CN106459858A - 电穿孔用电脉冲发生器和具备所述电脉冲发生器的电穿孔装置 - Google Patents

电穿孔用电脉冲发生器和具备所述电脉冲发生器的电穿孔装置 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于通过可效率良好地进行制造的规格来制造一种电穿孔装置，其为多级式电穿孔装置，可对应于对象物的阻抗的不同而将穿孔脉冲的电压在几十至几千伏特的广范围内进行切换调整，且可稳定地产生连续多次穿孔脉冲。本发明提供一种电穿孔用电脉冲发生器，其特征在于具有(A)n段的科克拉夫特‑瓦耳顿电路、以及在前述电路的输出侧连接的(B)分支合流电路，该分支合流电路包含：(b1)在高电压模式时开关关闭、在低电压模式时开关开启的切换开关，以及在其输出侧所串联的(b2)m1个串联m2并联的电容器的电路。

Description

电穿孔用电脉冲发生器和具备所述电脉冲发生器的电穿孔 装置
技术领域
本发明涉及一种具有穿孔脉冲发生机构和传输脉冲发生机构的多级式电穿孔用电脉冲发生器，其可对应对象物的阻抗的不同，将穿孔脉冲的电压在几十至几千伏特的极广范围内进行切换调整，且可稳定产生多次的穿孔脉冲。
此外，本发明涉及一种具备前述脉冲发生器的电穿孔装置、以及使用了前述装置的基因转移法。
背景技术
电穿孔装置，是用于实现通过电刺激而使对象细胞的细胞膜开启微细孔，并将DNA等核酸分子或药剂成分等，简便且有效率地转移入细胞内(电穿孔法(Electroporation))的装置。
特别地，在生命科学领域的研究开发现场，是将其视为用以使外源DNA或RNA等转移入细胞内的装置中极其重要的装置，且其是在许多领域中需求渐渐扩大的装置。此外，基于装置操作的容易处理性的观点、能够以较低的费用导入设备的装置的观点等，其是具有极高利用价值的装置，这也成为电穿孔的需求扩大的重要因素。
然而，伴随着电穿孔在产业技术领域中需求的增大，各领域开始期望可适用于各种现场的电穿孔装置的登场。即，伴随着电穿孔法的使用对象多用化，由于不同生物种或组织等导致适合转移对象的溶液(特别是溶液的电阻)的不同、细胞学性质(细胞大小、细胞膜特性等)大相径庭，因此期望出现一种可应对个别的转移对象施予合适化条件的电脉冲的装置。
特别是对象物的电阻(阻抗)的不同，会给予电穿孔的电条件很大影响。例如，对于哺乳类细胞等进行电脉冲处理时，由于通常的电穿孔缓冲溶液或培养溶液含有盐或缓冲成分，故施予电脉冲的对象物的阻抗会变得较低。因此，对于哺乳类细胞等进行电穿孔时，必须施予较为“低电压”的电脉冲(具有可使细胞开启微细孔的能量且是较为低电压的约几十至几百伏特的电脉冲)。
另一方面，对于细菌或酵母菌等进行电脉冲处理时，为了抑制细胞的损伤、保持感受态(形质转换效率)，必须在添加有甘油、醣类等的高阻抗的溶液(电阻高的溶液)中进行电穿孔处理。因此，对于细菌等进行电穿孔，必须施予“高电压”的电脉冲(约几百至几千伏特的高电压脉冲)。
为了对于高阻抗对象产生“几千伏特的电脉冲”以实现电穿孔，必须具有电源和专用电路，从而将输入电压升压并使其积蓄于电容器而产生高电压脉冲。
通常，为了使电荷积蓄于电容器而产生高电压电脉冲，对应于所需电压带的专用直流电源和充电用电路(电容器电路的充电所必需的电路：切换电路、升压电路、整流电路等的一系列电路结构)是必要的。
在此，在为产生高电压而将电容器串联的电路中，因电容量变小，对于输出脉冲的电压峰值的衰减变大的低阻抗对象物进行电穿孔时，会有无法确保充分的电容量的问题发生。即，若仅采用单纯的高电压发生电路，则在对于电阻低的对象物施予电压脉冲时，存在无法稳定且充分地产生多次脉冲的问题发生。
因此，若希望在同一装置内实现低电压脉冲的发生与高电压脉冲的发生，则在具有“充分确保电容量的几十至几百伏特的低电压脉冲用直流电源和充电电路”的同时，必须另外具有“几百至几千伏特的高电压用直流电源和充电用电路”，故会有制造成本大幅增加的问题发生。
此外，作为高耐电压电容器，虽考虑到成本层面而一般使用化学电容器，但市售的化学电容器充其量只达到耐电压450V、电容量560μF的程度，故在目前的情况下，难以低成本采购耐电压超过500V者。
特别地，所谓应对此高低的电压带而必需具有各种电源电路所带来的问题，在“多级式电穿孔装置”的制造中成为一大问题。
在此，多级式电穿孔装置，是指为了实现多级的电脉冲的发生从而使针对转移对象的转移效率和生存率这两方面均得到飞跃性地提升的装置。
具体而言，是指使连续施予高电压且短时间的电脉冲(下面称为穿孔脉冲或Pp)、以及低电压且脉冲宽度长的电脉冲(下面称为传输脉冲或Tp)的电穿孔法成为可能的装置。
如此多级方式的电穿孔装置，已由多个制造商在进行装置的制造销售。可列举例如内帕基因(NepaGene)株式会社制造的NEPA21电穿孔装置。此外，关于电穿孔电源的专利文献，可列举出专利文献1。(另外，专利文献1中，穿孔脉冲(poring pulse)是以穿孔脉冲(poration pulse)来表示，传输脉冲(transfer pulse)是以驱动脉冲(driving pluse)来表示。)
然而，多级方式的电穿孔装置，是已集成安装有“穿孔脉冲用电源电路”和“传输脉冲用电源电路”的至少两种电源电路的装置方式。
因此，多级方式的电穿孔装置，若想要实现可产生几十伏特的低电压～几千伏特的高电压的脉冲的装置，则除了这两种类的电源电路(几十至几百伏特用的穿孔脉冲用电源电路、传输脉冲用电源电路)之外，还必需进一步增设“几百至几千伏特用的穿孔脉冲用高电压电源电路”。
对于这一点，当进而增设专用的电源电路(直流电源和充电用电路)时，从制造成本的观点出发会成为一大问题。这是由于除了电源本身昂贵之外还需要由一系列的电容器充电用电路和所需的电容器电路所组成的电路结构的缘故。
进一步基于装置框架体内的省空间化(制品装置的小型化)的观点，增设另外的电源电路也是应该避免的问题。
另外，现行的多级方式电穿孔装置，只存在可产生低电压(几十至几百伏特)用的穿孔脉冲的装置。即，尚未实现一种可针对高阻抗对象(细菌、酵母菌等)的多级式电穿孔进行最适当电脉冲处理的电穿孔装置。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2013-198637号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
为了解决上述问题，本发明的目的在于以可效率良好地进行制造的规格提供一种多级方式电穿孔装置，其不仅可适用于低阻抗对象的生物种或细胞，而且还可适用于包括细菌、真核微生物等的高阻抗对象的广泛的生物种或细胞。
具体而言，本发明目的在于以可效率良好地进行制造的规格来制造一种电穿孔装置，该电穿孔装置是多级式电穿孔装置，其可对应于对象物的阻抗的不同而将穿孔脉冲的电压在几十至几千伏特的广范围内进行切换调整，且可稳定地产生连续多次的穿孔脉冲。
解决问题的手段
本发明人等经过反复深入研究的结果发现：通过将穿孔脉冲发生用电源电路设成为“n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路”、以及在前述电路的输出侧连接“分支合流电路(其包含：高电压模式时变为开关关闭、低电压模式时变为开关开启的切换开关，以及在其输出侧所串联的m1个串联m2并联电容器电路)”而成的电路，能够实现一种穿孔脉冲发生用电源电路，其中，即使在仅使用一组直流电源和电容器用充电电路时，也可将几十至几千伏特的极广范围的穿孔脉冲稳定而连续地进行多次输出。
本发明就是基于上述发现而获得，具体涉及如下发明。
[1]
一种电穿孔用电脉冲发生器，其特征在于，其具有穿孔脉冲发生机构和传输脉冲发生机构，其中，作为穿孔脉冲发生机构具有：
(A)n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(n表示2以上的任一整数)；以及，
(B)由前述(A)所述的电路的输出侧的配线的分支点进行分支的电路，其中，(B)包含：
(b1)切换开关，其高电压模式与低电压模式的切换电压值为200～1400V的范围中的任一电压值，且在高电压模式时变为开关关闭、在低电压模式时变为开关开启；以及，
(b2)将m1个电容器串联而成的构件进行m2并联得到的电路(m1表示1以上的任一整数，m2表示2以上的任一整数)；
并且，(B)是，
前述(b1)所述的开关与前述(b2)所述的电路以串联方式进行连接，且前述(b2)所述的电路的输出侧的配线，通过前述分支点而在输出侧与前述(A)所述的电路的输出侧的配线进行合流而成的电路。[2]
如前述[1]所述的电脉冲发生器，其中，前述(B)所述的电路，在该电路内的前述(b2)所述的电路的输出侧，包含电流流向输出侧而连接的二极管。
[3]
如前述[1]或[2]所述的电脉冲发生器，其中，构成前述脉冲发生器的电路元件的电容器，是耐电压500V以下的电容器。
[4]
如前述[1]～[3]中任一项所述的脉冲发生器，其中，前述高电压模式与前述低电压模式的切换电压值，是500～1000V的范围中的任一电压值。
[5]
如前述[1]～[4]中任一项所述的脉冲发生器，其中，构成前述穿孔脉冲发生机构的电路，是仅具有一组穿孔脉冲发生用的直流电源和电容器充电用电路，并且，在高电压模式中前述(A)所述的电路的耐电压是1500～5000V的范围中的任一值，并且，在低电压模式中前述(A)所述的电路与前述(b2)所述的电路的合计电容量是500～4000μF的范围中的任一值。
[6]
如前述[1]～[5]中任一项所述的电脉冲发生器，其中，前述(A)所述的电路中的整数n是4～13的范围中的任一整数，并且，前述(b2)所述的电路中的整数m1是2～6的范围中的任一整数，并且，前述(b2)所述的电路中的整数m2是2～10的范围中的任一整数。
[7]
如前述[1]～[6]中任一项所述的电脉冲发生器，其中，前述脉冲发生器具有输出电压的极性切换控制机构。
[8]
如前述[1]～[7]中任一项所述的电脉冲发生器，其中，前述脉冲发生器具有输出脉冲的脉冲控制机构。
[9]
一种电穿孔装置，其特征在于，具备前述[1]～[8]中任一项所述的电脉冲发生器。
[10]
一种基于电穿孔法进行的外源基因转移法，其特征在于，使用前述[9]所述的电穿孔装置。
发明效果
基于本发明，能够通过可以效率良好地制造的规格来制造一种电穿孔装置，其特征在于，其是多级方式电穿孔装置，可对应于对象物的阻抗的不同而将穿孔脉冲的电压在几十至几千伏特的广范围内进行切换调整，且可稳定地产生连续多次的穿孔脉冲。
由此，本发明能够通过可以效率良好地制造的规格来提供一种多级方式电穿孔装置，其不仅可适用于低阻抗对象的生物种或细胞，还可适用于包含高阻抗对象的细菌·真核微生物等的生物种或细胞。
此外，本发明的穿孔脉冲发生用电源电路即使是由简单的电路来构成，也可制造高性能的多级式电穿孔装置。此外，还可期待通过省空间化而达到小型化。
此外，通过使用本发明的装置，对于低阻抗和高阻抗对象的双方的生物种或细胞，也皆可实现基因转移效率极良好的外源基因转移。
附图说明
图1是表示本发明的电源电路的一种方式的构成图。
图2是表示2段的科克拉夫特-瓦耳顿电路的电路结构的图(C为电容器，D为二极管)。
图3是表示倍压整流电路的电路结构的图(C为电容器，D为二极管)。
图4是表示本发明的穿孔脉冲用电容器电路的一个例子(使用了8段科克拉夫特-瓦耳顿电路以及2个串联4并联电容器电路的例子)的电路图(C为电容器，D为二极管，S为切换开关，R为电阻)。
图5是表示本发明的传输脉冲用电容器电路的一个例子的电路图(C为电容器)。
图6是表示本发明的电穿孔装置的输出波形的一个例子的模式图(输出穿孔脉冲3次、极性切换穿孔脉冲3次、传输脉冲3次、以及极性切换传输脉冲3次的4级脉冲的输出例子)。
图7是表示使用制造例1所制作的电穿孔装置以高电压模式输出穿孔脉冲的示波图的图(该图是输出了3级脉冲的结果)。
图8是表示使用制造例1所制作的电穿孔装置以高电压模式输出穿孔脉冲的示波图的图(该图是输出了4级脉冲的结果)。
图9是表示使用制造例1所制作的电穿孔装置以低电压模式输出穿孔脉冲的示波图的图(该图是输出了3级脉冲的结果)。
图10是表示使用制造例1所制作的电穿孔装置以低电压模式输出穿孔脉冲的示波图的图(该图是输出了4级脉冲的结果)。
图11是表示针对电极杯电极的外观进行摄影而得到的影像图(31:1mm空隙电极杯电极，32:2mm空隙电极杯电极，33:4mm空隙电极杯电极)。
具体实施方式
本发明是以本申请人于2014年7月28日在日本提出申请的日本特愿2014-152730为基础，参照其全部内容而整合于本申请。
下面，详细说明本发明的实施方式。下面说明中的标记符号编号，意思是指附图中所使用的标记编号。
本发明涉及一种具有穿孔脉冲发生机构和传输脉冲发生机构的多级方式电穿孔用电脉冲发生器，其可对应于对象物的阻抗的不同而将穿孔脉冲的电压在几十至几千伏特的极广范围内进行切换调整，且可稳定地产生连续多次的穿孔脉冲的电穿孔用脉冲发生器。此外，本发明涉及一种具备前述脉冲发生器的电穿孔装置、以及使用了前述装置的基因转移法。
[多级式电穿孔法]
多级式电穿孔法，是指连续施予高电压且脉冲宽度短的电脉冲(下面称为穿孔脉冲或Pp)、以及低电压且脉冲宽度长的电脉冲(下面称为传输脉冲或Tp)的多级的电穿孔法。
特别地，对于哺乳类等细胞的基因转移法，已知其是可使对于转移对象的基因转移效率得到飞跃性提高的优异手段。然而，传统技术中，因处理高电压电源电路的制造技术上的问题，而无法实现可适用于高阻抗对象且多级式的电穿孔装置。
此外，在电穿孔法的电脉冲处理中，因生物种或细胞种的不同，而导致适合转移对象的溶液不同、细胞学性质(细胞大小、细胞膜特性等)大相径庭，故必须对于各种转移对象个别进行合适化条件的电脉冲处理。
因此，对于必须以高电压脉冲处理的高阻抗对象的生物种(细菌、真核微生物等)，该多级式的电穿孔法实际是否有效并不明确。此外，对于高阻抗对象的生物种或细胞实际进行电穿孔处理时，关于应设定怎样的电脉冲条件等信息也一概不清楚。
[穿孔脉冲发生机构]
本发明的电穿孔用脉冲发生器，包含“穿孔脉冲发生用机构”。
“穿孔脉冲”(Poring pulse)，是指在多级式电穿孔法中，具有将转移对象的细胞膜开启微细孔之作用的高电压且短脉冲宽度的电脉冲。
穿孔脉冲的波形形状，可以是矩形脉冲、指数矩形脉冲中的任一种。
当转移对象是低阻抗对象物时，虽只需要几十至几百伏特的输出机构即可充分得到必要的电场强度(V/cm)，但另一方面，若是高阻抗对象物时，则存在需要几千伏特的输出机构的情况。
本发明的脉冲发生器的穿孔脉冲发生机构，是将穿孔脉冲发生用的直流电源、电容器充电用电路、以及电容器电路作为实质的构成元件而组成电源电路。另外，该电源电路中，只要不妨碍该电路的机能，也不排除设定为包含其他电路元件或机能电路的构成方式。
此外，虽然该穿孔脉冲发生机构，只要包含一组直流电源和电容器充电用电路的方式，即可实现产生连续多次几十至几千伏特的广范围的穿孔脉冲，但并不排除使用另外的电源或充电用电路的方式。
在此，穿孔脉冲发生用的直流电源(DC电源：符号1)，是为了得到产生穿孔脉冲的电压峰值而专用控制的直流电源。该直流电源(符号1)的输出侧，是由“电容器充电用电路”连接而成的。
该电容器充电用电路，可列举出：将从直流电源(符号1)输出的直流转换为矩形波(交流)的电路、将矩形波(交流)升压的电路等。
例如，可列举：在直流电源(符号1)的输出侧连接转换电路(符号2)，并在其输出侧与脉冲变压器(符号3)以串联关系连接的构成。在此，转换电路(符号2)是将从直流电源(符号1)输出的直流转换成矩形波(交流)的电路。此外，脉冲变压器(符号3)是将矩形波(交流)升压的电路。
基于该电路结构，穿孔脉冲用的“电容器充电用电路”所输出的电压，是作为输入n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)前的电压峰值，被调整成为相符的值而成的。
另外，该电路结构，因成为“电容器电路”的n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)本身具有整流作用，在脉冲变压器(符号3)输出后无需使用另外的整流电路。此点，是采用科克拉夫特-瓦耳顿电路的优点。
[科克拉夫特-瓦耳顿电路]
该电容器充电用电路的输出，是输入至n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)。
该穿孔脉冲发生用电源电路中n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)，是作为高电压模式时的“电容器电路”而发挥机能。此外，低电压模式中，是发挥“电容器电路”与“电容器充电用电路”这两者的机能。(虽后面也有描述，但作为本发明的穿孔脉冲发生用电路的特征，是在低电压模式用时也将n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)作为电容器充电用电路的一部分发挥机能。)
在此，“科克拉夫特-瓦耳顿电路”(下面有时称为CW电路)，是将电路元件电容器与二极管进行组合所构成的升压整流电路的一种。n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路的情形，是在将n个串联的电容器进行2并联而成的电路中，以二极管为介连接而成的电路结构。在此，n表示2以上的整数。(图2是2段科克拉夫特-瓦耳顿电路；图4(符号4)是8段科克拉夫特-瓦耳顿电路。)
作为该科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的电路元件的电容器，虽无特别限制，但考虑到装置制造上的生产效率的提高，优先使用市售的化学电容器。特别地，适用耐电压500V以下，优选为耐电压450V以下者。
另一方面，作为其下限，虽可列举为输入电压的2倍以上的耐电压，但以使用高耐电压者为佳。例如，适用耐电压100V以上、优选为耐电压200V以上、更优选为300V以上、特别优选为360V以上者。
具体而言，从较容易作为市售品而获得的角度出发，可适用耐电压300V～450V、优选为360～450V。
另外，使用市售的低耐电压电容器(以及二极管)，即可实现如此的高电压发生电路，是使用n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的优点。
在此，n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路的耐电压，在使用耐电压和电容量相同的元件电容器组合电路时，会成为该元件电容器耐电压的“n倍”。此外，n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路的电容量，会成为该元件电容器电容量的“2/n倍”的电容量。
另外，该科克拉夫特-瓦耳顿电路所使用的元件电容器，虽适用耐电压和电容量相同的元件电容器，但也包含将耐电压和电容量不同的电容器进行组合使用的方式。
作为该n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)，只要不脱离穿孔脉冲的输出电压的范围内的耐电压并且可确保充分的电容量，可采用任何整数值作为“n段”的数。
该“n段”的数，只要是2以上的任一整数即可，但优选只要在可确保下述耐电压和电容量的范围中的值即可合适地采用任何段数。
具体而言，n段数的值可列举：4以上，优选为5以上，进一步优选为6以上，更优选为7以上，特别优选为8以上。
作为上限可列举例如：48以下，优选为36以下，进而优选为24以下，更优选为20以下，特别优选为16以下，进一步优选为15以下，再更优选为14以下，再特别优选为13以下，再进而优选为12以下，再进而更优选为11以下。
可列举例如：4～13，优选为4～12，进一步优选为5～11，更优选为6～10，特别优选为7～9。
该n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的耐电压，适合例如1500V以上，优选为1800V以上，进一步优选为2000V以上，更优选为2200V以上，特别优选为2400V以上。
作为上限，只要不脱离作为高电压模式的穿孔脉冲的输出电压的范围即可，可列举例如：5000V以下，优选为4600V以下，进一步优选为4200V以下，更优选为4000V以下，特别优选为3800V以下，再进而优选为3600V以下，再更优选为3400V以下，再特别优选为3200V以下。
此外，该n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的电容量，若要想输出上述耐电压的范围的电压作为穿孔脉冲，则必须是例如20μF以上，优选为30μF以上，进一步优选为40μF以上，更优选为50μF以上，特别优选为55μF以上。当对象物为高阻抗对象物时，虽然输出脉冲的电压峰值的衰减难以发生，但为了可连续产生充分次数的多次脉冲，必须达到某程度以上的电容量。
虽该电容量的上限越高越好，但可列举例如：500μF以下，优选为470μF以下，进而优选为450μF以下，更优选为400μF以下，特别优选为300μF以下，进一步优选为220μF以下，再更优选为200μF以下，再特别优选为150μF以下，再进一步优选为120μF以下，进而更优选为100μF以下，进而特别优选为80μF以下。
此外，作为一例，元件电容器的使用如下述表所示时，下表中示出了其组合科克拉夫特-瓦耳顿电路的情况下耐电压值与电容量的关系。
另外，下述表1、表2所示的各数值，是可作为数值范围的上限下限的根据进行记载的数值。(表中的“CW电路”，是“科克拉夫特-瓦耳顿电路”的简称。)
表1
表2
[分支合流电路]
该穿孔脉冲发生用电源电路，其特征在于n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的输出侧，具有规定的分支合流电路。
该“分支合流电路”，具体而言，是指从n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的输出侧的配线的分支点进行分支的电路，其含有规定的“切换开关”(符号5)和“m1个串联m2并联电容器电路”(符号6)，并且它们被连接成为串联关系，在前述分支点的输出侧中，“m1个串联m2并联电容器电路”(符号6)的输出侧的配线与n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的输出侧的配线再次合流的电路。
另外，在该电路中，只要不妨碍该电路的机能，也不排除形成包含其他的电路元件或机能电路的电路结构的方式。
该分支合流电路，是本发明的电源电路的特征部分。另外，上述n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)与m1个串联m2并联电容器电路(符号6)之间，若仅是形成单纯并用组合的电路结构，则无法得到规定的电压，从而无法达成电容器的充电。
例如，来自脉冲变压器(符号3)的输出，不经过n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)，而仅在m1个串联m2并联电容器电路(符号6)直接进行分流，则无法达成该电容器的充电。此时，为了得到低电压模式的电压发生所需的电压，则必须有另外的升压电路。此外，也有应对需要而必须有高电压用的直流电源的情况。进一步，会另外必须具有将矩形波整流的整流电路。
·高电压模式/低电压模式切换开关
该电路中“切换开关”(符号5)，是有关穿孔脉冲的高电压模式与低电压模式的切换机能的开关。具体而言，其是在高电压模式时开关关闭而在该切换电压值以下(或者未达到)的低电压模式时开关开启的切换开关。
该切换开关(符号5)需要是针对m1个串联m2并联电容器电路(符号6)的输入侧进行连接的电路结构。若在m1个串联m2并联电容器电路(符号6)的输入侧未配置该切换开关(符号5)，则无法发挥本发明的电源电路的机能。
·m1个串联m2并联电容器电路
“m1个串联m2并联电容器电路”(符号6)，是作为穿孔脉冲的低电压模式时的“电容器电路”而发挥机能的电路。其是指将元件电容器m1个串联后的构件进行m2并联的电路。
另外，输入该电路(符号6)的电压，是从前述n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)所输出的直流电压，且是由脉冲变压器(符号3)的矩形波(交流)进行整流后的电压。
作为该电路(符号4)的电路元件的电容器，虽无特别限制，但考虑到装置制造上的生产效率的提升，优选使用市售的化学电容器。特别地，适用耐电压500V以下，优选为耐电压450V以下。另一方面，作为其下限，虽优选使用高耐电压，但适用耐电压100V以上，优选为耐电压200V以上，更优选为300V以上，特别优选为360V以上。
具体而言，从较容易作为市售品而获得的角度出发，可适用耐电压300V～450V、优选为360～450V。
在此，m1个串联m2并联电容器电路(符号6)的耐电压所使用的元件电容器，虽使用耐电压和电容量相同的元件电容器为佳，但也容许将耐电压和电容量不同的电容器进行组合使用的方式。
该m1个串联m2并联电容器电路(符号6)，只要不脱离作为低电压模式的穿孔脉冲的输出电压的范围的耐电压、并且可确保充分的电容量即可，串联数的“m1”和并联数“m2”的数，可采用任何整数值。
作为该串联数所示“m1”的数，具体而言，虽只要是1以上的任一整数即可，但可列举出：优选为2以上，特别优选为2～6，进一步优选为2～5，更优选为2～4。(另外，当m1为1时，是在元件电容器的耐电压十分大的情况下的可能方式，而此时是单纯的并联电容器电路。)
此外，作为该并联数所示的“m2”的数，具体而言，虽只要是2以上的任一整数即可，但可列举出：优选为2以上，进一步优选为3以上，特别优选为4以上。
作为其上限，可列举例如：20以下，优选为15以下，进而优选为12以下，更优选为10以下，特别优选为8以下，进一步优选为7以下，进而更优选为6以下。
可列举例如：2～20，优选为2～15，进一步优选为2～10，更优选为2～9，特别优选为3～8，进而更优选为4～7，进而特别优选为4～6。
在此，低电压模式的耐电压，例如，适合为200V以上，优选为300V以上，特别优选为400V以上，进一步优选为500V以上，更优选为600V以上。
作为其上限，虽只要不脱离作为低电压模式的穿孔脉冲的输出电压的范围即可，但可列举出：1400V以下，优选为1200V以下，更优选为1000V以下，进而优选为900V以下。
此外，对于该m1个串联m2并联电容器电路(符号6)的电容量而言，只要是充分的电容量，从而在低电压模式中对于低阻抗对象输出电脉冲时达到以产生连续多次的脉冲为目的之充分的电容量(后述的n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)与m1个串联m2并联电容器电路(符号6)的合计电容量)即可。
该电容量，可列举例如：500μF以上，更优选为600μF以上，特别优选为700μF以上，进而优选为800μF以上。
此外，电容量的上限虽越高越好，但可列举例如：4000μF以下，优选为3000μF以下，进一步优选为2500μF以下，更优选为2000μF以下，特别优选为1500μF以下，再进一步优选为1200μF以下。
另外，该m1个串联m2并联电容器电路(符号6)中，只要不妨碍该电路的机能，并不排除形成为包含其他的电路元件或机能电路的电路结构的方式。例如，也可以设定为组合有电阻等的电路。
此外，该m1个串联m2并联电容器电路(符号6)，通过对应用途设定为规定的配置中组合有二极管的方式，也可变形为低段数的科克拉夫特-瓦耳顿电路的电路。在此，低段数的科克拉夫特-瓦耳顿电路，可列举出：段数为2～4、优选为2～3左右。
·电流控制用电路元件
此外，该分支合流电路，优选在m1个串联m2并联电容器电路的输出侧包含电流控制用电路元件。在此，作为电流控制用电路元件，具体而言，可列举出在输出侧以电流流向连接的“二极管”(符号7)。
该二极管(符号7)，是指半导体二极管(PN结型二极管、肖特基结型二极管等)。此外，为了确保二极管的耐电压，也可将两个以上的二极管以串联关系连接使用。
基于该二极管(符号7)的作用，在低电压模式中，可实现m1个串联m2并联电容器电路(符号6)与n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的施加电压的累加输出。
[高电压模式/低电压模式的切换]
该穿孔脉冲发生用电源电路，具备高电压模式/低电压模式切换机构。在该电路中，具体实现高电压模式/低电压模式切换的电路元件，是上述的切换开关(符号5)。
作为高电压模式/低电压模式的切换指标的电压值，可对应装置的规格而设定为规定的电压值。
例如，作为高电压模式/低电压模式的切换电压值，可设定为200～1400V，优选为300～1200V，特别优选为400～1100V，进一步优选为500～1000V，更优选为600～900V，更进一步优选为700～900V的范围中的任一电压值。
例如，若设定切换电压值为800V，则在输出超出该值(或者该值以上)的电压时就会成为高电压模式。此外，在输出该值以下(或者未达到该值)的电压时则会以低电压模式输出。
·高电压模式下的输出
在高电压模式的情况下，切换开关(符号5)变成关闭的状态。此时，m1个串联m2并联电容器电路(符号6)未充电，仅n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)充电。因此，在高电压模式下，利用积蓄于n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)中的电荷来输出电脉冲。
针对n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路所输入的矩形波(交流)，在该电路(符号4)的输出端，通过升压并整流为输入峰值的“2n倍”的直流电压而输出。
例如，由脉冲变压器(符号3)输入50～200V的矩形波(交流)时，来自8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的输出，会得到800～3200V的直流电压。
作为以高电压模式可输出的电压上限值，可以是上述n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的耐电压下的输出电压。特别地，作为上限的电压值，可设定高电压模式下可输出的上限值为1500～5000V、优选为1800～4600V、进一步优选为2000～4000V、更优选为2200～3600V、特别优选为2400～3200V的范围内的任一电压值。
另一方面，在高电压模式下的输出下限值，必然会成为上述高电压模式/低电压模式的切换指标的电压值。
高电压模式下可输出的脉冲宽度，可以是0.01～100毫秒、优选为0.05～75毫秒、进一步优选为0.1～50毫秒、更优选为0.1～25毫秒、特别优选为0.1～20毫秒、再进一步优选为0.1～15毫秒的脉冲输出。
此外，作为脉冲连续发生次数，根据上述电容器容量，对于高阻抗的对象，可输出1～30次，优选为1～20次，进一步优选为1～15次，更优选为1～12次，特别优选为1～10次，再进而优选为1～9次。另外，也可以不产生脉冲(0次)。
该高电压模式的输出脉冲，即使是高电压脉冲，也可输出设定电压与实行电压值极为相近且波形稳定的高电压电脉冲。
·低电压模式的输出
在低电压模式的情况下，切换开关(符号5)变成开启的状态。此时，来自n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的输出，将经由切换开关(符号5)输入m1个串联m2并联电容器电路(符号6)。
在此，基于二极管(符号7)的功能，n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)与m1个串联m2并联电容器电路(符号6)这两者的电容器电路中，将会积蓄电荷而得以充电。即，n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)会成为m1个串联m2并联电容器电路(符号6)的充电源。
基于该电路结构，在低电压模式中，可利用积蓄于“n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路”(符号4)与“m1个串联m2并联电容器电路”(符号6)这两者中的电荷而输出电脉冲。
在此，作为“n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路”(符号4)与“m1个串联m2并联电容器电路”(符号6)这两者中所积蓄的总电容量，只要是在对低阻抗对象输出电脉冲时可产生连续多次的脉冲的充分电容量即可。原因系对于低阻抗对象施予电脉冲时，若无法确保充分的电容量，将无法产生充分次数之电脉冲。
该总电容量，可列举例如：500μF以上，进一步优选为600μF以上，特别优选为700μF以上，进一步优选为800μF以上。
此外，电容量的上限虽越高越良好，但可列举例如：4000μF以下，优选为3000μF以下，进一步优选为2500μF以下，更优选为2000μF以下，特别优选为1500μF以下，再进一步优选为1200μF以下。
具体而言，可列举出：500～4000μF，优选为500～3000μF，进一步优选为600～2500μF，更优选为600～2000μF，特别优选为700～1500μF，再进一步优选为800～1200μF。
作为低电压模式的具体例，可列举例如：元件电容器使用电容量470μF的电容器并将8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)与2个串联4并联电容器电路(符号6)进行组合的例子。此时，对于电路整体的电容器容量而言，8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的电容量为55μF、2个串联4并联电容器电路(符号6)的电容量为940μF，可得到合计995μF的电容量。
此外，电路整体的耐电压值，是2个串联4并联电容器电路的耐电压值。例如，元件电容器使用耐电压为450V的电容器并且将2个串联4并联电容器电路进行组合时，作为所输出的电压，可输出达到900V的穿孔脉冲。
作为以低电压模式可输出的电压上限，是可在m1个串联m2并联电容器电路(符号6)的耐电压以下的电压的输出。实际上，上述高电压模式/低电压模式的切换指标的电压值会成为上限。
作为该输出的下限，只要是超过0V的电压即可输出，特别是在1V以上时即可输出。特别地，作为下限的电压值，可以设定低电压模式下可输出的下限值为0～200V(0V除外)、优选为1～175V、进一步优选为10～150V、更优选为20～125V、特别优选为30～120V、再进一步优选为40～110V、进而更优选为50～100V的范围中的任一电压值。
作为以低电压模式可输出的脉冲宽度，可以是0.01～500毫秒、优选为0.05～300毫秒、进一步优选为0.1～200毫秒、更优选为0.1～100毫秒、特别优选为0.1～75毫秒、再进一步优选为0.1～50毫秒的脉冲输出。
此外，作为脉冲连续发生次数，根据上述电容器容量，对于低阻抗的对象可输出1～30次，优选为1～20次，进一步优选为1～15次，更优选为1～12次，特别优选为1～10次，再进一步优选为1～9次。另外，也可以不产生脉冲(0次)。
[传输脉冲发生机构]
此外，本发明的电穿孔用脉冲发生器，包含“传输脉冲发生用机构”。
“传输脉冲”(Transfer pulse)，是指多级式电穿孔法中在前述穿孔脉冲后立即施予的电脉冲，并且其是低电压的短脉冲宽度的电脉冲。
基于该传输脉冲的作用，通过由穿孔脉冲而开启的细胞膜的微细孔，可效率良好地将目的转移物质(核酸等)纳入细胞内。
作为传输脉冲所需要的电场强度(V/cm)，由于是较低的值，只要提供几十至几百伏特的输出机构即可充足。
此外，作为传输脉冲的波形形状，可以是矩形脉冲、指数矩形脉冲中的任一种。
该传输脉冲发生机构，是将传输脉冲发生用的直流电源、电容器充电用电路、以及电容电路作为实质的构成元件而组成电源电路。
另外，该电路中，只要不妨碍该电路的机能，并不排除形成包含其他的电路元件或机能电路的结构方式。
在此，传输脉冲发生用的直流电源(DC电源：符号11)，是为了得到产生传输脉冲的电压峰值而专用控制的直流电源。
该直流电源(符号11)的输出侧，是由“电容器充电用电路”连接而成。该电容器充电用电路，可列举出：将由直流电源(符号11)输出的直流转换为矩形波(交流)的电路、用于将矩形波(交流)升压的电路、用于将矩形波(交流)整流的电路等。
在此，采用输出电压充分高的直流电源(符号11)时，例如，可设定为将直流电源(符号11)的输出侧与转换电路(符号12)连接、并且将其输出侧与整流电路(符号14)以串联关系连接的电路结构。
在此，转换电路(符号12)是指将由直流电源(符号11)输出的直流转换为矩形波(交流)的电路。此外，整流电路(符号14)是指用于将矩形波(交流)整流为直流的电路。
另外，也可以将兼备切换机能和整流机能的电路，用作转换电路(符号12)和整流电路(符号14)。
另一方面，当输出电压采用低直流电源(符号11)时，在转换电路(符号12)的输出侧，必须有将矩形波(交流)升压的机构。
该升压机构，可列举例如：在转换电路(符号12)与整流电路(符号14)之间连接“脉冲变压器”(符号13)的机构。在该脉冲变压器(符号13)的作用下，可使得来自转换电路(符号12)的输出矩形波升压。
此外，该升压机构，除了脉冲变压器(符号13)以外，可列举出采用“倍压整流电路”作为整流电路(符号14)(参照图3)的机构。
在此，倍压整流电路是指具有将输入电压升压至2倍并整流为直流的作用的高电压发生电路。即，在采用倍压整流电路的方式中，将矩形波(交流)整流为直流电压输出，并将输入电压升压至2倍而以直流输出。
作为多级电穿孔中的传输脉冲，只要是所要求的输出电压值较低的电脉冲即可，因此，根据直流电源(符号11)的种类的选择，无需升压机构。此外，即使必须有升压机构的情况下，也只需采用脉冲变压器(符号13)、倍压整流电路(图3)，即可得到目的之输入电压。此外，也可将脉冲变压器(符号13)与倍压整流电路(符号14)并用。
另外，该传输脉冲用的电压发生机构，并不排除采用及/或并用除了脉冲变压器(符号13)、倍压整流电路(图3)以外的其他高电压发生电路(例如科克拉夫特-瓦耳顿电路等)。
基于该电路结构，来自传输脉冲用“电容器充电用电路”的输出电压，是作为输入至传输脉冲用电容器电路(符号15)前的电压峰值，被调整成为相符的值而成的。
·传输脉冲用电容器电路
作为传输脉冲用电容器电路(符号15)，考虑到装置制造上的生产效率的提升，适合耐电压500V以下、优选为耐电压450V以下的市售的化学电容器。另一方面，作为其下限，虽优选使用高耐电压，但适用耐电压100V以上，优选为耐电压200V以上，更优选为300V以上，特别优选为360V以上。
具体而言，从较容易作为市售品而获得的角度出发，可适用耐电压300V～450V、优选为360～450V。
对于传输脉冲而言，只有所要求的输出电压值较低的电脉冲，可达到目的作用。
因此，作为该电路(符号15)，只要是将元件电容器进行并联连接的电路即充分，但是，根据元件电容器的耐电压·电容量，可以使用以串联及/或并联电容器电路进行组合而成的构件。对于传输脉冲，只有所要求的输出电压值较低的电脉冲可达到目的作用。
例如，只要使用耐电压约300～500V的程度、优选为360～450V的电容器，则可仅通过并联连接即得到所需的耐电压。
另外，该电路所使用的元件电容器，虽适用耐电压和电容量相同的元件电容器，但也允许将耐电压和电容量不同的电容器进行组合使用的方式。
作为该电路(符号15)的电容器并联数目，只要是可确保电路(符号15)整体具有充足的电容量数即可，并无特别限制，可列举例如：2～20、优选为4～16、进一步优选为6～14、更优选为7～15的范围中的任一并联数。
在此，该传输脉冲电容器电路(符号15)的整体的耐电压，例如，适合设定为100V以上，优选为150V以上，进一步优选为200V以上，更优选为250V以上，特别优选为300V以上。
作为其上限，只要不脱离作为传输脉冲的输出电压的范围即可，可列举出：600V以下，优选为500V以下，进一步优选为450V以下，更优选为400V以下。
此外，作为该电路(符号15)的电容量，只要是即使在假设电压峰值衰减激烈的低阻抗对象的情况下也可充分确保连续多次脉冲发生的电容量即可。可列举例如：1000μF以上，优选为1200μF以上，进一步优选为1500μF以上，特别优选为1800μF以上。
此外，电容量的上限虽越高越好，但可列举例如：5000μF以下，优选为4000μF以下，进一步优选为3500μF以下，更优选为3000μF以下，特别优选为2500μF以下。
·传输脉冲的输出
传输脉冲的发生，是利用积蓄于上述传输脉冲用电容器电路中的电荷而输出电脉冲。
作为传输脉冲的输出电压，可以是对应于该传输脉冲用电容器电路的耐电压进行输出。例如，可以在600V以下、优选为500V以下、进一步优选为400V以下、更优选为350V以下、特别优选为300V以下进行输出。作为输出的下限，只要超过0V的电压即可输出，特别是只要在1V以上即可输出。
作为传输脉冲可输出的脉冲宽度，可以是0.01～1000毫秒、优选为0.05～750毫秒、进一步优选为0.1～500毫秒、更优选为0.1～250毫秒、特别优选为0.1～200毫秒、进一步优选为0.1～150毫秒、更优选为0.1～100毫秒的脉冲输出。
此外，作为脉冲连续发生次数，基于上述电容器容量，即使是在假设电压峰值衰减激烈的低阻抗对象的情况下，也可输出1～50次，优选为1～40次，进一步优选为1～30次，更优选为1～25次，特别优选为1～20次。另外，也可以不产生脉冲(0次)。
[控制机构]
作为本发明的脉冲发生器，为了实现可使用于多级式电穿孔的脉冲发生，优选具备控制上述电源电路的控制机构。
·极性切换电路
该脉冲发生器，优选为具有可切换输出电压的正极性(+：正)/负极性(-：负)的控制机构(极性切换控制机构)。该机构，可通过极性切换电路(符号8、16)来实现。
另外，采用多级式电穿孔法，在施予正极性电脉冲后赋予切换极性的负极性电脉冲，由此可进一步提升电穿孔效率。特别地，可以说，在施予正极性传输脉冲后，施予负极性传输脉冲的输出波形模式，能够进一步提升外来物质转入细胞内的效率。
作为极性切换电路的连接位置，可列举出：分别与穿孔脉冲发生用电源电路的输出侧和传输脉冲发生电源电路的输出侧进行连接的方式。在上述方式的情况下，会在两处分别控制极性反转。
在该方式的情况下，穿孔脉冲发生用电源电路的输出侧(上述分支合流电路的合流点的输出侧)，连接有穿孔脉冲用的极性切换电路(符号8)。另一方面，传输脉冲发生用电源电路的输出侧(传输脉冲用电容器电路的输出侧)，连接有传输脉冲用的极性切换电路(符号16)。
此外，极性切换电路的连接位置，可列举出在穿孔脉冲/传输脉冲切换控制电路(符号21)的输出侧连接的方式。在该方式的情况下，仅在一处控制极性反转。
·穿孔脉冲/传输脉冲切换电路
该脉冲发生器，优选具有用于使得从穿孔脉冲发生用电源电路出发的配线与从传输脉冲发生用电源电路出发的配线进行合流、并对其输出进行切换控制的机构。该机构可通过穿孔脉冲/传输脉冲切换电路(符号21)来实现。
作为穿孔脉冲/传输脉冲切换电路(符号21)的连接位置，只要是在穿孔脉冲发生用电源电路和传输脉冲发生用电源电路这两者的电源电路的输出侧即可。
·脉冲控制电路
本发明的脉冲发生器，优选通过脉冲控制电路(符号22)来实现对于所输出的脉冲进行整体性控制。例如，优选通过该控制电路控制所输出的电脉冲的脉冲宽度、脉冲间隔、脉冲数等。
此外，只要是在包含对象的阻抗测定、实行电压值、实行电流值的测定部的情况下，可自动控制以将信息从这些测定值反馈而确保产生适合的脉冲(输出值、波形形状等)。
[电穿孔装置]
本发明的脉冲发生器，可用作电穿孔装置的脉冲发生源。
在电穿孔装置中，优选设置有针对向脉冲发生器输入信息等施行控制的电源控制部。例如，优选通过该电源控制部可以针对来自装置操作时的高电压模式/低电压模式切换、电压的极性切换、各种电脉冲条件设定等输入信息来控制脉冲电源电路。
作为该电源控制部，可采用可设定操作的规定的电路结构。
此外，也可以设定为具有对应于装置的规格等而搭载对象的阻抗(电阻)测定、实行电压值、实行电流值等的测定设备、并在显示部显示的机能的装置。此外，也可以设定为具有根据测定结果而将电脉冲能量的产量作为热量(J)算出、并在监视器等显示部上进行显示的机能的装置。此外，也可以设定为可将输出的脉冲波形的形状在显示部显示的装置。
在此，作为输出显示的显示机构，虽可以将监视器、液晶、LED显示部等显示部内置于装置中，但也可以设定具有用于向外部附带的显示机构进行输出的外部输出端子的规格。此外，也可以设定一部分信息以内置显示机构进行显示而将其他信息以外部输出方式进行显示的规格。例如，也可以是连接于示波器等的方式。
此外，还可以设定为具有USB等的端子、蓝牙机能的规格以便可将数据输出或保存于电脑或硬盘等各种PC关联设备中。
在该电穿孔装置中，还优选有关高电压发生的作为安全装置搭载有限制机能的规格。
该电穿孔装置，可以设定为如下装置：即使仅具有一组穿孔脉冲发生用的直流电源和电容器充电用电路的电路结构，也可以对应于对象物的阻抗的不同，将穿孔脉冲的电压在几十至几千伏特的极广范围内进行切换。此外，同时，可在低电压模式中实现大规模的电容量，从而对于低阻抗对象也可以产生充分次数的多次脉冲。
由此，该电穿孔装置，对于各种对象的生物种或细胞，皆可适用多级方式电穿孔的电穿孔法。
另外，由于该电穿孔装置的该穿孔脉冲用电源电路，是高性能且精简的电路结构，故可作为制造工序中可以效率良好地进行制造的规格。并且，采用该规格还可实现基于省空间化的小型化。
·输出脉冲
由脉冲控制电路(符号22)连续输出对应于高电压模式或低电压模式的穿孔脉冲、以及传输脉冲。此外，也可产生极性反转的脉冲。此外，可分别多次连续产生穿孔脉冲以及传输脉冲(参照图6～10)。
在此，作为使用该电脉冲发生器可以输出的脉冲波形模式，可输出多级方式电穿孔中可使用的全部的波形。
例如，可以是连续输出穿孔脉冲和传输脉冲的2级方式的输出。
此外，可以是连续输出穿孔脉冲、传输脉冲以及极性切换传输脉冲的3级方式的输出。
此外，可以是连续输出穿孔脉冲、极性切换穿孔脉冲、传输脉冲以及极性切换传输脉冲的4级方式的输出。
此外，也可频繁进行极性切换并且将穿孔脉冲、极性切换穿孔脉冲、传输脉冲以及极性切换传输脉冲的顺序任意组合而输出。
理所当然，可多次连续产生穿孔脉冲和传输脉冲的各种脉冲。
该输出脉冲，虽可以矩形状输出，但根据连接的电极或对象物的阻抗的种类，也存在形成脉冲峰值(脉冲高度)描绘为衰减曲线的指数矩形脉冲形状的情况。此外，在产生多次脉冲时，存在形成为第2次以后的峰值与之前的脉冲衰减后的峰值的高度相同(在极性切换时是相逆的极性且相同绝对值的峰值)的情况。
该衰减现象，是将积蓄于电容器的电荷施加于物质上所产生的现象(自然衰减)而成的。虽该衰减的程度，会因所连接的电极或对象物的阻抗而异，但在高阻抗对象的情况下，衰减的程度会缓和。
另外，在本发明中，作为脉冲控制机构，是可通过组合控制脉冲峰值的机构，而使其成为保持矩形形状的脉冲。此外，也可以按照相同峰值来输出多次脉冲的全部。
进一步，在本发明中，可控制该脉冲峰值的衰减程度，以使其形成对所需衰减曲线进行描绘的脉冲波形。
另外，对于所产生的脉冲间的间隔(脉冲间隔：Pp间的间隔、Tp间的间隔、Pp与Tp的间隔等)，虽无特别限制，但可列举例如：0.05毫秒～100秒，优选为0.5毫秒～50秒，进一步优选为5毫秒～10秒，更优选为10毫秒～5秒，进一步更优选为25毫秒～2.5秒，特别优选为50毫秒～1秒。
·电穿孔
该电穿孔装置中，通过在脉冲控制电路(符号22)的输出侧的配线，连接对应于用途所需的形状·材质的电极，从而可使用对应各种生物种或细胞种的多级电穿孔法。所得到的输出脉冲，通过一系列的顺序控制而连续地施加于对象物。
作为可连接的电极，现在可使用的全部电穿孔用电极皆可使用，例如，电极杯电极、板电极、带脚电极、针电极、镊型电极、杆型电极、碟型电极等任何电极皆可使用。
因此，该电穿孔装置，是可以应用于In Vitro、In Vivo、Ex Vivo、In Ovo等任何电穿孔用途中的装置。
特别地，该电穿孔装置，由于是可实现传统技术所无法达到的对于高阻抗对象(细菌、真核微生物等)进行多级电穿孔法的装置，因而是在使用电极杯电极(参照图11)的方式中可期待有特别显著效果的装置。
高阻抗对象的电穿孔用的试样是指，从抑制细胞损伤或保持感受态(形质转换效率)的观点出发，使用含甘油或醣类等的水溶液(电阻高的溶液)作为电穿孔时使用的溶液来进行电穿孔的生物种或细胞。
例如，可列举出含有细菌(具体而言，真细菌、古细菌、蓝藻等原核生物)、真核微生物等(特别地，酵母菌、原生动物等单细胞真核生物；霉菌等丝状菌类等)的试样溶液。
特别地，由于细胞学或细菌学性质为起因的原因，导致使用传统装置进行高电压电穿孔法也无法得到良好的基因转移效率的试样中，通过使用该多级方式电穿孔，可实现极高效率的基因转移。
高阻抗的范围，例如在0.5kΩ以上，优选为0.8kΩ以上，进而优选为1kΩ以上，更优选为2kΩ以上，特别优选为3kΩ以上，进一步优选为4kΩ以上，进而更优选为5kΩ以上的溶液，可说是高电阻的溶液。
作为其上限，只要是以该电脉冲的电压可产生足够的电场强度的范围即可，并无特别限制，但可列举例如：50kΩ以下，优选为40kΩ以下，进一步优选为30kΩ以下，更优选为25kΩ以下。
另外，对于高阻抗对象的足够的穿孔脉冲的电场强度，可列举例如：5～30kV/cm，优选为8～27kV/cm，进而优选为9～25kV/cm，更优选为10～24kV/cm，特别优选为11～23kV/cm，进一步优选为12～22kV/cm，进而更优选为13～21kV/cm，进而特别优选为14～20kV/cm。
此外，对于高阻抗对象的传输脉冲的电场强度，可列举例如：0.01～4kV/cm，优选为0.05～3.5kV/cm，进而优选为0.1～3kV/cm，更优选为0.2～2.5kV/cm，特别优选为0.2～2kV/cm，最优选为0.5～2kV/cm。
另外，该电穿孔装置，可对于低阻抗对象的生物种的组织或细胞等(例如，动物细胞、植物细胞等)进行电脉冲输出、进行低电压模式的多级方式电穿孔。
在此，作为低阻抗的范围，可列举例如：小于500Ω，优选为450Ω以下，进而优选为400Ω以下，更优选为300Ω以下，特别优选为200Ω以下，进一步优选为100Ω以下。
此时，可参照传统方法的电脉冲条件等以进行多级方式的电穿孔。
另外，通过该电穿孔装置转移入细胞内的物质，虽可特别列举出外源DNA或RNA等核酸分子，但核酸类似物质、蛋白质、药剂、荧光物质等其他的化合物等也可效率良好地转移入细胞内。
特别地，该电穿孔装置，可适用于通过外源基因转移法而成的转化、转导、机能缺失、同源重组、基因组编辑等。具体而言，可适用于质粒DNA、建构DNA、病毒载体、反义核酸、siRNA、寡核苷酸等的转移。此外，也可适用于核酸类似物质(例如吗啉基聚合物等)的转移。
实施例
下面，通过列举实施例来说明本发明的实施方式，但本发明的范围并未限定于该实施例。
[制造例1]《本发明的电穿孔装置》
作为具有本发明的脉冲发生器的电穿孔装置，是制造图1所示的具备电源电路的脉冲发生器的电穿孔装置。
(1)“穿孔脉冲发生用电源电路”
针对该制造例的穿孔脉冲用电源电路进行说明。电路形成为：将被控制于穿孔脉冲用的DC电源(符号1)由来的直流，通过转换电路(符号2)转换为矩形波，并通过脉冲变压器(符号3)进行升压，输入至“8段科克拉夫特-瓦耳顿电路”(符号4)。
虽该8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的输出侧，以切换开关(符号5)为介而与“2个串联4并联电容器”(符号6)进行连接，但包含该2个串联4并联电容器电路(符号6)的电路，相对于8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的配线而形成为分支合流电路。
并且，形成为8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)与2个串联4并联电容器电路(符号6)的配线在合流点进行连接、并且在其合流点的输出侧连接有极性切换电路(符号8)的电路结构。
(i)高电压模式
在该实施方式中，当超出800V电压时形成为高电压模式，切换开关(符号5)变为关闭状态。此时，仅有8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)充电(2个串联4并联电容器电路(符号6)未充电)。
对于该8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)而言，该8段直接连结电容器形成为由2式并联连接而成的结构，且这些内置的电容器中积蓄电荷从而得以充电。
对于输入至8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)中的电压，在该电路的作用下升压整流，在其输出端将输入矩形波的峰值的2×8倍的直流电压输出。
本实施方式中的该8段科克拉夫特-瓦耳顿电路，作为其构成的每一个电容器使用了耐电压(Vc)为450V的电容器，因此该8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的耐电压，是450V×8＝3600V。
此外，在该电路(符号4)中，每一个电容器是使用容量(Cc)为220μF的电容器，因此积蓄于8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的电容器容量，是220μF/8×2＝55μF。
因此，在该实施方式中，8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)，是作为耐电压3600V和电容器容量55μF的电容器电路发挥功能。
此结果是，在该高电压模式中，将积蓄于8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的电容量55μF中的电荷，作为穿孔脉冲用脉冲使用。
由于该电路(符号4)的耐电压为3600V，故可充分耐受3000V的穿孔脉冲的发生。
此外，考虑到该电容器容量，可产生1～9次为止的连续脉冲。另外，也可以不产生脉冲(0次)。
(ii)低电压模式
当8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的输出电压是低电压模式的上限电压以下的值(在此为800V以下)时，切换开关(符号5)变为开启的状态。
此时，来自8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的输出，经由切换开关(符号5)使2个串联4并联电容器电路(符号6)得以充电。
即，在低电压模式中，电荷积蓄于“8段科克拉夫特-瓦耳顿电路”(符号4)和“2个串联4并联电容器电路”(符号6)这两者的电容器电路中，从而得以充电。
并且，基于二极管(符号7)的运行，“8段科克拉夫特-瓦耳顿电路”(符号4)的输出与“2个串联4并联电容器电路”(符号6)的输出进行重迭，从而使两者的电容器的荷电成为穿孔脉冲用的电荷。
在该2个串联4并联电容器电路(符号6)中，作为其构成的每一个电容器是使用耐电压(Vp)为450V的电容器，因此该电路(符号6)的耐电压是450V×2＝900V。
此外，在该电路中，使用的每一个电容器的容量(Cp)为470μF，故积蓄于该电路(符号6)的电容器容量，是470μF/2×4＝940μF。
此结果是，在该低电压模式中，8段科克拉夫特-瓦耳顿电路(符号4)的容量55μF与该2个串联4并联电容器电路(符号6)的容量940μF进行合并的合计995μF成为电路整体的电容器容量。此外，对于耐电压而言，由于耐电压为900V，故可充分耐受800V的电压。
此外，考虑到该电容器容量，可产生1～9次为止的连续脉冲。另外，也可以不产生脉冲(0次)。
(2)“传输脉冲发生用电源电路”
接着，说明该制造例中传输脉冲用电源电路。在传输脉冲的发生机构中，使用了与被控制于穿孔脉冲用的DC电源(符号1)不同的电源的“被控制于传输脉冲用的DC电源(符号11)”。
并且，形成为如下电路结构：来自传输脉冲用DC电源(符号11)的直流，在转换电路(符号12)转换为矩形波，通过整流电路(符号14)进行整流后，输入传输脉冲用电容器电路(符号15)。积蓄于该电容器电路(符号15)中的电荷，作为传输脉冲用的电脉冲利用。
在传输脉冲用电容器电路(符号15)的输出侧，连接有极性切换电路(符号16)。
在该实施方式中的传输脉冲是输出电压较低的电脉冲。此外，作为传输脉冲用DC电源(符号11)，由于使用了可输出300V的构件，故无需使用电压的升压机构，即可得到目的输入电压。
该实施方式中，传输脉冲用电容器电路(符号15)所使用的一个电容器(耐电压400V、电容量270μF)，并非串联连接而是为了增加电容器容量而并联连接使用。
因此，传输脉冲用电容器电路(符号15)整体的耐电压，虽与元件电容器的耐电压相同地保持在400V，但由于是将8个电容器并联(参照图4)，因此，该电路整体的电容器容量是270μF×8＝2160μF。
考虑到该电容器容量，可产生1～20次为止的连续脉冲。另外，也可以不产生脉冲(0次)。
(3)“输出电压的极性切换”
对于由上述穿孔脉冲用电源电路的电容器电路输出的电压，可通过极性切换电路(符号8)进行正极性(+)或负极性(-)中的任一种输出的切换。极性的切换，是通过反转输入的正/负来进行。
此外，对于由传输脉冲用电源电路的电容器电路输出的电压，也可以通过极性切换电路(符号16)进行正极性(+)或负极性(-)中的任一种输出的切换。
(4)“穿孔脉冲/传输脉冲切换”
在该实施方式的脉冲发生器中，在穿孔脉冲发生用电源电路与传输脉冲用电源电路的合流点，连接有“穿孔脉冲/传输脉冲切换控制电路”(符号21)。
在该脉冲发生器中，在“穿孔脉冲/传输脉冲切换控制电路”(符号21)中控制穿孔脉冲与传输脉冲中任一种脉冲的输出。
(5)“脉冲控制”
在该实施方式的脉冲发生器中，在“穿孔脉冲/传输脉冲切换控制电路”(符号21)的输出侧，连接有“脉冲控制电路”(符号22)，从而可整体性地控制所输出的脉冲。另外，对应于各种输入信息的控制等，是通过电源控制部(附图中未特别示出)进行规定的控制。
(6)“装置规格”
制造内置有该实施方式的脉冲发生器的电穿孔装置。该电穿孔装置的规格的概略情况如表3所示。
表3
(7)“脉冲波形的输出例”
将该电穿孔装置与示波器连接，检测输出波形模式。波形模式的检测结果(示波图)以图7～10表示。
·高电压模式的输出波形
图7和图8，是对于1kΩ的对象以规定的设定条件(Pp：电压3000V，脉冲宽度2.5毫秒，次数3次；Tp：电压300V，脉冲宽度50毫秒，次数3次)输出脉冲的例子。
图7是3级方式的输出例，是输出穿孔脉冲3次、传输脉冲3次以及极性切换传输脉冲3次的例子。图7的例子中所测定的P-P值(peak to peak value)为3240V、最大电压值为2920V、最小电压值为-320V、Pp脉冲宽度为2.442毫秒、Tp脉冲宽度为49.97毫秒。
此外，图8是4级方式的输出例，是输出穿孔脉冲3次、极性切换穿孔脉冲3次、传输脉冲3次以及极性切换传输脉冲3次的例子。图8的例子中所测定的P-P值(peak to peakvalue)为5400V、最大电压值为2920V、最小电压值为-2480V、Pp脉冲宽度为3.160毫秒、Tp脉冲宽度为49.64毫秒。
在图7和图8这两个例子中，穿孔脉冲的实测最大电压值是2920V。在这一方面，尽管是高电压脉冲的输出，但设定电压与实行电压值也是极相近的值，这显示出可输出稳定的高电压电脉冲。
·低电压模式的输出波形
图9和图10是对于50Ω的对象以规定的设定条件(Pp：电压180V，脉冲宽度5毫秒，次数3次；Tp：电压50V，脉冲宽度50毫秒，次数3次)输出脉冲的例子。
图9是3级方式的输出例，是输出穿孔脉冲3次、传输脉冲3次以及极性切换传输脉冲3次的例子。图9的例子中所测定的P-P值(peak to peak value)为192V、最大电压值为180V、最小电压值为-12.0V、Pp脉冲宽度为5.211毫秒、Tp脉冲宽度为50.01毫秒。
此外，图10是4级方式的输出例，是输出穿孔脉冲3次、极性切换穿孔脉冲3次、传输脉冲3次以及极性切换传输脉冲3次的例子。图10的例子中所测定的P-P值(peak to peakvalue)为310V、最大电压值为180V、最小电压值为-130V。
在图9和图10这两个例子中，穿孔脉冲的实测最大电压值是180V。
·由输出波形所得到的认识
如图7～10的示波图所示，该电穿孔装置，显示在高电压和低电压这两者的模式中可产生连续施予穿孔脉冲和传输脉冲的多级脉冲。
特别地，对于高阻抗对象的高电压模式，显示可产生接近矩形状的干净的脉冲。
[实施例1]《对于高阻抗对象的基因转移例》
对于大肠杆菌(革兰氏阴性菌)悬浮液，通过使用制造例1所制作的电穿孔装置的多级电穿孔进行基因转移试验。
(1)“实验方法”
调制大肠杆菌(DH5α)的EP用感受态细胞。感受态细胞的调制是通过将对数增值期的细胞进行收集(集菌)并采用常法进行。
将该EP用感受态细胞(1样品为菌数109～1011，10％甘油溶液)与pUC19载体(1样品为10pg)混合，并将该混合液20μL注入1mm空隙电极杯(1mm gap cuvette)电极(内帕基因株式会社制造)内。另外，该一系列操作是在冰上一边冷却一边进行。
将注入该菌和DNA混合液的电极杯电极，插入制造例1所制造的电穿装置连接的电极杯电极用槽中，以表4所示电脉冲条件进行3级方式的电穿孔处理(高电压穿孔脉冲1次→传输脉冲5次→极性切换传输脉冲5次)。另外，各脉冲之间的间隔设定为50毫秒。
另一方面，作为比较实验，除了使用指数输出的电穿孔装置(ECM630,BTX公司制造)以外其余均同样地进行，以表4所示电脉冲的条件进行电穿孔处理(高电压指数脉冲1次)。
然后，平板培养于含氨苄青霉素LB琼脂培养基上，计数通过pUC19DNA的转移而获得耐药性并生长的菌落数。算出质粒1μg的菌落数，评估基因转移效率(cfu/μg)。另外，该基因转移实验进行2次重复，算出平均值。
(2)“结果”
其结果，如表5所示，显示出：对于高阻抗对象的大肠杆菌的悬浮液(样品电阻值＝约7.7kΩ)，通过使用制造例1所制作的多级式电穿孔装置进行电脉冲处理，可实现极高的基因转移效率。
具体而言，显示出：在施予2000V的穿孔脉冲后，施予传输脉冲5次以及极性切换传输脉冲5次的电处理的情况(实验1-1)下，与使用传统指数输出的电穿孔装置进行同电压的高电压脉冲处理的情况(实验1-3)相比，可达到高出约4.9倍的基因转移效率。
此外，还显示出：即使使用该多级式电穿孔装置施予1800V的穿孔脉冲后施予同样的传输脉冲的情况(实验1-2)下，与使用传统的电穿孔装置的情况(实验1-3)相比，也可达到高出约3.1倍的基因转移效率。
另外，实验1-3所使用的比较装置采用电压值2000V的理由：由于这是在预备实验中以该值进行电穿孔时的合适条件。
由这些可知，显示出通过使用制造例1所制作的电穿孔装置，对于传统而言不可能的如大肠杆菌的感受态细胞这样的高阻抗的对象物，也可进行多级式的电穿孔处理，且可实现极高效率的基因转移。
表4
表5
[实施例2]《对于低阻抗对象的基因转移例》
对于动物细胞的悬浮液，使用制造例1所制作的电穿孔装置，进行多级电穿孔的基因转移试验。
(1)“实验方法”
培养HT1080细胞(人类纤维肉瘤细胞：贴壁细胞)，进行胰蛋白酶处理使贴壁状态的细胞剥离。确认细胞剥离后，去除胰蛋白酶，以Opti-MEM培养基(无血清和抗生素)洗净细胞，并使其在同液体培养基中再悬浮。
将该HT1080细胞(1样品为106细胞，Opti-MEM培养基(无血清和抗生素))与pCMV-EGFP载体(1样品为10μg)混合，并将该混合液100μL注入2mm空隙电极杯电极(内帕基因株式会社制造)内。另外，该细胞的处理操作是在室温下进行。
将注入该细胞和DNA混合液的电极杯电极，插入连接制造例1所制造的电穿孔装置的电极杯电极用槽，以表6所示电脉冲条件进行3级方式的电穿孔处理(高电压穿孔脉冲1～2次→传输脉冲5次→极性切换传输脉冲5次)。另外，各脉冲之间的间隔设定为50毫秒。
此外，以只进行电极杯注入而未进行电穿孔处理的样品作为对照组(Control)。
然后，使用含有胎牛血清的DMEM培养基将各细胞以通常的培养条件培养24小时，通过FACS分析算出生存率和转移率。“生存率”是表示培养24小时后“活细胞数”相对于“总细胞数”的比例。具体而言，以FACS分析具有正常形态的细胞作为活细胞。FACS分析所算出的活细胞，与以锥虫蓝染色和集落形成试验所算出的活细胞的结果一致。
此外，基因的“转移率”是通过FACS分析算出“发现具有基因转移的EGFP基因的细胞数”相对于“活细胞数”的比例而求得。
(2)“结果”
其结果，如表7所示，显示出：对于将低阻抗对象的动物细胞悬浮溶液(样品电阻值＝约41.6Ω)，通过使用制造例1所制作的多级式电穿孔装置进行施予130～180V的穿孔脉冲的电脉冲处理，可达到生存率和转移率这两者均良好的基因转移。
该结果显示，制造例1所制作的电穿孔装置是，即使对于低阻抗对象的细胞溶液也可以基于多级式电穿孔而高效率地进行基因转移的装置。
另外，当使用指数方式的电穿孔来施行以衰减波电脉冲法中的标准条件下的电脉冲处理(例如，100～200V的指数脉冲1次处理)的情况下，无法达成如此高的效率。
另外，该实验中，从对照样品的极少细胞(活细胞的0.4％)中检出荧光。其原因可考虑有(i)HT1080细胞是自发体荧光强的细胞、(ii)DMEM培养基会微量发出与GFP荧光相同波长的荧光、(iii)一部分细胞吞噬质粒的可能性等，但不论如何，以整体量来看仅微少而不影响该实施例的主体结果。
表6
表7
[由实施例1、2所得到的认识]
通过使用制造例1所制作的本发明的多级式电穿孔装置，显示出：即使是对于高阻抗对象的生物种或细胞，也可实现极高基因转移效率。
此外，从该结果可知，作为事实证明例子显示出：即使对于高阻抗对象的生物而言，多级方式电穿孔法在实际上也是有效的。
此外，还显示出：制造例1所制作的本发明的多级方式电穿孔装置是，对于低阻抗对象的生物种或细胞也可进行良好的多级方式电穿孔的装置。
由以上结果显示：本发明的多级方式电穿孔装置是，对于低阻抗和高阻抗对象这两者的生物种或细胞也可实现极良好的外源基因转移的装置。
工业实用性
基于本发明，能够以可效率良好地进行制造的规格来提供一种电穿孔装置，其可应对电穿孔需要的扩大和用途的多样化，并且可适合施用于广泛的生物种或细胞。
由此，可期待本发明被极有效地利用在生命科学的整个研究开发领域(分子生物、基因、微生物、医药、饮食品、农艺化学、畜产等)以及治疗领域中。
附图标记的说明
1.穿孔脉冲用DC电源
2.穿孔脉冲用转换电路
3.穿孔脉冲用脉冲变压器
4.n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路
5.切换开关
6.m1个串联m2并联电容器电路
7.二极管
8.极性切换电路
11.传输脉冲发生用DC电源
12.传输脉冲用转换电路
13.传输脉冲用脉冲变压器
14.整流电路
15.传输脉冲用电容器电路
16.极性切换电路
21.穿孔脉冲/传输脉冲切换电路
22.脉冲控制电路
31.1mm空隙电极杯电极
32.2mm空隙电极杯电极
33.4mm空隙电极杯电极

Claims (10)

1.一种电穿孔用电脉冲发生器，其特征在于，其具有穿孔脉冲发生机构和传输脉冲发生机构，其中，作为所述穿孔脉冲发生机构具有：
(A)n段的科克拉夫特-瓦耳顿电路，在此，n表示2以上的任一整数；以及
(B)由所述(A)所述的电路的输出侧的配线的分支点进行分支的电路，其中，(B)包含：
(b1)切换开关，其高电压模式与低电压模式的切换电压值为200～1400V的范围中的任一电压值，且在高电压模式时开关关闭、在低电压模式时开关开启；以及，
(b2)将m1个电容器串联而成的构件进行m2并联得到的电路，在此，m1表示1以上的任一整数，m2表示2以上的任一整数；
并且，(B)是，
所述(b1)所述的开关与所述(b2)所述的电路以串联方式连接，且所述(b2)所述的电路的输出侧的配线，通过所述分支点而在输出侧与所述(A)所述的电路的输出侧的配线合流而成的电路。
2.如权利要求1所述的电脉冲发生器，其中，所述(B)所述的电路，在该电路内的所述(b2)所述的电路的输出侧，包含电流流向输出侧而连接的二极管。
3.如权利要求1或2所述的电脉冲发生器，其中，构成所述脉冲发生器的电路元件的电容器，是耐电压500V以下的电容器。
4.权利要求1～3项中所述的脉冲发生器，其中，所述高电压模式与所述低电压模式的切换电压值，是500～1000V的范围中的任一电压值。
5.如权利要求1～4项中任一项所述的脉冲发生器，其中，构成所述穿孔脉冲发生机构的电路，是仅具有一组穿孔脉冲发生用的直流电源和电容器充电用电路，并且，在高电压模式中所述(A)所述的电路的耐电压是1500～5000V的范围中的任一值，并且，在低电压模式中所述(A)所述的电路与所述(b2)所述的电路的合计电容量是500～4000μF的范围中的任一值。
6.如权利要求1～5项中任一所述的电脉冲发生器，其中，所述(A)所述的电路中的整数n是4～13的范围中的任一整数，并且，所述(b2)所述的电路中的整数m1是2～6的范围中的任一整数，并且，所述(b2)所述的电路中的整数m2是2～10的范围中的任一整数。
7.如权利要求1～6项中任一所述的电脉冲发生器，其中，所述脉冲发生器具有输出电压的极性切换控制机构。
8.如权利要求1～7项中任一项所述的电脉冲发生器，其中，所述脉冲发生器具有输出脉冲的脉冲控制机构。
9.一种电穿孔装置，其特征在于，具备权利要求1～8中任一项所述的电脉冲发生器。
10.一种基于电穿孔法进行的外源基因转移法，其特征在于，使用权利要求9所述的电穿孔装置。
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