CN106459893A - 使从动物粪便纯化的球虫卵囊形成孢子的方法、用该方法获得的孢子化卵囊和含有这些孢子化卵囊的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使从动物粪便(5)纯化的球虫卵囊形成孢子的方法，所述方法包括提供纯化的卵囊作为支持表面(22)上的层(40)，将所述层至少间歇地维持于具有至少15％的相对湿度的含氧气体环境(60)中，并将所述卵囊的温度维持于19℃至37℃之间。本发明还涉及用该方法获得的孢子化卵囊并涉及含有此类孢子化卵囊的疫苗。

Description

使从动物粪便纯化的球虫卵囊形成孢子的方法、用该方法获 得的孢子化卵囊和含有这些孢子化卵囊的疫苗

总体发明领域

本发明涉及使从动物粪便纯化的球虫卵囊形成孢子的方法。本发明还涉及用该方法获得的孢子化卵囊和含有此类孢子化卵囊的疫苗。

发明背景

球虫病是遍及各种动物的疾病，其中球虫亚纲的原虫侵入并破坏肠粘膜。球虫病的经济影响在其中禽类的密集圈养有利于该疾病的传播的家禽业中可以是特别严重的。在大多数情况下，球虫原虫的感染是物种特异性的。然而，多个物种可以感染单一宿主。例如，感染鸡的球虫原虫有七种物种，其中六种被认为是中等至严重致病的。

球虫寄生虫的生命周期是复杂的。例如，艾美球虫属、等孢子球虫属、囊等孢子球虫属或隐孢子虫属的原虫通常仅需要单个宿主即可完成其生命周期，管囊等孢子球虫属可以利用中间宿主。在自然条件下，生命周期开始于从环境摄取孢子化卵囊。卵囊通常形状为卵圆形至椭圆形，长10-48µm，宽10-30µm，并且可以含有专门的结构，诸如极性帽、卵孔、残体和结晶体。当孢子化卵囊被易感动物摄入时，孢子化卵囊的壁破碎以便在内部释放孢子囊。在家禽中，孢子囊的释放是砂囊(gizzard)中的孢子化卵囊的机械破碎的结果。孢子囊内的是子孢子，其处于生物体的感染期。在家禽中，孢子囊外壳的破裂和子孢子的释放在生化上通过小肠中的胰凝乳蛋白酶和胆汁盐的作用完成。一旦释放，子孢子侵入肠粘膜或其它位置的上皮细胞。感染部位是所涉及物种特征性的。例如，在艾美球虫属中，柔嫩艾美球虫(E. tenella)位于盲肠；毒害艾美球虫(E. necatrix)发现于小肠的前部和中间部分；堆形艾美球虫(E. acervulina)和早熟艾美球虫(E. praecox)存在于小肠的上半部分；布氏艾美球虫(E. brunetti)存在于小肠下部、直肠、盲肠和泄殖腔；和缓艾美球虫(E. mitis)发现于小肠下部，而巨型艾美球虫(E. maxima)可见于任何这些生理位置。

一旦在宿主动物的细胞内，子孢子发育成多核分裂体，也称为裂殖体。分裂体的每个核发育成被称为裂殖子的感染体，其进入新细胞并重复此过程。在数目可变的无性世代之后，裂殖子发育成雄配子母细胞或雌配子。雄配子母细胞发育成许多雄配子，其进而使雌配子受精。然后在所得合子周围形成抗性外壳。成囊合子被称为卵囊，并且未孢子化地脱落于粪便中。受感染的禽类可以持续数天或数周将卵囊脱落于粪便中。在适当的温度和湿度条件下，卵囊通过孢子形成的过程变得具有感染性。然后易感禽类通过正常啄食活动或地面/窝内觅食摄取孢子化卵囊，而重复此周期。摄入活的孢子化卵囊是唯一的自然感染方式。被球虫原虫感染导致免疫力，随着鸟群的成员变得免疫，使得疾病的发病率随时间下降。这种球虫感染的自限性质在鸡和其它家禽中是众所周知的。然而，所赋予的免疫力是物种特异性的，使得球虫原虫的另一物种的引入将导致新的疾病爆发。

球虫原虫的卵囊壁为卵囊存活提供了非常有效的屏障。卵囊可以在宿主外存活许多周。在实验室中，完整卵囊对于pH、洗涤剂、蛋白酶、糖解和脂解酶、机械破碎和化学品（诸如次氯酸钠和重铬酸盐）的极端条件具有抗性。

目前使用两种方法来控制家禽中的球虫病。第一种涉及通过化学疗法控制。许多药物可用于控制家禽中的球虫病。由于引起疾病的物种很多，所以极少数药物针对所有物种都是有效的，但单一药物可以针对几个物种是有效的。在现代肉鸡生产中，例如，施用药物以控制球虫病是常规的。针对球虫病的预防用药的费用代表了显著的生产成本。

针对球虫病对禽类接种疫苗是化学疗法的替代方案。疫苗接种的一个优点是，其可以大大减少或消除施用抗球虫药的需求，因此降低家禽养殖者的药物成本，防止耐药株系的发展，并减轻消费者对药物残留的担忧。已经开发了许多方法来针对球虫原虫免疫家禽。已成功的方法都是基于施用活原虫的完全毒性株系或减毒株系。尽管已经使用了其它途径，但最常见的施用途径是口服。通常，通过直接口服施用入口或经由含活的孢子化卵囊的饲料或水的口服施用而对鸡接种疫苗。

无论哪种施用途径，用于生产球虫病疫苗的程序是相当类似的。简而言之，通过用球虫原虫的单一物种感染动物而产生球虫原虫。这些“种虫”在性质上经常是克隆的，即，源自单一生物体，以确保仅存在目标物种。种虫可以是野生型的，即，分离自野外，或者它们可以是早熟或减毒的株系。然后允许原虫在宿主中经历复制，其后，从动物、通常从排泄物收集原虫。减毒株系的使用通常导致更少卵囊从宿主动物脱落。在纯化过程的第一步骤中，如果需要的话，从稀释的排泄物分离包含肉眼可见的颗粒物质的粗级分。然后通过众所周知的技术（诸如盐浮选和离心）从稀释的排泄物分离原虫(以确保与卵囊的密度具有超过10％不同的密度的颗粒物质不会与卵囊一起纯化)。在收集时，原虫处于生命周期的非感染性卵囊阶段。为了变得有感染性并因此可用于疫苗，必须诱导卵囊以经历孢子形成。在艾美球虫属的成员中，孢子形成通常涉及在19℃至37℃、优选28℃左右(即27.5至28.5℃)在恒定通气下在重铬酸钾的1％至4％水溶液中孵育卵囊。取决于所使用的温度，孢子形成通常在12至48小时内完成，并且通常产率为40-60%(意味着最初存在的活卵囊中的40-60%被孢子化)。对孢子形成过程的监测通过对原虫的显微镜检查来完成。见于现有技术中的储存组合物通常包含重铬酸钾的水溶液。通常将孢子化卵囊储存于重铬酸钾的1至4％水溶液以防止细菌生长，但也可使用其它储存介质。

可用于预防球虫病的现有疫苗通常含有2.5％重量/体积溶液，并且含有大约1,600个卵囊(400个孢子化卵囊代表四种不同的物种)/剂量。目前市售的疫苗含有约0.016 μg重铬酸钾/卵囊至约0.16 μg重铬酸钾/卵囊。尽管广泛用于形成孢子和储存，重铬酸钾的几种特性，使得非常期望将其从生物制品中消除。重铬酸钾是一种强氧化剂，并且已报道影响呼吸系统、肝、肾、眼、皮肤和血液。其为已知的致癌物质，并且在处理时被视为危险废物。因为其高毒性，含有重铬酸钾的化合物尤其不适合于肠胃外施用。因此，从待施用于动物、特别是食用动物的材料的生产和储存中消除重铬酸钾将是非常有利的。

发明目标

本发明的一个目标是设计使球虫卵囊形成孢子的方法，所述方法至少减轻了已知现有技术方法的缺点，具体而言，提供了不依赖于重铬酸钾的存在、同时能够实现孢子形成的高产率(优选高于60％、更优选甚至高于80％)的方法。本发明的另一个目标是提供含有孢子化卵囊且无重铬酸钾的疫苗。

发明概述

为了实现本发明的目标，已设计了根据总体发明领域部分的方法，其中所述方法还包括提供纯化的卵囊作为支持表面上的层，将该层至少间歇地维持于具有至少15％的相对湿度的含氧气体环境中，并将卵囊的温度维持于19℃至37℃之间。

在现有技术方法中，孢子形成涉及在重铬酸钾的水溶液中在恒定通气下孵育卵囊。这提供了孢子形成起作用所需的必需的水、氧气和足够的温度。然而，申请人发现，与在如现有技术中所教导的水性环境中相比，将卵囊至少间歇地保持于气体环境中更好。据发现，以该方式，不需要重铬酸钾，条件是将卵囊保持足够湿润(高于15％，如Waldenstedt等人, 2001 Poultry science 80:1412-1415已知)，并将温度保持在足够水平。此外，孢子形成的产率可以显著增加至最高达80-100％的水平。其原因并不完全清楚，但可以与以下事实部分相关：在烧瓶中的水性环境中，即使连续通气，仍然存在显著量的通气不足的“死”空间。此外，连续通气导致烧瓶中的卵囊的连续显著翻滚，其对卵囊产生连续的机械负载。这可以解释部分活卵囊的丢失。此外，有可能，在通气水溶液中，可用氧的水平仍然太低，以致不利于大部分卵囊的孢子形成。

在任何情况下，申请人都发现，通过当卵囊以支持表面上的层的形式存在时使其经受气体环境，可以实现非常好的孢子形成，而无需任何重铬酸钾，条件是卵囊足够湿润并将卵囊的温度维持在19℃和37℃之间。温度可以具有19至37℃之间的任何值，即20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36℃或这些温度之间的任何值。关于湿度，尽管15％相对湿度的水平可足以支持孢子形成，但更高水平是优选的，因为这样一来，层中卵囊变得过于干燥的风险降低。因此，气体环境的相对湿度的水平可以具有任何以下值(％相对湿度)，其最高达且包括100％：16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。在100％的相对湿度，卵囊层上将形成薄水膜。申请人发现，此类薄层对孢子形成过程没有不利影响，只要通过扩散的气体运输(例如，由卵囊消耗的氧气和所得由卵囊产生的气体)可以跟上卵囊对气体的使用和/或产生。在本发明的意义上，此类水薄层因此仍然意味着卵囊层可以被认为有效地存在于气体环境中。

根据本发明，可以以足够产率获得孢子化卵囊，其中所述孢子化卵囊不含重铬酸钾的残余物，因此，基于此类卵囊的疫苗也不含该盐。

本发明还涉及含有可用如上文所述的双重筛分法获得的孢子化球虫卵囊的组合物，所述球虫卵囊具有Dmin和Dmax之间的尺寸，其中所述组合物含有具有Dmin和Dmax之间的尺寸的颗粒且所述颗粒具有与卵囊的密度不同的密度。

定义

从粪便纯化的卵囊组合物意味着从卵囊排泄于其中的粪便去除至少90％、特别是91、92、93、94、95%或更多的非卵囊材料。

肉眼可见的对象是可以不借助外物而用人眼看到的对象。通常，这意味着该对象具有至少约0.1mm的尺寸。

颗粒是可以归因于物理特性诸如体积和质量的局部微观或肉眼可见的对象。动物粪便中存在的典型颗粒是沙粒、淤泥颗粒、粘土颗粒、植物残渣(消化和未消化的)、油滴、细菌、病毒、砂砾、小鹅卵石（pebbels）等。

筛板的网眼开口等于适合该板中的实际开口的假想圆的直径。网状开口固有地为“大约”预定大小，因为具有多个网眼开口的表面无法被制备为所有开口都具有精确相同尺寸，并且还经受机械负荷(筛板上的质量、振动等)下的变化。网眼开口通常为大约预定大小的有效平均值。在这方面，网眼大小的“大约值X”意味着在实践中，开口的实际大小可以在X的0.9倍至1.1倍之间，特别是在X的0.95倍至1.05倍之间，优选在X的0.98至1.02倍之间变化。

对象以一个方向延伸意味着该对象至少部分以该方向延伸，优选基本上以该方向延伸，即，相比任何其它方向，该对象更多地以该方向延伸。

实施方案

在根据本发明的方法的第一个实施方案中，层的厚度低于10 mm。申请人发现，当层的厚度最多等于常规鸡粪的常规最大横截面尺寸(其为约10 mm)时，大部分的卵囊，如果不是几乎所有的话，可以形成孢子。申请人认识到，常规鸡粪的尺寸使得甚至在鸡粪底部的卵囊也可以在它们驻留的气体环境(即，常规鸡舍)中形成孢子。换言之，大约10 mm厚的层可以允许氧气的扩散，使得大部分的卵囊可以形成孢子。所述厚度可以甚至低于9 mm、8 mm、7mm、6 mm、5 mm、4 mm、3 mm、2 mm 或1 mm。通常，该层的厚度为0.5至5 mm之间。

在下一个实施方案中，支持表面是能够让水通过的穿孔板。在该实施方案中，卵囊层可以通过向该层提供水(例如，以薄雾、淋浴、喷雾和水流等形式)而保持湿润，但仍然，由于水可以通过穿孔板通过该层，则该层可以大体上根据本发明保留在气体环境中。在另外的实施方案中，支持表面具有大约卵囊的最小尺寸(Dmin)的网眼开口。据发现，如果网眼开口大约为Dmin，则具有Dmin的最小尺寸的任何卵囊在通过穿孔板时受阻，而具有小于Dmin的典型尺寸的细菌、病毒、蛋白絮和其它颗粒可以与水一起通过该板。这在形成孢子的同时提供了卵囊的额外清洗步骤。在现有技术方法中，任何细菌和病毒都与卵囊保留在烧瓶中。然而，原则上，如果待过滤的水性级分具有太多尺寸仅低于Dmin的非卵囊颗粒，则可达到临界情况，因为此类颗粒通常也有点受阻，并且因此可能作为污染保留于卵囊层中。然而，此类临界颗粒似乎不(合理地值得注意的)存在于各种动物粪便中，因此，使用大约Dmin的网眼大小似乎完全适合于将卵囊保持于支持表面上，同时更小的污染颗粒将通过该穿孔板。在又另外的实施方案中，支持表面具有大约10 µm的网眼开口。该大小的网眼开口似乎理想地适合于支持任何大小的卵囊层，即使例如待纯化卵囊的大小范围为长20-35 µm和宽20-30 µm。开口的大小，即10 µm，似乎合适于将各种大小的卵囊保持在支持表面上，并且仍然，低于10µm的任何“细微物”(通常为细菌、病毒或其它微生物)可通过使用水冲洗层来洗掉。

在一个实施方案中，支持表面是环形穿孔板的形式。在该实施方案中，该层可以在该板的内部或外部上提供。这允许相对大的表面可用于支持该层，而占用空间仍然比较低。在另外的实施方案中，穿孔板是转筒形的。以该方式，可以容易地提供卵囊在该层中的均匀分布，以保证整个层的环境相当。在又另外的实施方案中，将环形板部分置于一定体积水中，且部分置于气体环境中，所述气体环境被安装为其纵轴与该体积水的表面平行地延伸，且其中转动该板用于将该层至少间歇地维持于含氧气体环境中。以该方式，即使气体环境相对干燥，简单地因为卵囊间歇地通过该体积水，即可以将该层中的卵囊保持在高湿润水平，最高达100％。这似乎是提供本发明的两个主要要求的非常简单、但充分的方式：将卵囊至少间歇地保持于气体环境中并防止它们干燥。通过旋转转筒，该层中的卵囊部分在转筒在气体环境中的上部分中旋转，且部分在转筒在水性环境中的下部分中旋转。环形板在该体积水中的定位通常使得环形板的内部空间的最多达一半浸没于水中，或者甚至仅5-30％，或5-20％。优选地，旋转转筒，其rpm使得该层以10米/分钟(m/min)至40 m/min的速度(转筒的圆周速度)行进。低于该速度，可能层中的卵囊，在气体环境的湿度相对低时，变得太干，而高于40 m/min，卵囊可能面临太多的机械力并变得受损。对于具有80 cm的直径的转筒，相应的rpm水平为5 – 20 rpm。具体而言当与5-30％(如上文所示)的浸没水平结合以提供该层在气体环境中的足够持续时间，而同时防止该层在气体环境允许的相对湿度的整个范围内变得太干时，相应的圆周速度似乎是理想地合适的。

在一个实施方案中，将卵囊层提供于环形板的内表面上。该实施方案可以使得更容易将卵囊保持于支持表面上。尽管由于该层旋转通过该体积水，该层中的至少部分卵囊可离开该层，并且在该体积水中停留一会儿，最终通过旋转板再次拾取它们。

在另一个实施方案中，将该体积水保持在19℃至37℃之间的温度。在该实施方案中，使用水将卵囊的温度保持在足够的水平以支持孢子形成。优选地，将体积水保持在约28℃的温度，其为支持孢子形成的理想温度。

在又另一个实施方案中，卵囊形成孢子之后，向该层提供含有抗感染剂的另外的水性介质，此后洗涤该层以去除抗感染剂。在该实施方案中，可以去除剩余的污染物，同时该层仍然完整。在现有技术中，也已经描述了用抗感染剂洗涤孢子化卵囊，但为此，卵囊需要从其形成孢子的烧瓶中取出，并且在单独的洗涤过程中处理。

在其中支持表面是具有大约卵囊的最小尺寸(Dmin)的有效网眼开口的筛板的又另一个实施方案，通过以下方式提供薄层：收集含有球虫卵囊的动物粪便，将粪便稀释于水性介质中，并从稀释粪便分离包含肉眼可见的颗粒物质的粗级分，并收集含有卵囊的水性级分，经不同于所述支持表面的第一筛板筛分水性级分，所述第一筛板具有让卵囊通过的网眼开口，以获得包含卵囊的水性滤液和在所述第一筛板上的包含大于卵囊的颗粒的残余物，然后经所述支持表面筛分水性滤液。申请人发现，通过应用简单的两步筛分方法，可以从粪便的水性级分将卵囊纯化至足够水平。在第一筛分步骤中，可以去除比卵囊更粗的颗粒(通常为沙粒(sand grains)、砂砾(grit)和植物残渣)，而在第二个筛分步骤中，可以去除比卵囊更小的颗粒(通常为细菌、病毒颗、消化的植物残渣、蛋白絮(protein flocks)、油滴等)。可以(半)连续地应用筛分，且水性级分中存在的水的量相对于卵囊的量不与任何经济最大量相关：水最终通过第二筛板，而纯化的卵囊作为薄层残余物保留在该板上。以该方式，可以有效地使用水，以获得良好的筛分和清洁作用。

在本领域中，从未使用或者甚至建议筛分作为从粪便纯化球虫卵囊的方法。尽管已经使用筛分以便从粪便去除粗级分，但其从未用于获得纯化的卵囊。不受理论所束缚，这似乎存在几个原因。首先，用于纯化卵囊的常用方法都是基于使用卵囊的特定密度，因为可以理解的是，在粪便中，不存在具有与卵囊相同密度(即，具有与卵囊的密度最多10％、或甚至最多9、8、7、6、5、4、3、2或甚至低至1％不同的密度范围内的密度)的其它主要级分。因此，此类方法可导致产生足够纯的卵囊组合物。用筛分，无法区别具有不同密度的颗粒，而仅可区别具有不同大小的颗粒。这固有地导致这样的事实：用筛分，与卵囊在相同大小范围内、但具有另一密度的其它颗粒被作为额外污染并入卵囊级分中。因此，通常预期，用筛分无法将卵囊纯化至足够的水平。此外，卵囊不是完美球形，但通常形状为卵圆形至椭圆形。筛分非球形颗粒具有筛分操作的固有问题，其取决于颗粒相对于筛板所采取的取向。由于该取向无法控制，所以筛分经常不被认为是用于精确分级非球形颗粒的可行选项。最后，筛分经常导致所筛分颗粒上的高机械负荷，特别是当网眼大小在相同的粒径范围内时。对于生物物质，此类高机械负荷经常对于其活力是有害的(参见用于杀死细菌的常用French按压方法)。让申请人惊讶的是，所有这些无一阻止筛分成为从粪便纯化球虫卵囊并获得足以将卵囊用于有效疫苗中的纯度的好方法。

本发明现在将基于下面的附图和实施例进一步解释。

实施例

图1图示显示用于收集卵囊用于孢子形成的系统。

图2图示显示根据本发明的系统的一个实施方案。

图3图示显示用于根据本发明的方法或系统中的筛板的一个实施方案。

图4图示显示根据本发明的系统的另一个实施方案。

图5图示显示用作让纯化的卵囊形成孢子的支持物的筛板。

实施例1描述了关于根据本发明的方法的处理数据。

图1

图1图示显示这样的系统，其用于从宿主动物收集含有球虫卵囊的动物粪便，和从粪便分离包含肉眼可见的颗粒物质的粗级分，以及收集含有卵囊的级分用于进一步纯化。通常，制备卵囊用于进一步纯化的许多不同的方法是本领域已知的。可以在进一步纯化前使用任何一种此类方法或其组合。下面记载优选的方法。

首先，一旦宿主动物(通常为鸡)开始脱落生物体，就可以收集卵囊。最通常，将鸡养在笼子(1)中，并饲喂固体食物(2)和水(3)。从笼子收集粪便5，并丢弃含有其它物质(羽毛、稻草等)的废物流。一旦收集，就将粪便置于浆料罐6并与添加的水(7)混合。将所得稀释的粪便提供至筛9，所述筛9用于去除粪便中的粗物质，诸如石子、剃毛残渣、动物饲料残渣等。为此，该筛包括两个环形板筛，上游筛具有2mm的网眼开口，且下游筛具有125μm的网眼开口。丢弃所得残余物(11)，并收集滤液作为含有卵囊的水性级分10。

图2

图2图示显示根据本发明的系统20的一个实施方案。在该实施方案中，所述系统包含纵向管样壳体23，其具有两个内部筛板，即上游筛板21和下游筛板22。在该实施方案中，所述筛板根据普通的编织图案由编织的不锈钢线制成。将水性级分10(参见图1)提供至筛板21的顶部，以筛分该级分。该板具有的网眼开口允许卵囊通过以获得包含卵囊的水性滤液32和包含大于卵囊的颗粒的第一残余物31。将水性滤液32提供至第二筛板22的顶部，所述筛板具有阻碍卵囊通过该筛板的网眼开口。以该方式获得包含纯化的卵囊的第二残余物40和包含小于卵囊的颗粒的腰滤液(waist filtrate)42。

应当选择网眼开口的大小以有效收集期望形状的卵囊。例如，为了收集尺寸在15至25 µm之间的卵囊，第一筛板可以具有25 µm的网眼开口，且第二筛板可以具有约14 µm的网眼开口。在该情况下，由于网眼开口几乎完全对应于卵囊的大小，可能需要大量额外水(作为单独进料提供至筛板21的顶部)，以实际上使卵囊通过第一筛板。在另一设置中，例如为了收集尺寸在20至30 µm之间的卵囊，第一筛板可以具有40 µm的网眼开口，且第二筛板可以具有约15 µm的网眼开口。在又另一设置中，例如为了收集尺寸在10至40 µm之间的卵囊，第一筛板可以具有42 µm的网眼开口，且第二筛板可以具有约10 µm的网眼开口。在又另一个实施方案中，例如为了收集尺寸在12至48 µm之间的卵囊，第一筛板可以具有50 µm的网眼开口，且第二筛板可以具有约10 µm的网眼开口。

图3

图3图示显示用于根据本发明的方法或系统中的筛板21(网眼开口50 µm)的一个实施方案。在该实施方案中，筛板是转筒形式的环形板。将转筒可旋转地支持于轴25上，并在内部提供固定容器26。在使用中，将水性级分上样于容器26下方的该转筒的内侧，并旋转转筒，同时筛分水性级分。此外，在该筛分操作期间，将具有约28℃的温度的额外水性介质添加至转筒21的内侧。将水性滤液收集于容器27中。一行喷头28位于转筒上方。可以使用这些喷头将水添加至转筒，或者充当筛分时的润滑剂，或者在筛分已经结束之后，从转筒释放残余物并将其收集于容器26中。该容器可以通过使其经轴25滑动而移除。

图4

图4图示显示根据本发明的系统20的另一个实施方案，在该实施方案中，可以运行用于应用根据本发明的方法的半连续过程。该系统包含旋转筛91(具有150 µm的网眼开口)，其被壳体9包围。该筛和壳体对应于图1中的第9项。向该筛91中进料包含稀释的鸡粪便的水性级分8(参见图1，尽管该级分任选经2 mm筛预筛分)，用于从稀释的粪便分离包含肉眼可见的颗粒物质的粗级分。收集含有卵囊10的水性级分并将其进料至如壳体23’中存在的转筒形旋转筛21’(还参见图3)。如图3中所描述，该筛板具有50 µm的网眼开口并分离水性滤液11中包含卵囊的水性级分和包含大于卵囊的颗粒的第一残余物(未显示)。可以如上所述去除该残余物。将水性滤液11进料至旋转筛22’，该筛被容纳在壳体23”中。该筛22’具有10μm的网眼开口以阻碍卵囊通过该筛板，使得包含纯化的卵囊的残余物积聚在该转筒形筛板22’的内侧上。腰滤液(waist filtrate)12包含小于卵囊的颗粒，诸如任何细菌。

图5

图5图示显示用作让纯化的卵囊形成孢子的支持物的筛板。在该实施方案中，残余物40作为2.5 – 3.5 mm层积聚在筛板22(具有10μm的网眼开口)的内侧。将转筒形筛板22部分置于水体积(50；保持在28℃的温度)中，且部分置于气体环境60中，使得转筒的总周长的约20％低于水体积的水平。将转筒安装为具有纵向轴25，所述纵向轴25与该体积水的表面平行延伸。在孢子形成期间，旋转转筒，用于将层40间歇地维持于含氧的气体环境60中。将转筒以10-12 rpm旋转通过水50'。转筒内的气体环境的相对湿度为100％。据发现，以此方式，卵囊可以在48小时内形成孢子(几乎所有)。

实施例1

实施例1描述了关于使用图4的系统的根据本发明的方法的处理数据。在该系统中，使用小转筒形板，其具有40 cm的长度和80 cm的转筒直径(在图4的设置中可以有利地使用具有最多达2.80米的长度和最多达2.0米的直径的转筒)。该板具有根据普通织物编织的不锈钢线的网眼，其中网眼开口如结合图4所述。转筒以每分钟10-12转旋转。

收集日龄为26-31日的60只白来亨鸡(被艾美球虫感染)的粪便(每只鸡每天大约25克粪便)，与200升水混合，并且使用2 mm筛分离粗级分。将大约50升该混合物(含有约2,25 kg的粪便)上样入系统中，其中在筛分期间，将每分钟约5-10升的水添加至筛板21和22。这在筛分35分钟之后导致筛板22上约120克纯化的卵囊(含有估计量约85克非卵囊粪便颗粒(通常为细砂粒、淤泥和粘土颗粒)和约35克卵囊的组合物)，其中堆型艾美球虫(Eimeriaacervulina)的计算产率为大约81％，且巨型艾美球虫(Eimeria maxima)的计算产率为大约100％。使用传统的浮选和离心的方法，这花费约6小时，其中两个物种的典型产率为约50-60％。

任选地，取决于仍然存在的污染的量，可以通过将残余物混合于6％次氯酸盐(抗感染剂)溶液中并将其上样入转筒22而进行额外的洗涤步骤。以每分钟约5-10升连续添加水以去除次氯酸盐，并且在15分钟之后，残余物即可用于进一步处理。

如结合图5所描述的孢子形成之后，堆型艾美球虫的典型孢子形成率为85％，且巨型艾美球虫的典型孢子形成率为90％(参考使用重铬酸钾的传统方法的40％至最大80％的典型值)。这些孢子化卵囊可以作为如现有技术中已知的球虫病疫苗中的抗原。

Claims (17)

1.使从动物粪便(5)纯化的球虫卵囊形成孢子的方法，所述方法包括提供纯化的卵囊作为支持表面(22)上的层(40)，将所述层至少间歇地维持于具有至少15％的相对湿度的含氧气体环境(60)中，并将所述卵囊的温度维持于19℃至37℃之间。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述层的厚度低于10 mm。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述支持表面是能够让水通过的穿孔板。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述支持表面具有网眼开口，所述网眼开口的尺寸大约是所述卵囊的最小尺寸。

5.根据权利要求3和4中任一项所述的方法，其特征在于所述支持表面具有网眼开口，所述网眼开口为大约10 µm。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述支持表面是环形穿孔板的形式。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述穿孔板是转筒形的。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于将所述环形板部分置于一定体积水(50)中，且部分置于气体环境中，所述气体环境被安装为其纵轴(25)平行于该体积水的表面而延伸，且其中转动所述板用于将所述层至少间歇地维持于含氧气体环境中。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述转筒以10 – 40 m/min的圆周速度旋转。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其特征在于将所述卵囊层提供于所述环形板的内表面上。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其特征在于将所述体积水保持在19℃至37℃之间的温度。

12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其特征在于将所述体积水保持在约28℃的温度。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述卵囊形成孢子之后，向所述层提供含有抗感染剂的另外的水性介质，随后洗涤所述层以去除所述抗感染剂。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述支持表面是具有有效网眼开口的筛板(22)，所述有效网眼开口的尺寸大约是所述卵囊的最小尺寸，其特征在于通过以下方式提供所述薄层：收集含有所述球虫卵囊的动物粪便，将粪便稀释于水性介质(7)中，任选地从稀释粪便分离包含肉眼可见的颗粒物质的粗级分(11)，并收集含有所述卵囊的水性级分(10)，经不同于所述支持表面的第一筛板(21)筛分水性级分，所述第一筛板具有允许所述卵囊通过的网眼开口，以获得包含所述卵囊的水性滤液(11、32)和在所述第一筛板上的包含大于所述卵囊的颗粒的残余物(31)，然后经所述支持表面筛分所述水性滤液。

15.组合物，其含有可用根据权利要求14所述的方法获得的孢子化球虫卵囊，所述球虫卵囊具有Dmin和Dmax之间的尺寸，其特征在于所述组合物含有具有Dmin和Dmax之间的尺寸的颗粒，所述颗粒具有与所述卵囊的密度不同的密度。

16.经由根据权利要求1至14中任一项所述的方法获得的孢子化球虫卵囊。

17.疫苗，其含有根据权利要求16所述的孢子化卵囊或权利要求15的组合物。