CN106434593B - 一种用于常温保存dna聚合酶的微球材料、制备方法及其应用 - Google Patents
一种用于常温保存dna聚合酶的微球材料、制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于常温保存DNA聚合酶的微球材料、制备方法及其应用。该制备方法包括如下步骤:采用钙离子对微球分子筛MCM‑41进行钙化,钙化微球分子筛MCM‑41通过吸附DNA聚合酶经干燥得所述可以常温保存、运输的固定化DNA聚合酶。本发明酶固定化的方法具有操作简单、催化吸附性能好、实现条件温和等优点。分别通过控制钙离子的固载和DNA聚合酶的固载,可以使固定化DNA聚合酶微球中酶的稳定性得到极显著提高,而DNA聚合酶活性基本保持不变甚至有所升高。以上优点使该固定化DNA聚合酶的微球区别于常规的酶固定化方法,在DNA聚合酶的保存、运输中节约能耗、降低成本,在分子生物学领域、生命科学等领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,尤其是涉及一种用于常温保存DNA聚合酶的微球材料、制备方法及其应用。
背景技术
DNA聚合酶是生物催化脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的一类酶,是DNA生物合成过程中所必须的酶复合体,具有催化DNA的合成及其相辅的活性。随着分子生物学的发展,聚合酶链式反应(PCR)技术于1985年由美国Mullis发明诞生,并得到迅速的发展,目前已成为分子生物学、生命科学等领域及其重要的技术手段,被广泛应用于基因扩增、基因克隆、基因改造、传染病源分析、遗传指纹鉴定等生物领域。DNA聚合酶作为PCR技术的重要因素之一,在PCR过程中起着至关重要的作用,在某种意义上讲,PCR技术就是DNA聚合酶的技术。目前,耐热DNA聚合酶的发现使得PCR技术变得非常简捷,并且大大降低了PCR技术的成本,推动了PCR技术的发展和应用,但是目前如果长时间保持DNA聚合酶的活性,在DNA聚合酶的保存和运输仍需要在-20 ℃条件下进行,不仅使得其成本较高、操作和运输不便,而且酶的活性有不同程度的下降。近年来,对于其他酶类在保存、运输过程中稳定性和活性问题的研究已经有较多报道,主要是采用酶的固定化方法,但是针对DNA聚合酶鲜有报道,因此,选择合适的载体对DNA聚合酶进行固定提高其在常温下保存、运输的稳定性和活性具有极其重要的意义。
目前,酶的固定化载体主要采用分子筛、硅胶、活性炭、壳聚糖等材料,分子筛作为载体材料已广泛应用于酶的固定化,新型介孔分子筛材料由于具有纳米级规则孔道、巨大的比表面积在酶催化、吸附、分离等领域具有较高的应用价值。有研究报道金属离子(钙离子、镁离子、铁离子、亚铁离子等)与酶形成的复合物可以使酶的稳定性得到显著提高,并且酶活性保持不变甚至有所提高。本发明研究的目的是开发一种用于常温保存DNA聚合酶的材料,以期解决DNA聚合酶在保存和运输中稳定性和活性差、成本高等问题,为DNA聚合酶的应用及其在分子生物学领域的发展提供思路和方法。
发明内容
针对现有技术中的不足,本发明所要解决的技术问题是提供一种钙化分子筛作为载体固定化DNA聚合酶的方法,用于DNA聚合酶的常温保存、运输,该方法具有操作简单、酶的稳定性好、活性强、回收率高等特点。
本发明所提供的一种用于DNA聚合酶常温保存的微球材料,所述微球材料为钙化微球分子筛材料,所述钙化微球分子筛中钙的负载量为3~10wt%。
所述钙化微球分子筛的制备,采用钙离子对微球分子筛MCM-41进行钙化,获得钙化微球分子筛MCM-41。
进一步的,所述钙化微球分子筛是采用钙离子对微球分子筛进行改性,钙离子来源于氯化钙、硝酸钙,微球分子筛为MCM-41分子筛(粒径为37.5~100 nm、比表面积1100cm2/g、孔容1 mL/g)。
所述钙离子对微球分子筛MCM-41进行钙化的方法具体为采用等体积浸渍法,所述钙离子溶液与微球MCM-41的体积比为1:1,钙离子溶液加入煅烧过的微球MCM-41分子筛,混合,在120~180 r/min、30~50 ℃、6~24 h条件下进行磁力搅拌,收集固体产物,120 ℃下干燥12 h得到钙化微球分子筛。
所述钙离子溶液的浓度为0.75~2.50 mol/L。
基于所述DNA聚合酶常温保存的微球材料的DNA聚合酶常温保存方法,钙化微球分子筛对DNA聚合酶的吸附与固定,将步骤1)所得的钙化微球分子筛MCM-41吸附DNA聚合酶,经干燥得所述可以常温保存、运输的固定化DNA聚合酶。
进一步的,所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶等。
进一步的,所述方法还包括将DNA聚合酶配置成DNA聚合酶水溶液,即DNA聚合酶的磷酸盐缓冲液,所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.0。
进一步的,所述钙化微球分子筛MCM-41吸附DNA聚合酶具体为将DNA聚合酶水溶液滴加到所述的钙化微球MCM-41分子筛中,经恒温振荡固定6 h后,过滤,用磷酸缓冲液反复冲洗后冷冻干燥得到固定化DNA聚合酶微球。
所述DNA聚合酶水溶液与钙化微球分子筛的体积比为1:50,DNA聚合酶水溶液的浓度为0.05~0.50 mol/L。
本申请还包括钙离子在增强DNA聚合酶的稳定性中的应用,一定范围钙离子含量可以显著提高DNA聚合酶的稳定性,大于或者小于该含量范围,DNA聚合酶的稳定性没有变化甚至降低。
有益效果:
与现有技术相比,本发明首次公开了一种用于常温保存DNA聚合酶的微球材料、制备方法及其应用,采用钙离子对微球分子筛MCM-41进行钙化,钙化微球分子筛MCM-41通过吸附DNA聚合酶经干燥得到可以常温保存、运输的固定化DNA聚合酶。本发明所述方法具有操作简单、催化吸附性能好、实现条件温和等优点。以上优点使该固定化DNA聚合酶的微球区别于常规的酶固定化方法,在DNA聚合酶的保存、运输中节约能耗、降低成本,在分子生物学领域、生命科学等领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1 本发明实施实例1、3所制备的固定化Taq DNA聚合酶微球(A、C)与天然TaqDNA聚合酶常温下相对活性随时间的变化曲线。
图2本发明实施实例2、4所制备的固定化Tth DNA聚合酶微球(B、D)与天然Tth DNA聚合酶常温下相对活性随时间的变化曲线。
具体实施方式
以下结合附图实施实例对本发明作进一步详细描述。
本发明一种用于DNA聚合酶常温保存的微球材料,采用钙离子对微球分子筛MCM-41进行钙化,钙化微球分子筛MCM-41通过吸附DNA聚合酶经干燥得用于常温保存、运输的固定化DNA聚合酶。
实施实例1
本发明DNA聚合酶常温保存的微球材料,采用氯化钙对微球分子筛MCM-41进行钙化,钙化微球分子筛MCM-41通过吸附Taq DNA聚合酶经干燥得到常温保存的固定化Taq DNA聚合酶,具体制备方法如下:
(1)配制钙离子浓度为1.0 mol/L的氯化钙溶液。
(2)将步骤(1)的氯化钙溶液与煅烧过的微球MCM-41分子筛(孔容1 mL/g)按照体积比为1:1进行等体积浸渍。
(3)将步骤(2)的氯化钙和微球MCM-41分子筛混合物在150 r/min、40 ℃条件下进行磁力搅拌12 h。
(4)收集步骤(3)的固体产物,120 ℃下干燥12 h得到钙化微球分子筛。
(5)配制浓度为0.20 mol/L的Taq DNA聚合酶水溶液,水溶液即为pH7.0的磷酸缓冲液。
(6)将步骤(5)的Taq DNA聚合酶水溶液按照1:50的体积比滴加到步骤(4)钙化微球MCM-41分子筛中。
(7)对步骤(6)的混合物进行恒温振荡固定6 h后过滤,滤渣用磷酸缓冲液(pH7.0)反复冲洗后经冷冻干燥制得固定化Taq DNA聚合酶微球。
实施实例2
本发明DNA聚合酶常温保存的微球材料,采用氯化钙对微球分子筛MCM-41进行钙化,钙化微球分子筛MCM-41通过吸附Tth DNA聚合酶经干燥得到常温保存的固定化Tth DNA聚合酶,具体制备方法如下:
(1)配制钙离子浓度为1.0 mol/L的硝酸钙溶液。
(2)将步骤(1)的硝酸钙溶液与煅烧过的微球MCM-41分子筛(孔容1 mL/g)按照体积比为1:1进行等体积浸渍。
(3)将步骤(2)的硝酸钙和微球MCM-41分子筛混合物在150 r/min、40 ℃条件下进行磁力搅拌12 h。
(4)收集步骤(3)的固体产物,120 ℃下干燥12 h得到钙化微球分子筛。
(5)配制浓度为0.20 mol/L的Tth DNA聚合酶水溶液,水溶液即为pH7.0的磷酸缓冲液。
(6)将步骤(5)的Tth DNA聚合酶水溶液按照1:50的体积比滴加到步骤(4)钙化微球MCM-41分子筛中。
(7)对步骤(6)的混合物进行恒温振荡固定6 h后过滤,滤渣用磷酸缓冲液(pH7.0)反复冲洗后经冷冻干燥制得固定化Tth DNA聚合酶微球。
实施实例3
同实施实例1,其区别在于:
将钙离子浓度为2.5 mol/L的氯化钙与煅烧过的微球MCM-41分子筛(孔容1 mL/g)按照体积比为1:1进行等体积浸渍;混合后在150 r/min、40 ℃条件下进行磁力搅拌12 h;120 ℃下干燥12 h得到钙化微球分子筛;将0.20 mol/L的Taq DNA聚合酶水溶液按照1:50的体积比滴加到钙化微球MCM-41分子筛;温振荡固定6 h后过滤,滤渣用磷酸缓冲液(pH7.0)反复冲洗后经冷冻干燥制得固定化Taq DNA聚合酶微球。
实施实例4
同实施实例2,其区别在于:
将钙离子浓度为1.0 mol/L的氯化钙与煅烧过的微球MCM-41分子筛(孔容1 mL/g)按照体积比为1:1进行等体积浸渍;混合后在150 r/min、40 ℃条件下进行磁力搅拌12 h;120 ℃下干燥12 h得到钙化微球分子筛;将0.50 mol/L的Tth DNA聚合酶水溶液按照1:50的体积比滴加到钙化微球MCM-41分子筛;温振荡固定6 h后过滤,滤渣用磷酸缓冲液(pH7.0)反复冲洗后经冷冻干燥制得固定化Tth DNA聚合酶微球。
对比试验
分别取实施实例1、2、3、4制备的固定化DNA聚合酶微球(A、B、C、D)和对应的天然酶粉末,采用ATP发光检测试剂盒测定固定化DNA聚合酶微球和天然酶粉对应的酶活性,通过分别拟合固定化DNA聚合酶微球和天然酶粉的酶活性与时间的关系曲线,分别计算斜率,其中固定化DNA聚合酶微球或天然酶粉的初始斜率定义为100%酶活,每隔一段时间测定一次,每次测定斜率除以固定化DNA聚合酶微球或天然酶粉的初始斜率即为固定化DNA聚合酶微球或天然酶粉的相对活性,共测定60天。分析结果如图1、2所示。
由图1可知,与天然Taq DNA聚合酶相比,固定化Taq DNA聚合酶微球的稳定性随时间延长而变化不大;在前期(10天内)其活性有轻微程度的降低;随着时间的延长,固定化Taq DNA聚合酶微球的稳定性趋于稳定,在长达2个月的时间常温条件下,固定化Taq DNA聚合酶微球的相对活性都维持在80%左右;在钙离子浓度不同的情况下(A、C钙离子浓度分别为1.0、2.5 mol/L),钙离子浓度升高,固定化Taq DNA聚合酶微球的稳定性有一定程度的提升。综上所述,该固定化Taq DNA聚合酶的方法可以有效地保持Taq DNA聚合酶常温下的稳定性和活性,可用于Taq DNA聚合酶的常温保存、运输,并且选择合适的钙离子浓度可以更大程度维持其稳定性和活性。
由图2可知,与天然Tth DNA聚合酶相比,固定化Tth DNA聚合酶微球的稳定性随时间延长而变化不大;在前期(8天内)其活性有轻微程度的降低;随着时间的延长,固定化TthDNA聚合酶微球的稳定性趋于稳定,在长达2个月的时间常温条件下,固定化Tth DNA聚合酶微球的相对活性都维持在75%以上;在Tth DNA聚合酶浓度不同的情况下(B、D Tth DNA聚合酶浓度分别为0.2、0.5 mol/L),Tth DNA聚合酶浓度升高,固定化Tth DNA聚合酶微球的稳定性有一定程度的提升。因此,该固定化Tth DNA聚合酶的方法可以有效地保持Tth DNA聚合酶常温下的稳定性和活性,可用于Tth DNA聚合酶的常温保存、运输,并且选择合适浓度的DNA聚合酶浓度进行固定化可以更大程度地维持固定化DNA聚合酶微球中DNA聚合酶的稳定性和活性。
当然,上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内,作出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种微球材料在DNA聚合酶常温保存中的应用,其特征在于,所述微球材料为钙化微球分子筛材料,所述钙化微球分子筛中钙的负载量为3~10wt%;所述钙化微球分子筛为钙化微球分子筛MCM-41,粒径为37.5-100 nm、比表面积1100 cm2/g、孔容1 mL/g;将所述钙化微球分子筛MCM-41吸附DNA聚合酶,经干燥得所述可以常温保存、运输的固定化DNA聚合酶微球;所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶。
2.如权利要求1所述的应用,其特在于,所述钙化微球分子筛的制备方法为:采用等体积浸渍法,钙离子溶液与微球MCM-41的体积比为1:1,钙离子溶液加入煅烧过的微球MCM-41分子筛,混合,在120~180 r/min、30-50 ℃、6-24 h条件下进行磁力搅拌,收集固体产物,120 ℃下干燥12 h得到钙化微球分子筛。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于:钙离子来源为氯化钙、硝酸钙中的一种,所述钙离子溶液的浓度为0.75-2.50 mol/L。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述将所述钙化微球分子筛MCM-41吸附DNA聚合酶,经干燥得所述可以常温保存、运输的固定化DNA聚合酶微球的具体过程为:
将DNA聚合酶配置成DNA聚合酶水溶液,即DNA聚合酶的磷酸盐缓冲液;将DNA聚合酶水溶液滴加到所述的钙化微球MCM-41分子筛中,经恒温振荡固定6 h后,过滤,用磷酸缓冲液冲洗后冷冻干燥得到固定化DNA聚合酶微球。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述DNA聚合酶水溶液与钙化微球分子筛的体积比为1:50。
6.如权利要求4所述的应用,其特征在于,DNA聚合酶水溶液的浓度为0.05~0.50 mol/L。
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