CN106434831A - 一种研究真菌孢子萌发的方法 - Google Patents

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张忠
张瑞玲
庄桂芬
黄振东
薛志静
李研
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

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Abstract

本发明公开了一种真菌拮抗菌的快速筛选方法，该方法包括将离心管盖好盖子，置于温度为27‑30℃的摇床中，以75‑150rpm的转速培养12h；从摇床中取下离心管，以枪头吹吸培养液，使孢子均匀悬浮于液体中，吸出适量滴在干净载玻片上，加盖盖玻片，在显微镜下观察孢子的萌发情况，并计算萌发率等步骤。该方法一次性处理的孢子数量大，为观察与统计工作提供了较大基数，同时通过该研究方法孢子不易聚集成团或随液体流动，观察效果好，取得的研究数据准确，适用于孢子萌发条件的优化、孢子萌发抑制剂或促进剂的筛选和研究孢子萌发从而研究细菌拮抗菌的筛选等孢子研究工作。

Description

一种研究真菌孢子萌发的方法
技术领域
本发明涉及研究真菌孢子领域，具体为一种研究真菌孢子萌发的方法。
背景技术
真菌大致分为植物病原真菌、动物致病真菌、环境污染真菌和食品污染真菌等几类。对于动物致病真菌，该种真菌在动物体内或体表滋生，在体外难以培养，因此对其拮抗菌的研究较少；而对于植物病原真菌、环境污染真菌和食品污染真菌，其生活环境相对开放，孢子可大量释放于环境中，该类孢子便于收集，有时会研究其孢子萌发条件的优化、孢子萌发抑制剂或促进剂的筛选、通过研究孢子萌发从而研究细菌拮抗菌的筛选，因此研究真菌孢子的萌发方法是很有必要的。
现在已建立的真菌孢子萌发研究方法，主要有悬滴法、琼脂法及培养皿法等。悬滴法和琼脂法应用最广，两种方法操作时，由于培养液或培养基质体积有限，若加入孢子量太大，则影响孢子的萌发情况，所以操作时只能加入少量的孢子，根据统计学原理，基数越小，得到的数据准确率越低，因此该方法计算孢子萌发率时误差较大，不能为研究工作提供准备的数据；培养皿法加入的孢子量较大，但在培养过程中，易造成液体的蒸发，需要不断进行保湿处理，费时费力且孢子在培养皿中易聚成团或随液体流动，观察效果不佳，同样不能得到准确的研究数据。
发明内容
本发明针对以上不足之处，提供一种研究真菌孢子萌发的方法，该方法一次性处理的孢子数量大，为观察与统计工作提供了较大基数，同时通过该研究方法孢子不易聚集成团或随液体流动，观察效果好，取得的研究数据准确，适用于孢子萌发条件的优化、孢子萌发抑制剂或促进剂的筛选和研究孢子萌发从而研究细菌拮抗菌的筛选等孢子研究工作。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明包括以下步骤：
一、收集目标真菌的孢子；
二、配置2-5％的葡萄糖无菌水溶液，混匀并制成孢子萌发液；
三、取孢子萌发液0.5ml，置于1.5ml离心管中，将待测定萌发的孢子加入孢子萌发液中；
四、将离心管盖好盖子，置于温度为27-30℃的摇床中，以75-150rpm的转速培养12h；
五、从摇床中取下离心管，以枪头吹吸培养液，使孢子均匀悬浮于液体中，吸出适量滴在干净载玻片上，加盖盖玻片，在显微镜下观察孢子的萌发情况，并计算萌发率；
六、将步骤五中离心管内含孢子培养液继续放入摇床中并重复步骤四的工作，之后再通过步骤五计算孢子萌发率。
本发明设计了，所述步骤四中的培养时间可以为6h、12h或24h。
本发明设计了，往步骤四中摇好的含孢子培养液中加入酸或碱，从而研究不同PH对孢子萌发的影响。
本发明设计了，往步骤四中摇好的含孢子培养液中加入孢子萌发抑制剂或促进剂，观察其对孢子萌发的影响。
本发明设计了，往步骤四中摇好的含孢子培养液中加入拮抗细菌，观察细菌对孢子萌发的影响。
具体实施方式
禾谷镰刀菌Fusarium graminearum是一种植物的根部致病菌，可引起穗腐、茎腐、茎基腐和根腐病等病害，是一种重要的植物病原真菌；以下3个实施例均以禾谷镰刀菌孢子为研究对象，比较悬滴法、琼脂法、培养皿法和本发明的方法对孢子萌发的影响。
实施例1：
相对于本发明本实施例包括以下步骤：
一、收集目标真菌的孢子；
二、配置2％的葡萄糖无菌水溶液，混匀并制成孢子萌发液；
三、取孢子萌发液0.5ml，置于1.5ml离心管中，将待测定萌发的孢子加入孢子萌发液中；
四、将离心管盖好盖子，置于温度为27℃的摇床中，以75rpm的转速培养12h；
五、从摇床中取下离心管，以枪头吹吸培养液，使孢子均匀悬浮于液体中，吸出适量滴在干净载玻片上，加盖盖玻片。
悬滴法、琼脂法、培养皿法同样是采用上述步骤二中的孢子萌发液，计算上述四种方法的孢子萌发率时，都是在显微镜下随机选取3个视野进行计算，然后计算三次萌发率的平均值，最后结果如下：悬滴法的孢子萌发率84％、琼脂法的孢子萌发率85％、培养皿法的孢子萌发率83％、本发明的孢子萌发率86％。
上述四种方法随机选取的3个视野中孢子的平均数为：悬滴法的孢子个数为42个、琼脂法的孢子个数为39个、培养皿法的孢子个数为56个、本发明的孢子个数为65个。
实施例2：
相对于本发明本实施例包括以下步骤：
一、收集目标真菌的孢子；
二、配置3％的葡萄糖无菌水溶液，混匀并制成孢子萌发液；
三、取孢子萌发液0.5ml，置于1.5ml离心管中，将待测定萌发的孢子加入孢子萌发液中；
四、将离心管盖好盖子，置于温度为28℃的摇床中，以100rpm的转速培养6h；
五、从摇床中取下离心管，以枪头吹吸培养液，使孢子均匀悬浮于液体中，吸出适量滴在干净载玻片上，加盖盖玻片。
悬滴法、琼脂法、培养皿法同样是采用上述步骤二中的孢子萌发液，计算上述四种方法的孢子萌发率时，都是在显微镜下随机选取3个视野进行计算，然后计算三次萌发率的平均值，最后结果如下：悬滴法的孢子萌发率65％、琼脂法的孢子萌发率63％、培养皿法的孢子萌发率64％、本发明的孢子萌发率65％。
上述四种方法随机选取的3个视野中孢子的平均数为：悬滴法的孢子个数为40个、琼脂法的孢子个数为36个、培养皿法的孢子个数为50个、本发明的孢子个数为60个。
实施例3：
相对于本发明本实施例包括以下步骤：
一、收集目标真菌的孢子；
二、配置5％的葡萄糖无菌水溶液，混匀并制成孢子萌发液；
三、取孢子萌发液0.5ml，置于1.5ml离心管中，将待测定萌发的孢子加入孢子萌发液中；
四、将离心管盖好盖子，置于温度为30℃的摇床中，以150rpm的转速培养24h；
五、从摇床中取下离心管，以枪头吹吸培养液，使孢子均匀悬浮于液体中，吸出适量滴在干净载玻片上，加盖盖玻片。
悬滴法、琼脂法、培养皿法同样是采用上述步骤二中的孢子萌发液，计算上述四种方法的孢子萌发率时，都是在显微镜下随机选取3个视野进行计算，然后计算三次萌发率的平均值，最后结果如下：悬滴法的孢子萌发率93％、琼脂法的孢子萌发率95％、培养皿法的孢子萌发率93％、本发明的孢子萌发率95％，从结果来看四种方法的萌发率比较接近。
上述四种方法随机选取的3个视野中孢子的平均数为：悬滴法的孢子个数为60个、琼脂法的孢子个数为66个、培养皿法的孢子个数为70个、本发明的孢子个数为80个。
从上述三个实施例的实验数据可以看出来：本方法与其他三种传统的计算孢子萌发率的结果比较相近，因此采用本方法计算孢子的萌发率从而对孢子进行研究完全是可行的；再者，通过比较孢子的数量的数据可以看出来：本发明的孢子个数与培养皿法都是比较多的，两种方法都便于观察且都能为孢子萌发的研究提供比较大的基数，但是培养皿法需要持续的进行保湿，费时费力，且本方法通过摇床震荡，使孢子的萌发更加的均匀，因此本发明完全能适用于孢子萌发的研究。

Claims (4)

1.一种研究真菌孢子萌发的方法，本发明包括以下步骤：
一、收集目标真菌的孢子；
二、配置2-5％的葡萄糖无菌水溶液，混匀并制成孢子萌发液；
三、取孢子萌发液0.5ml，置于1.5ml离心管中，将待测定萌发的孢子加入孢子萌发液中；
四、将离心管盖好盖子，置于温度为27-30℃的摇床中，以75-150rpm的转速培养12h；
五、从摇床中取下离心管，以枪头吹吸培养液，使孢子均匀悬浮于液体中，吸出适量滴在干净载玻片上，加盖盖玻片，在显微镜下观察孢子的萌发情况，并计算萌发率；
六、将步骤五中离心管内含孢子培养液继续放入摇床中并重复步骤四的工作，之后再通过步骤五计算孢子萌发率。
2.根据权利要求1所述的研究真菌孢子萌发的方法，往步骤四中摇好的含孢子培养液中加入酸或碱，从而研究不同PH对孢子萌发的影响。
3.根据权利要求1所述的研究真菌孢子萌发的方法，往步骤四中摇好的含孢子培养液中加入孢子萌发抑制剂或促进剂，观察其对孢子萌发的影响。
4.根据权利要求1所述的研究真菌孢子萌发的方法，往步骤四中摇好的含孢子培养液中加入拮抗细菌，观察细菌对孢子萌发的影响。
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