CN106442681A - 基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法 - Google Patents

基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法 Download PDF

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王丙莲
史建国
栾兴社
蔡传康
张华�
李大海
李秋顺
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Abstract

本发明公开了一种基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法，包括以下步骤；S1：研制双酶固定化技术及工艺，包括酶及固定化载体的筛选和双酶固定化技术及方法的研究；S2：研制最适宜的电极系统和最完善的配套试剂；S3：研究最有效的生物反应系统；S4：进行软件开发和硬件设计，将酶电极系统和流动注射分析系统组装在一起，结合配套的软件和硬件，即得基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器。本发明的研制过程详细，研究方法多样化，研究数据真实可靠，所研制的生物传感器检测灵敏度高，周期短，操作过程简单，且使用成本低，人力消耗少，检测效率高，颜色、结构相似物质对检测结果无影响，适用范围广。

Description

基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法。
背景技术
甘油是一种重要的微生物碳源，在发酵生产中，甘油作为碳源广泛应用于基因工程菌培养及生物活性大分子表达，其浓度过高将延迟外源蛋白表达，而浓度过低则造成细胞生长不良或生长缓慢，延长高密度发酵时间。所以发酵液中甘油含量的监控是保证高发酵单位的关键。而且甘油作为一种重要的生物化工产品及平台化合物，其来源及应用均极其广泛，无论是传统皂化废液蒸馏法，还是作为生物柴油副产物，甘油的生产及质量控制均离不开甘油含量的精准而快速的检测。另外，甘油浓度测定在食品和酒精饮料质量和鉴别真伪方面也具有重要应用，所以甘油浓度的测定受到法律的严格监管，亦是各种饮料基质质量监控的常规手段。
目前，国内有关甘油的分析方法，主要有甘油激酶法、分光光度法原子吸收法，气相色谱法、高效液相色谱法和甘油检测试剂盒测定法。然而，甘油激酶法，则不适于颜色样品、以及成分复杂，干扰物较多的样品；分光光度法原子吸收法操作复杂，实验精度低，耗时长，误差大；气相色谱法、高效液相色谱法，虽然精度高，但所需仪器昂贵，需要专业人员操作；甘油检测试剂盒测定准确而快速，但其价格昂贵，成本较高，不适于国内实际生产中对甘油含量的监控。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法。
基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法，包括以下步骤；
S1：研制双酶固定化技术及工艺，包括酶及固定化载体的筛选和双酶固定化技术及方法的研究，研究甘油生物传感器相关的酶的性质，筛选出适于快速催化甘油传感器的酶，并在确定酶的基础上，研究不同的酶固定载体及固定化模式，筛选出适宜的固定化载体，再研究能够反复使用，并保持高稳定性、高寿命的固定化技术和配方，制造出节省酶使用量且具有高寿命、高稳定性的能够安装于过氧化氢电极上的酶膜，研究出最有效的双酶固定化方法；
S2：研制最适宜的电极系统和最完善的配套试剂，选取最优的电极和电极修饰材料，进行双酶电极的自组装，设计电极与酶膜的组装模式，并研究保持电极寿命及酶膜高活性、高稳定性及高寿命的配套试剂；
S3：研究出最有效的生物反应系统和流动注射系统，按照双酶固定化方法，将过氧化氢双酶电极固定于反应池一侧，构建生物反应系统，实现样品与过氧化氢双酶电极的接触，甘油在双酶的作用下发生氧化还原反应，响应电流作为仪器分析的原始信号，再设计蠕动泵、进样阀、管道组成流动注射系统，并由程序统一控制，实现反应池溶液的自动摄入和排出，为双酶电极的生化反应提供适宜的液体环境和管路系统，生物反应系统和流动注射系统协调工作，完成甘油传感器的生物反应及信号输出；
S4：进行软件开发和硬件设计将酶电极系统和流动注射分析系统组装在一起，并结合配套的软件和硬件，即研制出基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器。
优选的，所述双酶是指甘油激酶和甘油磷酸氧化酶。
优选的，所述双酶固定化技术及方法的研究包括比较牛血清蛋白-戊二醛膜固定化、尼龙网共价固定化、以及牛血清蛋白-戊二醛、尼龙网共价混合固定化三种固定化膜的生物活性、稳定性。
优选的，所述最适宜的电极为过氧化氢电极和铂金电极的组合。
优选的，所述甘油含量检测的原理为甘油在甘油激酶作用下，被ATP(Mg2+)氧化成甘油三磷酸，甘油三磷酸经甘油磷酸氧化酶氧化生成甘油酮三磷酸，反应产生的过氧化氢在过氧化氢电极上产生电流，电流大小与甘油浓度成正比，根据电流大小确定甘油含量，反应方程式如下：
优选的，所述配套试剂的研究内容包括甘油激酶和甘油磷酸氧化酶的电化学响应与温度、pH、离子强度、流动速度、底物混合、扩散、传递、停留时间的相关性，依据这些条件研制保护酶膜并创造酶反应最适条件的专用辅助材料，并确定试剂的储存条件及有效期。
优选的，所述生物反应系统包括有机玻璃流动反应池、过氧化氢电极、蠕动泵、进样阀和管道。
优选的，所述硬件设计是以32位ARM芯片LPC1788为处理核心，通过RS232-USB通讯接口来实现与上位机PC的交互式监控，并对电路板的设计、布局、布线进行研究。
本发明的研制过程详细，研究方法多样化，研究数据真实可靠，所研制的生物传感器选择高性能载体，建立稳定高效的双酶固定化技术，实现同一酶膜上两种酶分层分布，在开发高性能双酶固定酶电极基础上建立新型智能化、简易化甘油生物传感器，其检测灵敏度高，检测周期短，实现发酵同步化实时监控，适于方便快捷的进行现场定量检测；操作过程简单，检测时无需繁琐的样品净化和富集等前处理，使用成本低，需要样品量低，样品颜色及颜色变化、分子结构类似杂质对样品测定结果无影响，人力消耗少，检测效率高，适用范围广。
附图说明
图1为本发明提出的基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法的路线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
本发明提出的基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法，包括以下步骤；
S1：研制双酶固定化技术及工艺，包括酶及固定化载体的筛选和双酶固定化技术及方法的研究，研究甘油生物传感器相关的酶的性质，筛选出适于快速催化甘油传感器的酶，并在确定酶的基础上，研究不同的酶固定载体及固定化模式，筛选出适宜的固定化载体，再研究能够反复使用，并保持高稳定性、高寿命的固定化技术和配方，制造出节省酶使用量且具有高寿命、高稳定性的能够安装于过氧化氢电极上的酶膜，研究出最有效的双酶固定化方法；
S2：研制最适宜的电极系统和最完善的配套试剂，选取最优的电极和电极修饰材料，进行双酶电极的自组装，设计电极与酶膜的组装模式，并研究保持电极寿命及酶膜高活性、高稳定性及高寿命的配套试剂；
S3：研究出最有效的生物反应系统和流动注射系统，按照双酶固定化方法，将过氧化氢双酶电极固定于反应池一侧，构建生物反应系统，实现样品与过氧化氢双酶电极的接触，甘油在双酶的作用下发生氧化还原反应，响应电流作为仪器分析的原始信号，再设计蠕动泵、进样阀、管道组成流动注射系统，并由程序统一控制，实现反应池溶液的自动摄入和排出，为双酶电极的生化反应提供适宜的液体环境和管路系统，生物反应系统和流动注射系统协调工作，完成甘油传感器的生物反应及信号输出；
S4：进行软件开发和硬件设计将酶电极系统和流动注射分析系统组装在一起，并结合配套的软件和硬件，即研制出基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器。
本发明中，所述双酶是指甘油激酶和甘油磷酸氧化酶。
本发明中，所述双酶固定化技术及方法的研究包括比较牛血清蛋白-戊二醛膜固定化、尼龙网共价固定化、以及牛血清蛋白-戊二醛、尼龙网共价混合固定化三种固定化膜的生物活性、稳定性。
本发明中，所述最适宜的电极为过氧化氢电极和铂金电极的组合。
本发明中，所述甘油含量检测的原理为甘油在甘油激酶作用下，被ATP(Mg2+)氧化成甘油三磷酸，甘油三磷酸经甘油磷酸氧化酶氧化生成甘油酮三磷酸，反应产生的过氧化氢在过氧化氢电极上产生电流，电流大小与甘油浓度成正比，根据电流大小确定甘油含量，反应方程式如下：
本发明中，所述配套试剂的研究内容包括甘油激酶和甘油磷酸氧化酶的电化学响应与温度、pH、离子强度、流动速度、底物混合、扩散、传递、停留时间的相关性，依据这些条件研制保护酶膜并创造酶反应最适条件的专用辅助材料，并确定试剂的储存条件及有效期。
本发明中，所述生物反应系统包括有机玻璃流动反应池、过氧化氢电极、蠕动泵、进样阀和管道。
本发明中，所述硬件设计是以32位ARM芯片LPC1788为处理核心，通过RS232-USB通讯接口来实现与上位机PC的交互式监控，并对电路板的设计、布局、布线进行研究。
本发明的研制过程详细，研究方法多样化，研究数据真实可靠，所研制的生物传感器选择高性能载体，建立稳定高效的双酶固定化技术，实现同一酶膜上两种酶分层分布，在开发高性能双酶固定酶电极基础上建立新型智能化、简易化甘油生物传感器，其检测灵敏度高，检测周期短，实现发酵同步化实时监控，适于方便快捷的进行现场定量检测；操作过程简单，检测时无需繁琐的样品净化和富集等前处理，使用成本低，需要样品量低，样品颜色及颜色变化、分子结构类似杂质对样品测定结果无影响，人力消耗少，检测效率高，适用范围广。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法，其特征在于，包括以下步骤；
S1：研制双酶固定化技术及工艺，包括酶及固定化载体的筛选和双酶固定化技术及方法的研究，研究甘油生物传感器相关的酶的性质，筛选出适于快速催化甘油传感器的酶，并在确定酶的基础上，研究不同的酶固定载体及固定化模式，筛选出适宜的固定化载体，再研究能够反复使用，并保持高稳定性、高寿命的固定化技术和配方，制造出节省酶使用量且具有高寿命、高稳定性的能够安装于过氧化氢电极上的酶膜，研究出最有效的双酶固定化方法；
S2：研制最适宜的电极系统和最完善的配套试剂，选取最优的电极和电极修饰材料，进行双酶电极的自组装，设计电极与酶膜的组装模式，并研究保持电极寿命及酶膜高活性、高稳定性及高寿命的配套试剂；
S3：研究出最有效的生物反应系统和流动注射系统，按照双酶固定化方法，将过氧化氢双酶电极固定于反应池一侧，构建生物反应系统，实现样品与过氧化氢双酶电极的接触，甘油在双酶的作用下发生氧化还原反应，响应电流作为仪器分析的原始信号，再设计蠕动泵、进样阀、管道组成流动注射系统，并由程序统一控制，实现反应池溶液的自动摄入和排出，为双酶电极的生化反应提供适宜的液体环境和管路系统，生物反应系统和流动注射系统协调工作，完成甘油传感器的生物反应及信号输出；
S4：进行软件开发和硬件设计将酶电极系统和流动注射分析系统组装在一起，并结合配套的软件和硬件，即研制出基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器。
2.根据权利要求1所述的基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法，其特征在于，所述双酶是指甘油激酶和甘油磷酸氧化酶。
3.根据权利要求1所述的基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法，其特征在于，所述双酶固定化技术及方法的研究包括比较牛血清蛋白-戊二醛膜固定化、尼龙网共价固定化、以及牛血清蛋白-戊二醛、尼龙网共价混合固定化三种固定化膜的生物活性、稳定性。
4.根据权利要求1所述的基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法，其特征在于，所述最适宜的电极为过氧化氢电极和铂金电极的组合。
5.根据权利要求1所述的基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法，其特征在于，所述甘油含量检测的原理为甘油在甘油激酶作用下，被ATP(Mg2+)氧化成甘油三磷酸，甘油三磷酸经甘油磷酸氧化酶氧化生成甘油酮三磷酸，反应产生的过氧化氢在过氧化氢电极上产生电流，电流大小与甘油浓度成正比，根据电流大小确定甘油含量，反应方程式如下：
。
6.根据权利要求1所述的基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法，其特征在于，所述配套试剂的研究内容包括甘油激酶和甘油磷酸氧化酶的电化学响应与温度、pH、离子强度、流动速度、底物混合、扩散、传递、停留时间的相关性，依据这些条件研制保护酶膜并创造酶反应最适条件的专用辅助材料，并确定试剂的储存条件及有效期。
7.根据权利要求1所述的基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法，其特征在于，所述生物反应系统包括有机玻璃流动反应池、过氧化氢电极、蠕动泵、进样阀和管道。
8.根据权利要求1所述的基于双酶固定化技术的甘油快速测定生物传感器的方法，其特征在于，所述硬件设计是以32位ARM芯片LPC1788为处理核心，通过RS232-USB通讯接口来实现与上位机PC的交互式监控，并对电路板的设计、布局、布线进行研究。
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