(4):336-43(2008)；Ruzzo A et al.,Pharmacogenomics J 8(4):278-88(2008)；Sharma R et al.,Clin Cancer Res 14(3):817-25(2008)；Afzal S et al.,Annals of oncology:official journal of theEuropean Society for Medical Oncology/ESMO 20(10):1660-6(2009)；Braun MS etal.,J Clin Oncol 27(33):5519-28(2009)；Chua W et al.,Br J Cancer 101(6):998-1004(2009)；Derwinger K et al.,Clinical colorectal cancer 8(1):43-8(2009)；Gusella M et al.,Br J Cancer 100(10):1549-57(2009)；Goekkurt E et al.,J ClinOncol 27(17):2863-73(2009)；Boige V et al.,J Clin Oncol 28(15):2556-64(2010)；Etienne-Grimaldi MC et al.,British journal of clinical pharmacology 69(1):58-66(2010)；Martinez-Balibrea E et al.,Br J Cancer 103(4):581-9(2010)；McLeod HLet al.,J Clin Oncol 28(20):3227-33(2010)；Zarate R et al.,Br J Cancer 102(6):987-94(2010)；Caronia D et al.,Clin Cancer Res 17(7):2006-13(2011)；Martin M etal.,Clin Cancer Res 17(7):2006-13(2011)；Deenen MJ et al.,Clin Cancer Res 17(10):3455-68(2011)；Glimelius B et al.,Pharmacogenomics J 11(1):61-71(2011),所有这些均通过引用并入本文)。在这些59种变异体中，由于4种不能明确绘图而将其舍弃，以及进一步有19种在之前的FU毒性研究中是不变的，留下36种多态性用于研究。

iv.QUASAR2患者中FU毒性变体的基因分型

白种人种族的940个QUASAR2患者(439个单独卡培他滨，501个卡培他滨+贝伐单抗)具有可用的毒性数据。得到36个候选多态性的患者基因型，以及包含至少400个患者的多态性基因型。

首先，先前已经使用Illumina全基因组单核苷酸多态性(SNP)面板(panel)(HumanHap 370,Human Hap 610或Human Omni 2.5)对所有的患者进行基因分型，以及从这些数据中提取一些多态性基因型。先前采用了对于大关联研究的标准质量控制程序(Dunlop MGet al.,Nature genetics 44(7):770-6(2012),通过引用并入本文)。通过主成分分析(PCA)检查群体分层，以及去除与已知非白人种族的HapMap样本聚类的6种病例。由于基因分型检出率(genotying call rate)低(<95％)，进一步排除了9种样本。

第二，对于不存在于一些或所有SNP阵列的变体，推导得到估算基因型。将2009年8月数据1000个基因组的IMPUTE v2程序和CEU参与者用作参考面板。基于标准准则将多态性包含在内(信息得分>0.90和缺失<0.10)。将具有全基因组测序数据的个体面板用于检查估算的精度。由于与其他含有的变体具有非常强的连锁不平衡(LD；r²>0.9)，对2种变体进行了删减。

第三，使用竞争等位基因特异性SNP基因分型的KASPar方法对DPYD*2A,DPYD2846T>A和CES2 823进行分型(Cuppen E et al.,CSH protocols 2007pdb prot4841(2007),通过引用并入本文)。使用已知的基于PCR的方法对TYMS 5’VNTR 2R/3R(Horie N et al.,Cell structure and function 20(3):191-7(1995)，通过引用并入本文)和TYMS 3’UTR6bp ins-del(Dotor E et al.,J Clin Oncol 24(10):1603-11(2006)，通过引用并入本文)进行基因分型。

在所包含的21种变体中，有17种在超过800个QUASAR2患者中进行基因分型，剩下的在超过400个患者中进行分型。对于QUASAR2中单独SNP分析，在分析中使用所有可用的基因型。对于多变量分析，仅仅分析调查中基因分型为所有变体的样本的子集。

发现有34％的QUASAR2患者发展了等级3+总体毒性(表2)。

最频繁的具体等级3+毒性为HFS(n＝247)，随后是腹泻(n＝109)和中性粒细胞减少(n＝22)。在21种基因型和/或估算的FU毒性多态性中，有3种表现了与总体G3+毒性显著相关q<0.05：TYMS 5’VNTR 2R(OR＝1.48,95％CI 1.22-1.80,p＝0.000079)；TYMS 3’UTR6bp ins(OR＝1.67,95％CI 1.23-2.22,p＝0.00084)；和DPYD 2846A(OR＝9.35,95％CI2.01-43.4,p＝0.0043)(表1)。

值得注意的是，没有发现之前报道的18种FU变体对总体或具体毒性有正式显著的效果。

5’VNTR和3’UTR TYMS具有中等连锁不平衡(LD)(r2＝0.17,D’＝0.64)，以及当通过逻辑回归分析调整其他时二者均不与毒性保留显著关联(表1)。因此这些变体不是独立的标记物。

在缺失用于TYMS关联信号的明确定义的遗传基础时，为了捕获来自5’VNTR和3’UTR多态性的结合信号，检验定量TYMS风险得分(根据每一患者的高风险等位基因的数目计数为0-4)。该计分检验预测总体FU毒性(ORper count＝1.38,95％CI 1.16-1.64,p＝0.00031,逻辑回归,表1；ORscore 3,4v score 0＝3.70,95％CI 1.35-10.1,p＝0.0011)。基于逻辑回归的伪R2统计学(pseudo-R2statistics)，该计分检验说明了相比于两者任一个体TYMS变体，更大的变异比例。

还分析了作为显著相关基础的个体毒性。TYMS多态性(计分检验)表现了对HFS(OR＝1.31,p＝0.0063)和腹泻(OR＝1.24,p＝0.096)具有相似的效果，然而前者更为常见并且因此更多的促进总体测量并在其分析中具有更大的统计功效(表1)。相反，相比于对于HFS(OR＝1.31,p＝0.69)，DPYD 2846A的效果表现出对腹泻更加显著(OR＝3.14,p＝0.093)(表1)。

b.统计分析

对于每一多态性，进行了等位基因与总体G3+毒性相关的检验，偶联有调整性别、年龄和分支(arm)的逻辑回归分析，但是包含这些变量对于结果产生了最小的差异，因此不再包含这些数据。

对于具有毒性关联连续证据的基因，进行附加调查。通过二元模型来分析TYMS 5’VNTR重复单倍型，该二元模型是基于跨过两个等位基因(0-2对3-4)的USF1/USF2结合位点的总数(Mandola MV et al.,Cancer research 63(11):2898-904(2003)，通过引用并入本文)，通过以研究为条件的逻辑回归、单倍型分析和“计分检验”来对中度连锁不平衡的TYMS5’VNTR和3’UTR多态性进行联合分析，其中用毒性对由3’UTR和5’VNTR多态性总计的TYMS风险等位基因的数目(0-4个等位基因)进行逻辑回归。

对于DPYD，对酶功能有效果的罕见变体(DPYD*2A and 2846T>A)的组合评估是做为一个组进行的。

通过将患者进行二分类为G1/2或G3/4//5总体毒性来生成接受者操作特性(ROC)曲线，并基于ΣβiNi给予值，其中βi为逻辑回归模型中与总体毒性显著相关联的第i个SNP的贝塔系数，以及Ni为在该位置携带有害等位基因的数目。由荟萃分析结果来确定列入的变体。计算曲线下面积(AUC)和基于对数似然比在适当的截断点评估性能。在PLINK中进行逻辑回归。在Haploview中执行单倍体构建。

c.FU毒性变体对来自卡培他滨单一治疗的毒性的效果

分析15种FU毒性变体与总体卡培他滨毒性关联。附加QUASAR2的研究包含少数数据，全体可达382个患者.

发现了总体毒性和TYMS 5’VNTR 2R等位基因之间的关联(包括QUASAR2:OR＝1.36,95％CI 1.15-1.60,p＝0.00028；不包括QUASAR2:OR＝1.09,95％CI 0.80-1.48,p＝0.27)，当调整3’UTR 6bp ins-del时该变体不是单独显著的(表1)。

荟萃分析提供了对于TYMS 3’UTR 6bp ins-del关联的微少支持(包括QUASAR2:OR＝1.35,95％CI 1.07-1.71,p＝0.012；不包括QUASAR2:OR＝0.94,95％CI 0.64-1.38,p＝0.74)，但是在数据中存在交叉研究异质性的证据(Phet＝0.025,I2＝68.0％)，其来自于一个80位患者的相对小型研究。TYMS计分检验荟萃分析，其使用来自两个最大研究的数据，仍然表现了高度显著相关(包含QUASAR2:OR＝1.33,95％CI 1.15-1.55,p＝0.00018；不包含QUASAR2:OR＝1.21,95％CI 0.89-1.63,p＝0.22)。

毒性与DPYD 2846T>A之间的关联也是显著的，但是这个变体仅仅在QUASAR2中检验(参见如上)。

i.数据综述

已经发现有4个特定种系TYMS和DPYD变体来预测卡培他滨毒性：TYMS 5’VNTR2R/3R,TYMS 3’UTR 6bp ins-del,DPYD 2846T>A和DPYD*2A。该分析提示多态性还可用于预测其他FU单一治疗方案中的毒性，但是这些方案不常使用。

还不清楚所分析的DPYD*2A和DPYD 2846T>A多态性是否也与联合治疗方案(FOLFOX,CAPOX,FOLFIRI,IFL,FLIRI)中的总体或任何具体毒性相关联。图2示出了来自于使用FOLFOX的研究中的2个主要TYMS多态性荟萃分析的结果，FOLFOX是最大的联合治疗数据集。

尽管一些之前的建议与引用文献中相反，对于剩余多态性，任何毒性关联的证据是不令人信服的。这些(DPYD 1627A>G,DPYD 85T>C,DPYD 496A>G,TYMS 5’VNTR G>C,MTHFR677C>T,MTHFR 1298A>C,CDA-451C>T,CES2 823C>G和TYMP多态性)中的一些是常见的(MAF>8％)，并且可确信排除差不多适度的效果，其中样本量相对较大。假设每一等位基因的比值比为1.5，检测这些SNP关联的效率(power)约为75-100％。对于其他的多态性(如DPYD1601G>A,DPYD 1236G>A,DPYD 2194G>A,CDA 943insC,和大部分CES2多态性)，次等位基因频率低或样本量小，导致了检测关联性的次优效率(约20-40％)。这些作为毒性标记的病例仍未得到证实。

d.用对酶功能的效果证据组合分析罕见DPYD等位基因

对于在具有与毒性因果相关的等同功能效果的单基因内的等位基因，将这些结合到用于预测检验的一个功能组中是合理的。对于DPYD，已经提出一些罕见变体导致DPYD缺陷综合症(OMIM#274270)(van Kuilenburg AB et al.,The Biochemical journal 364(Pt1):157-63(2002)；Van Kuilenburg AB et al.,Human genetics 104(1):1-9(1999),二者均通过引用并入本文)。在这些中，已经显示有一些可在体外降低DPYD活性(Offer SM etal.,Cancer research(2013)，通过引用并入本文)，而其他的具有较少的来自体内报道的功能证据(Seck K et al.,Clin Cancer Res 11(16):5886-92(2005)；van Kuilenburg ABet al.,Clin Cancer Res 6(12):4705-12(2000)，二者通过引用并入本文)。在患者群组中发现的变体中，发现对于DPYD 2846A and*2A具有功能性的良好公开证据(van KuilenburgAB et al.,The Biochemical journal 364(Pt 1):157-63(2002)；Van Kuilenburg AB etal.,Human genetics 104(1):1-9(1999)，二者通过引用并入本文)，而不是对于*9A(85T>C)或Ile370Val(1108A>G)，尽管之前已经报道这些可引起DPYD缺陷。

因此，在“分组检验”中将DPYD 2846T>A和*2A罕见等位基因作为分组(变体相对非变体)进行分析。已经发现与卡培他滨的总体毒性的正式显著关联(表明了联合关联风险相对高)(OR＝5.51,95％CI 1.95-15.51,p＝0.0013；数据来自QUASAR2单独，表1)，以及对于灌注(p＝0.042)和团注(p＝0.0068)单一治疗分析中的名义上显著的关联。所有这些关联都强于当两个变体之一单独考虑时。

e.用于预测FU毒性的多态性面板的性能

目前有三种用于预测FU毒性的商业可得的试剂盒。这些试剂盒包含总计17种多态性，这些多态性归入3个类别：(i)在本分析中毒性预测的证据(n＝4)；(ii)存在于本分析中，但不具有良好的预测能力证据(n＝5)；或(iii)不存在于本分析中(n＝8)。在类别(iii)的变体中，有5种是具有对酶功能有有害效果的证据的罕见DPYD变体(1679(*13),1897(*3),295-298del(*7),703(*8)和2983(*10))(van Kuilenburg AB et al.,TheBiochemical journal 364(Pt 1):157-63(2002)；Van Kuilenburg AB et al.,Humangenetics 104(1):1-9(1999)二者通过引用并入本文)。

在QUASAR2卡培他滨患者中，每一试剂盒确定总体毒性预测的敏感性和特异性，尽量严格遵循说明，并使用毒性的二元分类(无/低风险与适中/中级/高风险)。由于含有共同多态性，两种试剂盒将几乎所有的患者分为具有高风险毒性，假阳性数目大大超过真阳性数目。剩余的试剂盒提供了差不多29％的敏感性。

对于使用发展的DPYD组合的罕见功能等位基因检验和TYMS得分检验是否能提高该试剂盒的性能进行了评估(如实施例1(b)所描述的)。使用独立效果量估算(使用来自Caronia D et al.,Clin Cancer Res 17(7):2006-13(2011)的原始数据)并将其应用于逻辑回归模型中的QUASAR2。AUC是0.62(95％CI 0.57-0.67)。

在0.698ln(p/1-p)截断点——在这里最大比例(64％)的病例得到了正确分类——敏感性为3.8％，特异性为99.6％，PPV 86％(95％CI 42-99％),和NPV 64％(95％CI59-69％)，主要反映了仅仅罕见DPYD变体。在0.248ln(p/1-p)截断点，敏感性为58％和特异性63％，61％的患者得到正确分类(图3)；PPV为47％(95％CI 40-55％)和NPV 72％(95％CI66％-77％)。

因此，筛选两种TYMS变体和功能DPYD变体的存在可预测FU毒性。然而，依然存在鉴定并表征附加FU毒性变体的需求，以便提供对用于临床实践具有更大预测效率的改进的检验。这类改进的基因检验将提供密切监测处于毒性风险增加的患者或对在处于低毒性风险的患者提高FU剂量的能力。

实施例2

对来自QUASAR2试验的患者的进一步分析已经导致了识别在25种卡培他滨/5-FU途径基因中的罕见基因变体和随后的DPYD和TYMS的外显子测序。进一步地，计算了该检验的敏感度、特异性和预测值。

a.在QUASAR2试验中评估FU毒性

i.患者和研究特性

如实施例1(a)(i)所描述使用QUASAR2研究。在2010年7月收集血液的1119位患者中，基于临床数据和知情同意的完整性来选择1046位用于基因研究。表2示出了患者特性。

ii.FU毒性评估

根据NCI不良事件常见毒性标准(CTCAE)3.0版本收集毒性表型数据作为QUASAR2的部分。对于以下个体FU相关毒性的每一个得出了在任何治疗周期的最大毒性(0-4)：腹泻，恶心和呕吐，黏膜炎/口腔炎，中性粒细胞减少，血小板减少和HFS。将总体毒性测量导出并定义为每一患者所测量的最高个体毒性得分。使用两种方法来分析总体和个体毒性：(i)二元分类为低毒性(等级0-2)与高(剂量限制)毒性(等级3-4)；和(ii)毒性定量测量。在后者中，假如<100位患者经历了特定的毒性等级，这些患者被组合到具有邻近等级的单仓。特别是，对于总体、腹泻和HFS为等级01v2v34，和对于其他为等级0v1234，分析罕见毒性表型。表3示出了等级的毒性数据。

在34％患者中发现有等级3+的总体毒性，10％具有严重的腹泻和24％具有HFS。对于其他的表型，严重的毒性较不常见，尽管有5位患者经历了等级4的中性粒细胞减少。

b.鉴定基因变体，以便检验卡培他滨毒性的关联

i.验证患者集

使用两种附加数据集来验证毒性关联。西班牙卡培他滨药物遗传学(SCP)研究由233位结肠直肠癌和乳腺癌患者组成，这些患者是由西班牙几个肿瘤学单位前瞻性招募的并用两种卡培他滨单一治疗方案中的一种进行治疗(标准：每3周第1-14天每日两次1250mg/m²；连续：每天每12小时口服800mg/m²)。根据CTCAT v3.0收集HFS和腹泻数据表4。

先前已描述了EPICOLON研究(Abuli A,et al.Carcinogenesis(Epub ahead ofprint)(2013)，通过引用并入本文)。包含在本分析中的85个EPICOLON案例是那些接受卡培他滨单一治疗的。由这些案例仅仅腹泻毒性数据是可利用的。

ii.基因型数据

对于QUASAR2，来自患者身体组织的DNA样本的基因型数据是由单核苷酸多态性(SNPs)和罕见编码遗传变体可得的，所述数据是使用标准方法进行分析的并经受标准质量控制程序以便消除不良性能样本和多态性(Dunlop MG et al.,Nat Genet.44(7):770-776(2012)，通过引用并入本文)。仅仅那些与主要成分分析上的CEPH CEU面板(panel)聚类的个体被包含在该研究。对于基于单倍型标签单核苷酸多态性(SNPs)的SNP阵列，940个患者的数据是可得的(484位来自于Illumina Hap300或Hap370CNV，364位来自于Hap610以及92位来自于Omni2.5)。对于外显子组阵列，其被设计为捕获不常见的蛋白编码变异，968位患者的数据是可得的，所述患者基因分型在Illumina HumanExome12v1_A or-12v1-1_A阵列。使用Illumina Genome Studio来执行所有平台的碱基读出，而对于外显子组阵列,另外通过Z-Caller(Goldstein JI et al.,Bioinformatics 28(19):2543-2545(2012)通过引用并入本文),基于对共同变体的读出与Illumina Genome Studio的一致性(99.3％)，应用7的z-得分。一些多态性存在于SNP阵列和外显子组阵列两者，并且这些变体的基因型一致性为99％。

在表5的25种候选卡培他滨/5-FU途径基因中，存在于一个或多个Hap300/370,Hap610或外显子组阵列上的且位于编码区域25kb内的变体均被鉴定。使用填补以得到由阵列内容差别引起的缺失基因型：采用SHAPEITv2定相(phase)单倍型(Delaneau O et al.,Nat Methods 10(1):5-6(2013),通过引用并入本文)并采用IMPUTEv2进行填补(Howie Bet al.,Nat Genet.44(8):955-959(2012)，通过引用并入本文),使用250kb缓冲区和1000基因组2012发布(所有种族渊源)作为参考组(reference panel)。仅仅对在每一阵列上单独具有至少0.95IMPUTEv2信息得分的SNPs通过SNPTESTv2进行进一步的分析(Marchini Jet al.,Nat Genet 39(7):906-913(2007)，通过引用并入本文)。进一步的排除标准是在来自于3个SNP阵列的合并得分上SNPTEST信息评分低于0.95的、次要等位基因频率低于0.01的和哈代—魏因贝格(Hardy-Weinberg)平衡p值低于0.0001的。基因分型和填补为分析提供了总计1456种基因变体。

对于SCP研究，通过Illumina Hap610平台，并使用质量控制措施和具有如上所述用于QUASAR2的SNPTESTv2的统计分析来执行基因分型，。对于EPICOLON，使用基因组扩增DNA上的KASPar来执行基因分型。

对于TYMS 5’VNTR和3’UTR变体的进一步基因分型是通过之前描述的方法来进行的(Horie N et al.,Cell Struct Funct.20(3):191-197(1995)；Dotor E et al.,J ClinOncol 24(10):1603-1611(2006)，二者通过引用并入本文)。DPYD 2846T>A和DPYD*2A的附加基因分型是通过KASPar(Cuppen E CSH Protoc 2007:pdb prot4841(2007)，通过引用并入本文)来进行的，对于未基因分型的少数患者使用外显子组阵列。

对于检测到基因变体与毒性显著关联的位置，使用上述方法来进行精细绘图研究，以便填补1.5Mb侧翼区域内的所有SNPs，其目的为了精炼关联信号。

ii.测序

根据特定的扩增子测序方案通过Roche/454Titanium GS FLX技术来进行DPYD和TYMS编码区域的测序(参见http://454.com/downloads/my454/documentation/gs-junior/method-manuals/GSJunior_Amplicon LibraryPrep-RevJune2010.pdf)。

特别地，选择具有最高水平5-FU相关毒性(“HiTox”)的100位患者，特别是在治疗的首次4个周期内腹泻等级为3或4的和/或是在治疗的首次4个周期内其他毒性等级为3/4的患者。还选择了在治疗的整个期间没有不良毒性事件(“LoTox”)的100位患者。使用来自外周血的DNA，设计PCR引物和反应以便覆盖所有的23种DPYD外显子(27种扩增子；4784bp)和7种TYMS外显子(9种扩增子；2276bp)。

使用PicoGreen对来自每一患者身体组织的DNA样本(Constitutional DNAsample)进行定量，稀释到相等的实测浓度并形成每个20位患者的10个库(pool)。然后对于36种扩增子的每一种均PCR扩增这些库。通过安捷伦高敏感度DNA试剂盒(Agilent HighSensitivity DNA Kit)来鉴定缺失的或不期望的扩增子。根据454方案通过PicoGreen对成功的扩增子进行定量，使成功的扩增子浓度相等并形成到一个100位患者HiTox库和一个100位患者LoTox库内用于测序。其目的是实现最小的读取深度(read depth)3000每一库的每一靶位置(即每一患者覆盖面约为30x)。

在HiTox库内鉴定错义DPYD变体p.Ala551Thr(A551T)。将包括该库的每一个体的DNA进行桑格测序以便鉴定携带这个变体的那些DNA。只发现了一个杂合子个体。为分析完整样本集，设计了KASPar(http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/ pdb.prot4841.abstract)等位基因特异单核苷酸变体引物以便检测A551T，以及在每次运行中包括已知变体样本的3重复以便促进基因型聚类。随后通过双向桑格测序来检查不与A等位基因纯合子聚类的所有样本。

iv.统计和计算分析

对于1456个SNP和外显子组阵列变体中的每一种，初级分析检验了总体(任何5-FU相关)剂量限制(等级012与34)毒性与基因型之间的关联。使用SNPTESTv2来实施在缺失数据线性或逻辑回归模型下的频率论检验。以年龄和性别作为协变量通过QUASAR2处理对样本进行分层。使用GWAMA(http://www.well.ox.ac.uk/gwama/download.shtml)对QUASAR2的两组(A分支中(卡培他滨)439位患者和B分支中(卡培他滨+贝伐单抗)501位患者)进行荟萃分析，包含分支间异质性检验。使用Bonferroni校正的p值阈值3.43x10^-5(＝0.05/1456)来表示(二元)总体剂量限制毒性初级分析的显著关联。

对于具有达到或接近形式显著性的关联信号的所选的SNPs，将附加SNPs填补到1.5Mb侧翼区域内。使用总体等级012与34测量对总体和具体毒性进行关联检验。由于基因分型和填补SNPs是非独立的，与填补SNPs的关联被声明是显著的，使用相同的阈值p＝3.43x10^-5。对于一种或多种SNPs在其内实现与总体毒性显著关联的任何区域，在最强关联SNPs处使用定量测量和QUASAR2中剂量延迟和减少临床可行的截断点来对基础的个体毒性进行调查(通常等级012对34，除腹泻等级为01对234外)。

使用R内逻辑回归分析来检验区域内变体的独立效果。最佳拟合模型确定成这样，其最小化赤池信息量准则(AIC)经受显示关联p＝0.05的变体。在PLINK中使用“—单倍-逻辑”和“—独立-效果”命令来进行单倍型分析(Purcell S et al.,American Journal ofHuman Genetics 81(3):559-75(2007)通过引用并入本文)。在PLINK中执行检查多基因变体的检验。在Stata中使用二元分类，将患者分为等级0/1/2或等级3/4总体毒性，通过ΣβiNi使用每一个体的基因得分来进行接受者操作特性(ROC)分析，其中其中βi为逻辑回归模型中与总体毒性显著相关联的第i个SNP的贝塔系数，以及Ni为所述个体在该位置携带有害等位基因的数目。

通过ANNOVAR来执行变体的功能注释。由Genevar(Yang TP et al.,Bioinformatics 26(19):2474-2476(2010)，通过引用并入本文)和The Cancer GenomeAtlas(TCGA)得到mRNA表达数据，其根据Qiyuan等人的方法进行分析(Li QY et al.,Cell152(3):633-641(2013)通过引用并入本文)。

对于测序数据，根据存在于HiTox和LoTox库中的变体的估计数目和野生型读数来确定与毒性的推定关联(Pearson’s Chi Squared或Fisher’s exact test)。

c.在DPYD位置与毒性的新关联

对于总体剂量限制毒性(等级012对34)的初级分析，使用Bonferroni校正p值阈值3.43x10^-5，进行分析以搜索基因变体与卡培他滨毒性之间的关联。这些分析鉴定了两种新的DPYD毒性SNPs。

发现了SNP rs12132152A-等位基因(freq.＝0.03)与总体卡培他滨毒性关联(OR_总体二元＝3.83,p＝4.31x10^-6；表6)。

rs12132152为DPYD下游的22kb的基因间SNP变体(chr1:97,523,004,b37)。当侧翼区域内的变体填补到这个标签SNP时，鉴定出SNPs具有略多的显著关联，尤其是rs76387818(chr1:97,539,400；OR_总体二元＝4.05,p＝2.11x10^-6,r² _标签＝0.98；表6；图4a)。当使用总体毒性定量测量时可得到相似的结果(表6)。

调查了包含总体毒性测量的个体表型。在定量和二元这两种模型下，rs12132152和rs76387818与HFS强烈关联(对于rs76387818,OR_hfsquant＝1.78,p＝5.51x10^-8,OR_hfsbinary＝6.44,p＝1.75x10^-8)，但不与其他的个体毒性关联。

进一步研究了rs12132152/rs76387818关联之下的计算机模拟(in silico)的可能功能机制。

检查了包含rs12132152和7种强相关SNPs(图4a:约为chr1:97,475,000-97,562,000,b37)的区域的ENCODE数据(http://genome.ucsc.edu/ENCODE/)。FAIRE和组蛋白K4甲基化数据表明了这是开放染色质区域并且一个尤其相关的SNP rs12123160位于甲基化的CpG。尽管没有来自正常肝脏的合适数据是可用的，发现了rs12132152和相关SNPs基因型不与在脂肪组织、类淋巴母细胞或皮肤中(Genevar数据库,p>0.13)(Nica AC et al.,PlosGenetics 7(2)(2011)，通过引用并入本文)或在结肠组织中(The Cancer Genome Atlas(TCGA),p＝0.72)的DPYD表达关联。

在SNP填补在rs7548189，DPYD基因内的tagSNP(chr1:97,867,713,b37)，周围的1.5Mb区域之后，鉴定了第二DPYD毒性关联变体(表6)。rs7548189与二元测量总体毒性边缘关联(OR_globalbinary＝1.67,p＝3.79x10^-5)。进一步研究表明了rs7548189与总体毒性的定量测量正式关联，并在二元和定量模型下与腹泻正式关联(OR_globalquant＝1.23,p＝6.82x 10^-6；OR_{diarrhoeaquant}＝1.18,p＝1.54x 10^-5；OR_{diarrhoeabinary}＝1.76,p＝1.72x 10^-5)。由表6可以看出，HFS也贡献了与总体毒性关联。在区域填补之后，发现rs12022243(r²with rs7548189＝0.95)与二元模型下的总体毒性正式关联(OR_globalbinary＝1.69,p＝2.55x 10^-5)。rs12022243显示了优秀的填补特性：在190个独立评估的个体中，仅仅4个(2％)基因型缺失并且所有的剩余基因型正确填补。

尽管存在着很少的来自于ENCODE数据的证据，该证据证明rs7548189是功能性的，rs12022243落在可能具有增强子活性的开放染色质的区域内。rs7548189不与淋巴母细胞、纤维母细胞、T细胞、脂肪组织或皮肤内Genevar数据库上的DPYD表达水平相关联(p>0.07)(Nica AC et al.,Plos Genetics 7(2)(2011)；Stranger BE et al.,Plos Genetics 8(4):272-284(2012)；Dimas AS et al.,Science 325(5945):1246-1250(2009)，每一均通过引用并入本文)，或不与来自TCGA的结肠组织内DPYD表达水平相关联(p＝0.97)。rs12022243不存在于这些数据库。

使用逻辑回归分析，发现了rs12132152和rs7548189/rs12022243信号二者均彼此间相互独立，并与已知的DPYD毒性变体*2A(rs3918290)和2846T>A(rs67373796)相互独立(图5b)。基于DPYD任一侧面25kb窗口内的81个标签SNPs的单倍型进一步分析并未提供rs12132152和rs7548189/rs120222243关联的进一步改进，并且没有显示附加的、独立的关联信号的证据。

d.改进在TYMS和ENSOF1位置的毒性关联

进行了分析以便解决TYMS处已知毒性关联的基础(表6)。这个分析鉴定了预测FU毒性的新的TYMS/ENOSF1SNP。

发现了SNP rs2612091的G-等位基因(freq.＝0.45)与总体毒性提高相关联(OR_globalbinary＝1.59,p＝5.28x10^-6；OR_globalquant＝1.19,p＝2.35x10^-6；表6)。rs2612091位于烯醇酶超家族成员的内含子内TYMS下游10kb处(ENOSF1,chr18:683,607)。精细绘图显示了对一SNP,rs2741171(chr18:700,687)在连锁不平衡中(r²＝0.73)与rs2612091稍强的关联,特别是对于总体毒性的定量测量(OR_globalquant＝1.2,p＝9.24x10^-7)。rs2741171变体进一步位于TYMS(27kb)的下游并再次是ENOSF1的内含子，但是两种SNPs落在位于整体TYMS和ENOSF1侧面的重组热点之间(图4b)。rs2612091/rs2741171对毒性的效果本质上由HFS驱使，具有使用定量测量观察到的特别强关联(rs2612091:OR_hfsquant＝1.21,p＝3.67x10^-7；rs2741171:OR_hfsquant＝1.23,p＝3.10x 10^-8)。

ENOSF1是似乎编码蛋白和TYMS反义的RNAs的大部分未表征的基因。已经被提出ENOSF1调节TYMS mRNA和/或蛋白表达(Dolnick BJ et al.,Cancer Biology&Therapy 2:364-369(2003)，通过引用并入本文)，因此使用Genevar和TCGA数据库对rs2612091基因型和TYMS和ENSOF1表达之间的关联进行分析。使用来自(Nica AC et al.,Plos Genetics 7(2)(2011)，通过引用并入本文)的白种人匹配的双数据，rs2612091G-等位基因显著降低双集合脂肪组织内ENOSF1表达(p_set1＝7.0x10^-4,p_tset2＝9.7x10^-6)，并显著降低一个集合淋巴样干细胞内ENOSF1表达(p_set1＝0.89,p_set2＝0.0012)。然而，rs2612091基因型不与TYMS表达关联(对于每一相同的分析p>0.30)。类似地，在来自(Stranger BE et al.,Plos Genetics8(4):272-284(2012)，通过引用并入本文)类淋巴母细胞表达数据中，rs2612091G-等位基因与ENOSF1表达降低相关联(p＝1.9x10^-6)，但不与TYMS表达降低相关联(p＝0.82)。在TCGA结肠数据中复制了这些结果，其中rs2612091G-等位基因再次与ENOSF1表达降低相关联(OR＝0.76,p＝1.5x10^-7)，而不与TYMS表达降低相关联(OR＝0.95,p＝0.45)。可以得出结论：ENOSF1最可能是rs2612091标签的功能变异的靶点，并且尽管ENOSF1和TYMS转录本是重叠的，这不通过TYMS的反义介导下调起作用。

检验了新的TYMS/ENOSF1毒性SNP与两种TYMS多态性(5’VNTR 2R/3R和3’UTR 6bpins-del)的关系(Schwab M et al.,J Clin Oncol.26(13):2131-2138(2008)；Lecomte Tet al.,Clin Cancer Res.10(17):5880-5888(2004)，二者均通过引用并入本文)，其中两种TYMS多态性以前已被报道改变TYMS表达并从而影响5-FU相关毒性(表7)。注意到rs2612091与5’VNTR、3’UTR多态性之间的适度LD(r²＝0.40和0.32；图5)，使用HFS定量测量(01v2v34)作为毒性表型检验了rs2612091信号是否独立于5’VNTR和3’UTR多态性，原因在于HFS构成了所有的3种变体观察到的总体毒性信号的基础。

首先，将该3种变体并入协变量-调节的逻辑回归模型中。当调节其他变量时，仅仅rs2612091依然保持显著关联(对于rs2612091OR_hfsquant＝1.21,p＝0.00049,5’VNTR p＝0.19,3’UTR p＝0.48)。在模型中单独使用rs2612091使AIC最小化。

第二，对变体间交互作用(异位显性)的证据进行了检验，但是发现rs2612091与5’VNTR(p＝0.92)或3’UTR(p＝0.19)之间不显著。这些分析表明了rs2612091和之前鉴定的变体不作为未鉴定变体的3-多态性标签而起作用，并且rs2612091更好的捕获所有3种变体创造的关联信号。

最后，对3-多态性单倍型中每一变体(表7)的独立性进行了检验。发现了rs2612091的G-等位基因始终增加毒性风险，而与5’VNTR或3’UTR基因型(p＝0.0021)无关。相反地，当变化其他两种SNPs的基因型时，5’VNTR(p＝0.17)或3’UTR(p＝0.61)风险-等位基因二者均不始终增加毒性风险。对包含rs2612091和5’VNTR或者3’UTR的2-多态性单倍型进行了重复分析。rs2612091基因型再次与HFS显著关联，而与5’VNTR(p＝0.00053)或3’UTR(p＝1.47x10^-6)基因型无关。使用总体毒性重复上述分析，结果是类似的，但是适度降低了显著性。

使用最高精细绘图SNP rs2741171的等同逻辑回归和单倍型分析显示了更强的证据，新的rs2612091SNP信号单独说明了TYMS/ENOSF1处的关联。在多变量逻辑回归模型中进一步检验了rs2741171,rs2612091,5’VNTR和3’UTR多态性的各种组合，并发现使AIC最小化的模型单独含有rs2741171。rs2741171紧挨着可能为p300结合位点的开放染色质的区域。

e.附加数据集的计算机模拟复制分析

在来自上述SCP研究的233位卡培他滨-治疗患者中检查了毒性与rs12132152,rs7548189和rs2612091之间的关联。由于这些患者选自高毒性和低毒性分布的极端值(表4)，因而没有进行正式的荟萃分析。而且，毒性的总体测量是不可得的，并且检验了与包括在QUASAR2患者中发现的总体关联信号的具体个体毒性(腹泻和/或HFS)的关联(表6和表8)。

ENOSF1/TYMS SNP rs2612091与SCP患者中HFS关联，其效果量与QUASAR2中的(OR_binary＝1.6,p＝0.012)类似。DPYD区域SNP，rs7548189与SCP研究中HFS关联(OR_binary＝1.7,p＝0.048)，但没有证据显示与腹泻关联(OR_binary＝0.78,p＝0.46)。进一步地，在来自于上述EPICOLON研究的85位卡培他滨治疗的患者中对rs7548189进行了检验(Abuli A,etal.Carcinogenesis(Epub ahead of print)(2013)，通过引用并入本文)，并发现了与严重腹泻关联的证据(OR_binary＝1.47,P＝0.020)。

在SCP集合中没有复制HFS与相对罕见DPYD SNP rs12132152之间的关联(表8)，其显示了与QUASAR2中观察到的效果的相反方向(OR_binary＝0.30,p＝0.025)。由于QUASAR2中rs12132152关联非常强烈，在SCP研究中缺少关联可能是由北欧和南欧人群之间的基因差异造成的。因此，确定了在1000个基因组GBR(UK)和TSI(Tuscan)数据集合中rs12132152周围1Mb区域的连锁不平衡结构。

发现了14种非编码罕见变体的集合，其彼此之间高度相关，并在GBR数据中与rs12132152，其最佳标签SNP，适度连锁不平衡(r²～0.5)，然而在TSI数据中显示了与rs12132152几乎不关联(r²<0.002)。所有的这14种变体已经舍弃了QUASAR2的填补质量控制检查，但代表了由rs12132152标签的潜在功能毒性变体。特别注意的是，这些变体种的3种(rs72724388,rs72724390和rs142652198)位于DPYD内含子内并作为体内未表征的反义mRNA(DPYD-AS1,chr1:97561479-97788511)的部分而被转录。

f.基于集合的检验

为确定在QUASAR2中是否存在着附加毒性关联的证据，其中该附加毒性关联还未达到个体SNPs或罕见变体的正式统计学显著性，基于变体集合进行了关联检验(表9)。之前报道的毒性变体和本发明的变体均被排除，即DPYD 2846,*2A变体,DPYD rs12132152,DPYDrs7548189和TYMS rs2612091，以及与这些SNPs连锁不平衡r²>0.1的区域(包括TYMS 5’VNTR和3’UTR多态性)。

使用错误发现率q＝0.05，在任何基因处或在变体集合整体中没有发现令人信服的附加关联的证据。然而，存在着TYMP位置处变体和HFS、腹泻之间关联的提示性证据(表9)。

g.鉴定DPYD和TYMS中新的、罕见易感变体

对DPYD和TYMS的编码区域测序鉴定了HiTox库内仅仅单一错义变体(DPYDc.G1651A；p.Ala551Thr；chr1:97981371)，该变体不存在于SNP和外显子组阵列上。在968位患者的全集合内也没有发现该变体的其他存在。该变体的每人的测序读出平均数目为70以及总变体读出频率为0.0035。通过SIFT,Polyphen,PhyloP和MutationTaster预测了这个变体(A551T)是强破坏性的。桑格测序鉴定了具有该罕见等位基因的单独患者，该患者经历了等级4的中性粒细胞减少和血小板减少。

数据库检索确定了所述变体之前已被报道为DPYD缺陷综合症的原因(OMIM612779)(Van Kuilenburg AB et al.,Biol Chem.386(4):319-324(2005)，通过引用并入本文)。已经确认了A551T不与任何其他的常见或罕见DPYD毒性变体连锁不平衡。

在19位任何周期具有极端(等级4)毒性的患者中，确定了他们在这3种毒性SNPs携带有哪种等位基因以及来自文献的罕见DPYD等位基因的它们的补集(complement)，包括在我们之前的荟萃分析中显示与5-FU毒性相关联的2846A>T和*2A(Rosmarin et al.,Journal of clinical oncology:official journal of the American Society ofClinical Oncology(2014),出版中,通过引用并入本文)(表10)。没有良好的证据显示这3种新毒性SNPs的风险等位基因在这19位患者中作为群组被过表达(表10)。使用Caudle等人的评估(Caudle et al.,Clinical pharmacology and therapeutics 94(6):640-5(2013)，通过引用并入本文)作为指南，由来自本研究的数据进行补充，评价了每一罕见DPYD变体对极端毒性的可能贡献。存在着不充分的现有证据(Caudle et al.,Clinicalpharmacology and therapeutics 94(6):640-5(2013)来把6种DPYD等位基因(*4,*5,*6,*9A,M166V and K259E)作为病原性的(表6)。检查严重毒性病例中这些多态性的基因型(表10)和检验二元总体毒性的关联(表11)与本观点并不矛盾。

几种其他的罕见DPYD等位基因(*3,*7,*8,*9B,*10,*11,*12)不存在于样本集合中。4种罕见DPYD等位基因被表示为严重功能毒性：*2A,2846T>A,*13and A551T。19位严重毒性患者中有5位(26％)携带这些DPYD等位基因的一种(表10)。在这5个病例中，有4个(80％)具有危及生命的骨髓毒性(G4中性粒细胞减少和血小板减少)，而其他的具有G4腹泻。具有G4中性粒细胞减少但不具有血小板减少的另一个体，不携带任何该4种DPYD等位基因。总之，对于预测严重骨髓抑制，罕见DPYD变体具有83％敏感性，99％特异性，29％阳性预测值和99.9％阴性预测值。

如同已经在杂合状态下与5-FU相关毒性建立关联的其他罕见DPYD变体(*2A和2846T>A)，已经显示了当作为纯合子或与另一突变等位基因的复合杂合子存在时，A551T引起隐性DPYD缺陷综合症(Schwab M et al.,J Clin Oncol.26(13):2131-2138(2008),通过引用并入本文)。对经历等级4中性粒细胞减少和血小板减少的患者中A551T的鉴定进一步支持了以下观点：引起DPYD缺陷综合症的罕见非同义DPYD变体，例如I560S和大约15种其他变体(Van Kuilenburg AB et al.,Biol Chem.386(4):319-324(2005)；Van KuilenburgAB et al.,Hum Genet.104(1):1-9(1999)；Van Kuilenburg AB et al.,Biochem J 364:157-163(2002),每一均通过引用并入本文)，极大增加了杂合子内5-FU毒性的风险。

进一步地，在经历等级4骨髓毒性的3位其他QUASAR2患者中——其中有2位是QUASAR2中仅有的毒性诱导死亡的——1位携带DPYD*2A，1位携带2846A>C和1位携带*13。在不发展严重毒性的带有罕见、功能毒性DPYD等位基因的12位携带者中，7位经受了等级3毒性并可能因此免受了卡培他滨剂量减少的严重毒性。因此，极端卡培他滨/5-FU相关毒性为可遗传的，这是看似合理的。

h.接受者操作特性(ROC)分析

为检验基于先前报道的卡培他滨毒性变体和本发明新鉴定变体的模型对预测5-FU毒性的性能，将QUASAR2数据集合和DPYD 2846T>A,DPYD*2A,DPYD rs12132152,DPYDrs7548189,DPYD p.Ala551Thr和TYMS rs2612091变体合并到ROC分析中以便预测总体等级012v34卡培他滨相关毒性。该模型检验了本发明的临床实用性。

分析了938位患者，对每一患者使用如下得分：

(每一多态性有害等位基因的数目)x(每等位基因的贝塔系数)

假设DPYD变体rs12132152,rs7548189and A551T是功能等同的，并从而为本分析的目的而将其结合到任何罕见功能等位基因对非罕见等位基因的检验中(OR＝7.6,p＝4.5x10-⁴)。发现曲线下面积(AUC)为0.66(95％CI 0.63-0.70)。在最大比例(69％)的患者被正确分类的截断点处，敏感性为27％(95％CI 23-33％),特异性为91％(95％CI 88-93％),阳性预测值为60％(PPV:95％CI 52-68％),和阴性预测值为71％(NPV:95％CI 68-74％)(图6)。

Claims

1.一种筛选受试者中5-氟尿嘧啶毒性风险的方法，包括筛选存在至少一种多态性的受试者，所述多态性选自：

a.选自由5'VNTR 2R/3R rs45445694、3'UTR 6bp ins-del rs16430和rs2612091组成的组的TYMS多态性；和/或

b.选自由*2A rs3918290、2846T>A rs67376798、rs12132152、rs12022243、rs7548189、p.Ala551Thr和它们功能等同的变体组成的组的DPYD多态性；

其中：

ii.与不具有所述至少一种多态性的受试者相比，所述至少一种多态性的存在表明了发生FU毒性的风险增加；和

iii.与具有所述至少一种多态性的受试者相比，阴性结果表明了发生FU毒性的风险降低。

2.根据权利要求1的方法，包括筛选存在TYMS多态性rs2612091和存在DPYD多态性*2Ars3918290、2846T>A rs67376798、rs12132152、rs7548189、p.Ala551Thr。

3.根据权利要求1的方法，包括筛选存在TYMS多态性5'VNTR 2R/3R rs45445694和3'UTR 6bp ins-del rs16430；和存在DPYD多态性*2A rs3918290和2846T>A rs67376798。

4.根据前述任一权利要求的方法，其中受试者为癌症患者。

5.根据权利要求4的方法，其中患者具有实性肿瘤癌症。

6.根据权利要求5的方法，其中患者具有结肠直肠癌(CRC)或乳腺癌。

7.根据前述任一权利要求的方法，其中受试者正在经历FU化疗。

8.根据权利要求7的方法，其中受试者正在经历卡培他滨单一治疗。

9.根据前述任一权利要求的方法，其中筛选针对来自患者的流体样品进行。

10.根据权利要求9的方法，其中所述流体样品为唾液、血清或血浆样品。

11.根据前述任一权利要求的方法，其中筛选针对来自患者的固体样品进行。

12.根据权利要求11的方法，其中所述固体样品来自活组织检查。

13.根据前述任一权利要求的方法，进一步包括在阳性结果的情况下检测受试者一种或多种FU毒性症状的步骤。

14.根据权利要求13的方法，其中一种或多种症状包括腹泻、恶心和呕吐、粘膜炎/口腔炎、骨髓抑制、中性粒细胞减少、血小板减少症和/或手足综合征(HFS)。

15.根据权利要求14的方法，其中一种或多种症状包括腹泻和/或手足综合征(HFS)。

16.根据前述任一权利要求的方法，其中筛选是通过逻辑回归进行的。

17.根据权利要求16的方法，其中遗传得分ΣβiNi被分配到每一个体，其中βi为逻辑回归模型中与总体毒性显著相关的第i个SNP的贝塔系数，以及Ni为所述个体在该位置携带有害等位基因的数目。