CN106414415A - 用于抑制雄性生育力的小分子 - Google Patents

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Abstract

提供了适用于提供雄性避孕的化合物、鉴定这些化合物的测定方法以及使用所述化合物提供避孕的方法。在一个实施方案中，本文所述化合物可模拟抗‑EPPIN抗体结合到EPPIN，因而可抑制人类和其他灵长类精子的前向运动。另一个实施方案中，本文所述化合物可抑制或增强EPPIN‑精液凝固蛋白的结合，并抑制精子的前向运动。本文所述的测定可鉴定可抑制精子活力的化合物，并且可使用标记的重组EPPIN和精液凝固蛋白以高通量方式进行。所述化合物可用于经口服或经皮肤组合物中以临时和可逆地抑制雄性生育力。其还可以在杀精组合物中作为杀精子剂的补充或替代使用，例如与避孕套、隔膜和杀精子胶冻剂结合使用。

Description

用于抑制雄性生育力的小分子
背景技术
过去的50年，避孕对人类社会具有重要影响并且影响到全世界的家庭规模分布和生育率差异(Bongaarts and Watkins,1996；Bongaarts,1997)。这种影响很大程度上归因于女性避孕方法、其有效度及经济和社会成本。
另一方面，男性避孕的全球影响要小得多，主要局限于避孕套和输精管切除术(Nass and Strauss,2004)。雌性激素避孕药通过停止排卵机制起作用，雄性激素避孕药研究的目标是类似的，即抑制精子发生以导致精子缺乏。但是，以可靠的方式实现该目标用于不同男性群体还需要许多年(Grimes et al.,2005；Potts,1996)。
更遥远的理想是非激素雄性避孕药，可预想的包括精子不发育、或不游动、或不受精，或者所述精子变异的一些组合。许多避孕药靶标众多，其中数种靶标值得进一步探索，包括阻断跨膜离子电流(Kirichok et al.,2006；Brenton et al.,1996)、破坏支持细胞-生殖细胞粘附(Cheng et al.,2002,2005)以及通过亚氨基糖类破坏精子形成(Walden etal.,2006)。
多年来显示出具有很大希望的免疫避孕已失去吸引力。但是，免疫避孕可作为用于识别雄性体内靶分子功能的策略。例如，EPPIN是一种包被在人类精子表面的附睾蛋白酶抑制剂。EPPIN可调节PSA(前列腺特异抗原，一种丝氨酸蛋白酶)活性及精液凝固蛋白(semenogelin)的水解作用。虽然EPPIN可通过PSA调节精液凝固蛋白的水解作用，但是EPPIN的抗体却不能抑制PSA活性。
猴类和人类的射精精子由EPPIN包被。在精子表面，EPPIN可结合精液凝固蛋白，其是射精过程中由精囊分泌的。EPPIN-精液凝固蛋白复合体在射精后首个30分钟精液的液化过程中被移除。未能移除精液凝固蛋白会形成不育精子。对于EPPIN和精液凝固蛋白的相互作用及其对人类精子影响的研究的描述可见例如Wang,Z.，Widgren,E.E.，Sivashanmugam,P.，O'Rand,M.G.和Richardson,R.T.2005.Association of EPPIN with semenogelin onhuman spermatozoa,Biology of Reproduction 72(4):1064-1070(2004年12月8日)。
开发新避孕药的一种策略是使用特异的精子表面抗原免疫灵长类，并测定免疫响应对经过免疫的雄性射精精子的影响。近期对于EPPIN(SPINLW1；类丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有Kunitz和WAP结构域-1)的研究提供了免疫避孕法的应用实例(O'Rand et al.,2004；Wang et al.,2005；O'Rand et al.,2006)。生育力研究(O'Rand et al.,2004)显示有效且可逆的灵长类雄性免疫避孕是可实现的目标。高血清滴度(>1:1000)可持续数月达到有效避孕水平。使用来自灵长类的EPPIN抗体处理人类精子显示，处理精子的活力减低，结果见例如O’Rand,M.G.,Widgren,E.E.,Beyler,S.and Richardson,R.T.2009.Inhibition ofhuman sperm motility by contraceptive anti-EPPINantibodies from infertilemale monkeys:effect on cyclic adenosine monophosphate,Biology of Reproduction80:279-285(2008年10月22日)。
数据来自纯化的抗-EPPIN抗体的亲和力分析。与对照相比，运行的总距离减少71％(p<6.26×10-10)且直线距离减少57％(p<5.37×10-25)同时速率下降71％(p<3.96×10-8)，从而判断抗-EPPIN抗体处理后人类精子的前向运动显著改变。同时，所述抗体可增大直线向量(距离)和转向之间的弯曲角，即头部的前后运动(迂曲度)。
结果，除人们希望得到关于使用免疫避孕可行性的结论之外，还可以从EPPING对生育力具有重要作用的研究中得出结论。
抗体如果口服给药则在胃中易被降解，因此通常通过注射给药。如果需要常规注射则雄性避孕未必切实可行，因此具有小分子且能够结合EPPIN并抑制抗-EPPIN或精液凝固蛋白结合将是有利的。本发明提供了所述化合物、鉴定所述化合物的测定及其使用方法。
发明内容
本发明提供了适用于通过抑制人类及其他灵长类精子的前向运动提供雄性避孕的化合物、鉴定所述化合物的方法及使用所述化合物提供避孕的方法。
开发非激素雄性避孕药可增强全球的家庭计划，并给予男性和女性另外的避孕选择。当前男性的避孕选择局限于避孕套和输精管切除术。近期调查发现，女性对于除输卵管结扎术之外所有方法的避孕满意度低于60％，男性希望使用更好的避孕药。因此，非激素雄性避孕药将填补未能满足的避孕需求。
EPPIN(SPINLW1；附睾蛋白酶抑制剂)以含乳铁传递蛋白和丛生蛋白的EPPIN蛋白复合体(EPC)包被人睾丸、附睾和射精精子的表面。EPPIN是本发明所述测定的靶标。
射精过程中，精液凝固蛋白(SEMG1)结合到复合体中的EPPIN，抑制射精精子的前向运动。EPPIN-精液凝固蛋白复合体位于精子表面。然后，SEMG1被丝氨酸蛋白酶PSA水解并且EPPIN调节PSA对精子表面SEMG1的水解，产生前向运动精子。
之前对来自不能生育猴类抗血清的研究发现了抗-EPPIN的2个线性B-细胞表位，一个在N-末端、另一个在C-末端。C-末端表位经鉴定为TCSMFVYGGCQGNNNNFQKANCLN(SEQ IDNO.1)。针对该表位的抗体可抑制精子活力及精液凝固蛋白结合。
免疫避孕(即使用抗体产生避孕)未被认为是市售产品的可行选择，由于效率、安全和经济因素。因此，在一个实施方案中，本发明涉及可模拟抗-EPPIN抗体从而抑制精子前向运动的小的有机化合物(即以与抗-EPPIN抗体相同的位点或基本上相同的位点结合EPPIN，从而可作为所述抗体的小分子模拟物的化合物)、其鉴定方法及其用于提供雄性避孕的方法。所述化合物可以例如口服给药，并且在射精之前相对短的时间内按需服用。
基于2004年Science上的一篇文章显示了阻断EPPIN-SEMG1相互作用可导致用EPPIN以高滴度免疫的雄性猴完全且可逆的避孕的“原理循证”，将小的有机先导化合物开发作为精子避孕药。相应地，在一个实施方案中，所述化合物可抑制精液凝固蛋白结合到EPPIN。可通过装配进入精子表面上的EPPIN-SEMG1结合位点抑制精子活力的小的有机化合物可口服给药，并根据需要在射精前相对较短的时间服用。
该实施方案中，可用的化合物包括a)可结合到EPPIN上的精液凝固蛋白(本文中也称作Sg)结合位点的化合物或者可通过抑制精液凝固蛋白结合的方式结合到变构位点的化合物，以及可模拟精液凝固蛋白效应即可阻止精子游动的化合物。理想地，可干扰EPPIN与精液凝固蛋白结合的那些化合物以比精液凝固蛋白更高的亲和力与活性结合口袋结合。这使得可给予比以较低亲和力结合的化合物更低的有效浓度的化合物。以异构方式结合的那些化合物理想地也是高亲和力化合物，因此也可给予较低有效浓度的化合物。
本发明除所述化合物以外，还包括测定，所述测定可鉴定能够抑制精子前向运动的化合物。在一个实施方案中，所述化合物可结合到与抗-EPPIN抗体相同的位点，因此可作为所述抗体的小分子模拟物。另一个实施方案中，所述化合物可通过抑制EPPIN-精液凝固蛋白结合来抑制精子活力。
已建立并验证了2种可高通量筛选(HTS)化合物的测定。在一个实施方案中，这些测定是基于PerkinElmer(Waltham,MA)开发的AlphaScreenTM测定的改编。AlphaScreenTM(扩增发光邻近均质测定)测定中，将供体珠和受体珠(～200nm)用于保持相互作用蛋白分子。当相互作用蛋白分子结合时(例如EPPIN{在供体珠上}和抗-EPPIN{在受体珠上})，单重态氧分子从供体珠扩散到受体珠(～4μsec)，随后荧光团发射520-620nm光。在初级化合物筛选中，将组氨酸标记的重组人EPPIN附着到NTA-供体珠，将抗-EPPIN(S21C；针对EPPIN C-末端结构域)附着到蛋白A-受体珠。这种表位特异的测定产生EPPIN和抗体之间强且稳定的结合。
该实施方案的一个方面中，对于二级化合物筛选，可使用结合生物素化SEMG1的供体珠和通过抗-EPPIN(N-末端)抗体结合EPPIN的受体珠和蛋白A-受体珠。该测定可使得SEMG1结合到EPPIN C-末端上的其EPPIN结合位点。该实施方案的另一方面中，对于对照化合物筛选，可将改良的TruHits测定用于非特异性磁珠结合。
一旦确定了化合物活性，同样重要的是确定其他药理性质，包括吸附、分布、代谢、排泄和毒理学。许多已知筛选实验中的任何一种均可用于该目的。例如，称为的细胞毒性测定，Promaga公司的发光细胞活力测定，其是一种可用于确定化合物毒性的自动化高通量细胞增殖及细胞毒性筛选。
另一个实施方案中，计算机辅助精子分析(CASA)可作为用于确定化合物对人类精子活力影响的活细胞化合物筛选。此外，为促进使用不同精液的化合物IC50评价，减少由于不同精液样本中精子质量差异而导致的测定间误差，开发了相对活力抑制指数(RMI)。
其计算为:RMI＝[％活力*VSL]；活动精子百分比(％活力)或前向运动精子百分比(％前向运动，RPMI)乘以直线速度(VSL)；测定了从轨迹开始到结束的直线平均速度，以μm/sec为单位。
归一化RMI可通过用每种实验条件的RMI除以相应的DMSO对照计算。
使用上述测定，筛选了超过100,000种化合物。所述筛选的数据可鉴定先导化合物的结构簇。本文中描述的一种活性化合物簇是TZ4系列。TZ4系列是具有1,3,5三嗪环的化合物。TZ4先导化合物家族是由其他系列的起始筛选循环开发的。基于化合物对接研究，使用EPPIN C-末端的SEMG1结合位点，合成了先导化合物。
在体内，避孕药必须结合到附睾中的EPPIN，并且在射精过程中结合到抗-EPPIN抗体的结合位点，与精液凝固蛋白(SEMG1)竞争结合到精子表面的EPPIN，或者增强精液凝固蛋白与EPPIN的结合。计算所得SEMG1抑制精子活力的EC50值是8.8μM。活性化合物理想的EC50值在该EC50值的一个数量级范围内，虽然具有较高或较低EC50值的化合物也是有用的，只要其可以有效剂量安全地施用。
TZ4先导化合物家族中，TZ4_121([4-(3-羟基-4-甲氧基羰基氨基-苯基氨基)-6-(N'甲氧基羰基-肼基)-1,3,5-三嗪-2-基硫烷基]-乙酸乙酯]和2.[2-氨基-5-[4-乙氧基羰基甲基硫烷基-6-(N'-甲氧基羰基-肼基)[1,3,5]三嗪-2-基氨基]-苯甲酸甲酯])的CASAIC50RPMI值为7.5μM。TZ4_121可在3分钟内杀死>70％精子。预测其在体内对活力的影响与SEMG1相同。
Lipinski五规则是评价化合物是否具有可使其成为人类可口服活性药物性质的概测法。所述规则描述了对人体内药代动力学重要的分子性质，包括其吸收、分布、代谢和排泄(“ADME”)。依据该规则，化合物应具有不超过5个氢键供体(氮氢键和氧氢键总数)，不超过10个氢键受体(所有氮或氧原子)，分子量小于500道尔顿，并且辛醇-水分配系数log P不大于5。本文所述化合物中，最具活性化合物TZ4_121(另外的氢键受体除外)不违反该规则。因此，相信本文所述化合物可口服生物利用。
除可模拟抗-EPPIN抗体的化合物以外，还发现某些化合物与精液凝固蛋白结合相同的EPPIN位点(与变构位点相反)，并且比精液凝固蛋白结合更紧密，因此可抑制EPPIN-精液凝固蛋白复合体形成。其他化合物可结合EPPIN的变构位点，并以这种方式抑制EPPIN-精液凝固蛋白复合体形成。还有其他化合物可增强EPPIN-精液凝固蛋白复合体形成。任意所述实施方案可抑制精子前向运动。
可模拟抗-EPPIN抗体与EPPIN结合或者可抑制精液凝固蛋白结合到EPPIN并因此可抑制精子前向运动的化合物可用于临时且可逆地产生雄性不育。
所述化合物可包含在组合物中，其理想地是口服或经皮肤的组合物，其可释放适量的化合物以产生所述效应。例如，所述化合物可以每日一次的片剂或丸剂使用，或者以皮肤贴片使用超过一天的一段时间，很大程度上与女性避孕药方式相同。
另一个实施方案中，所述化合物可用于补充或替代杀精子组合物中的杀精子剂，例如与避孕套、隔膜和杀精胶冻剂(jelly)结合使用的那些。也就是说，由于所述化合物与精子接触即可具有抑制前向运动的功能，不需要将其摄入以发挥作用。
因此，本文所述的本发明具有超越现有技术的优势，所述优势在于使用者可选择具有体内活性的化合物的雄性避孕以在射精前抑制精子的前向运动，或者在射精后使用所述化合物以抑制精子的前向运动。
参考以下详细描述可更好地理解本发明。
附图说明
图1是示出TZ4_121化合物分析结果的图表。
图2是示出TZ4_121化合物IC50值的图表，数据以对照值vs.Log TZ4_121浓度的百分比示出。
图3和4是示出使用计算机辅助精子分析(CASA)所评估的精液凝固蛋白(图3)及化合物TZ4-121(图4)的IC50值的图表。数据以log精液凝固蛋白浓度或log TZ4_121浓度(log(μM)vs.RMI(相对活力指数))示出。
图5是TZ4_121抑制精子活力有效度的时程研究，RMI vs.孵育分钟。×代表DMSO(对照)；圆代表浓度10μM的TZ4_121；三角形代表浓度20μM的TZ4_121。
图6是示出使用缓冲液(对照)、10μM和20μM TZ4_121以及抗-EPPIN抗体(Ab007)处理后内部精子pH减低的图表。
图7是示出使用12.5μM的TZ4_121处理后精子活力变化的图表。3对柱的每一对中，最左边柱为对照，最右边柱是处理后的对照百分比。活力以速度(μm/sec)、前向运动百分比和％活力形式示出。
图8是精液凝固蛋白(SEMG1)的氨基酸E229-Q247与EPPIN结合的图示，图示显示精液凝固蛋白结合EPPIN的氨基酸Y107和N114。
图9示出TZ4_121与EPPIN的C-末端部分的对接结果，其使用Swiss-Dock法。
图10示出施用TZ4-121(在图中称为EP7)、EP12、TZ4-121的去甲基化代谢物后精子活力变化(RMI,使用％前向运动(PM))的图表。空心环代表2013年7月12日进行的EP7实验，三角形代表EP12，实心环代表与EP12相同时间进行的EP7实验。
具体实施方式
提供了适用于提供雄性避孕的化合物、鉴定这些化合物的测定方法以及使用所述化合物提供避孕的方法。
雄性避孕靶标EPPIN通过结合精液凝固蛋白(SEMG1)控制精液中的精子活力，这种结合可降低精子pH值，导致细胞内钙的损失和精子活力的丧失。抗-EPPIN抗体可替代SEMG1并具有类似的效果。本文描述了模拟抗EPPIN结合的小分子量化合物，其可代替SEMG1，并提供非抗体、非激素雄性避孕药。本文还描述了用于鉴定所述化合物的测定法，以及将所述化合物用作避孕药的方法。
参考以下定义可更好地理解本发明。
定义
EPPIN(SPINLW1；类丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有Kunitz和WAP结构域1)是乳清酸性蛋白(WAP)型四二硫化物核心域(WFDC)基因家族成员。WFDC基因位于人染色体20q12-q13上的着丝粒和端粒两个基因簇中(Clauss et al.,2002)。EPPIN是端粒簇中的WFDC 7，并且是以编码Kunitz-型和WAP-型四二硫化物核心域蛋白酶抑制剂共有序列为特征的WFDC基因的原型(Richardson et al.,2001)。
EPPIN是睾丸/附睾特异蛋白(Richardson et al.,Gene 270,93(2001)和Sivashanmugam,et al.,Gene 312,125(2003))。人类20号染色体上的EPPIN基因编码两个亚型，一个含有分泌信号序列另一个不含，各包含Kunitz-型和WAP-型(四二硫化物核心域)蛋白酶抑制剂共有序列。EPPIN代表人类20号染色体上蛋白酶抑制剂家族的第一类成员，其特征在于双抑制剂共有序列(ibid)。具有差异表达的3种EPPIN剪接变体，EPPIN-1在睾丸和附睾中表达，EPPIN-2在附睾中表达，EPPIN-3在睾丸中表达。
重组人类EPPIN(rhEPPIN)的制备已有详细描述(Wang et al.,Biology ofReproduction,72:1064-1070(2005))，并且用于本发明实施例中的rhEPPIN缺失部分N-末端分泌信号序列，如Wang et al.,ibid中所述。简言之，在大肠杆菌菌株M15[pREP-4]中制备rhEPPIN，并且在Ni2+-NTA柱(Qiagen,Valencia,Calif.；21)上从细菌裂解液中纯化蛋白。纯化的rhEPPIN使用前用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.2)彻底地透析。本文所述测定中使用的重组EPPIN已使用FLAG标签标记。
精液凝固蛋白I(SgI)和精液凝固蛋白II(SgII)是由新射出的人类精液形成的凝结物的主要蛋白组分。这些蛋白主要见于精囊中，虽然附睾中可产生少量SgII。这些蛋白迄今未在其他组织中检测到，Lundwall et al.,Mol.Hum.Reprod.8(9):805-10(2002年9月)。
精液凝固蛋白-1具有如下序列：
MKPNIIFVLS LLLILEKQAA VMGQKGGSKG RLPSEFSQFP
HGQKGQHYSG QKGKQQTESK GSFSIQYTYH VDANDHDQSR
KSQQYDLNAL HKTTKSQRHL GGSQQLLHNK QEGRDHDKSK
GHFHRVVIHH KGGKAHRGTQ NPSQDQGNSP SGKGISSQYS
NTEERLWVHG LSKEQTSVSG AQKGRKQGGS QSSYVLQTEE
LVANKQQRET KNSHQNKGHY QNVVEVREEH SSKVQTSLCP
AHQDKLQHGS DIFSTQDEL LVYNKNQHQT KNLNQDQQHG
RKANKISYQS SSTEERRLHY GENGVQKDVS QSSIYSQTEE
KAQGKSQKQI TIPSQEQEHS QKANKISYQS SSTEERRLHY
GENGVQKDVS QRSIYSQTEK LVAGKSQIQA PNPKQEPWHG
ENAKGESGQS TNREQDLLSH EQKGRHQHGS HGGLDIVIIE
QEDDSDRHLA QHLNNDRNPL FT(SEQ ID NO.2)
(French KC,Roan NR and Makhatadze GI,“Structural characterization ofsemen coagulum-derived SEM1(86-107)amyloid fibrils that enhance HIV-1infection,”Biochemistry,53(20),3267-3277(2014))。
本文中，重组精液凝固蛋白是His-标记的重组蛋白，例如Wang et al.,Biologyof Reproduction,72:1064-1070(2005)中所述的，其内容通过引用纳入本文，其首次描述了EPPIN-精液凝固蛋白结合。该论文中，描述了精液凝固蛋白的两种重组片段，其是通过聚合酶链式反应(PCR)鉴定的。起始于氨基酸164并延伸到氨基酸283的片段与EPPIN结合。该片段可适当地进行His-标记并用于本文所述测定。
术语“活性成分”或“活性剂”意指可抑制EPPIN-精液凝固蛋白结合且抑制精子前向运动的化合物及其任意前药、所述化合物和前药的药学上可接受的盐、水合物和溶剂合物。术语“其他成分”意指与本发明所述活性化合物或其任意前药及其药学上可接受的盐、水合物和溶剂合物进行配制的任意赋形剂、稀释剂、粘结剂、润滑剂、载体、表面活性剂及其混合物。
术语“适当的时间段”或“适合的时间段”意指达到需要的效应或结果所必须的一段时间。例如，可将混合物混合直至效价分布达到给定应用或所混合的混合物的使用可接受的范围。
本文中“载体(carrier)”或“载体(vehicle)”是指适于药物施用的载体材料，所述施用具体地包括口服和经皮肤施用，并且包括本领域公知的任意所述材料例如任意液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂等，其应是无毒的并且不以有害方式与所述组合物的其他组分相互作用。可用于经皮肤制剂的适合载体的实例包括水、醇类例如异丙醇和异丁醇、多元醇例如甘油，以及二醇类例如丙二醇和所述多元醇的酯类(例如单-、二-或三-甘油脂类)。
“受控制的”意指血液、血浆或通常存在于药理活性试剂的某些施用路径中的其他生物学流体中减低的或最小化的峰和谷暴露周期。
本文中，经皮肤制剂的“有效的”或“足够的”渗透促进剂意指可提供期望的皮肤渗透度增加以及相应地期望的渗透深度、施用速率及递送的药物量的渗透促进剂。
本文中，术语“有效量”意指通过本领域公知的考虑所确定的、可产生暂时和可逆的雄性避孕的量。
本文中，与经皮肤施用相关的“透性增强”或“渗透增强”是指皮肤对药理活性剂渗透度的提高，即，以提高药物渗透通过皮肤(即，通量)及进入血流的速率。使用所述促进剂增强的渗透可使用本发明实施例所述扩散池装置通过测定药物通过动物或人类皮肤或适合的高分子膜的扩散率(或通量)来观察。
“经皮肤”递送，申请人意图包括经皮肤(或“经皮”)以及经粘膜施用，即通过皮肤或粘膜组织传递药物进行递送并进入血液。
“持续的”意指持久保持活性化合物的稳态血浆水平。
术语“单位用量(unit dose)”、“单位剂量(unit dosage)”或“单位剂量形式”意指含有经计算可产生期望的治疗效应的预定数量活性成分的物理离散单元。剂型可以是任意适于施用的形式，例如经口服或经皮肤施用，所述形式是本领域技术人员公知的。
本文中术语“独立地”用于表示可独立应用的变量，不同应用之间变量可独立地变化。因此，例如化合物R”XYR”中，R”是“独立的碳或氮”，可以两个R”都是碳、两个R”都是氮、或者可以一个R”是碳而另一个R”是氮。
除非另有说明，否则本文中术语“烷基”是指饱和的直链、支链或环状的伯、仲、叔烃，包括取代的和未被取代的烷基。烷基可任选地被不会另外干扰反应或者可提供所述方法中的改进的任意基团取代，这些基团包括但不限于卤素、卤代烷基、羟基、羧基、酰基、芳基、酰氧基、氨基、酰氨基、羧基衍生物，烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫醇、亚胺基、磺酰基、硫烷基、亚磺酰基、氨磺酰基(sulfamonyl)、酯、羧酸、酰胺、膦酰基、氧膦基、磷酰基、膦、硫酯、硫醚、酰卤、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、膦酸、膦酸酯，未保护或根据需要保护，如本领域技术人员所公知的，例如Greene,et al.,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley and Sons,Second Edition,1991中所述的，其通过引用纳入本文。具体地包括CH2F和CHF2。
本文中，当使用术语C(烷基范围)时，该术语独立地包括该类的每个成员，如同具体且单独列出的那样。术语“烷基”包括C1-6烷基基团。本领域技术人员应理解，相关的烷基基团是通过使用后缀“-yl”取代后缀“-ane”命名的。
术语“烯基”是指直链或支链的不饱和烃基，其包含一个或多个双键。本发明公开的烯基可任选地用不会不利影响反应进程的任意基团取代，包括但不限于用于烷基基团上的取代基的那些基团。烯基的非限制性实例包括乙烯、甲基乙烯、异亚丙基、1,2-乙烷-二基、1,1-乙烷-二基、1,3-丙烷-二基、1,2丙烷-二基、1,3-丁烷-二基和1,4-丁烷-二基。
术语“炔基”是指直链或支链的不饱和无环烃基，其包含一个或多个三键。炔基可任选地用不会不利影响反应进程的任意基团取代，包括但不限于上述用于烷基的那些基团。适合的炔基的非限制性实例包括乙炔基、丙炔基、羟基丙炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、戊炔-2-基、4-甲氧基戊炔-2-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-1-基、己炔-2-基和己炔-3-基、3,3-二甲基丁炔-1-基。
术语“烷基氨基”或“芳基氨基”是指分别具有一个或两个烷基或芳基取代基的氨基。
除非另有定义，否则本文中术语“保护的”是指加入氧、氮或磷原子以阻止其进一步反应或为其他目的的基团。各种各样的氧和氮保护基团是有机合成领域技术人员公知的，并描述于例如Greene et al.,Protective Groups in Organic Synthesis中，同上。
单独或组合使用的术语“芳基”是指包含一个、两个或三个环的碳环芳族系统，其中所述环可以以悬垂方式连接在一起或者可以稠合。芳基的非限制性实例包括苯基、联苯基或萘基，或在从芳环除去氢后残留的其它芳族基团。术语芳基包含取代的和未取代的基团。
芳基可任选地用不会不利影响化合物合成的任意基团取代，包括但不限于上述用于烷基的那些基团。
一个实施方案中，芳基还可包括C5-10杂芳基环，例如噻吩、吡咯烷(pyrollidine)、吡啶和嘧啶，其可以与碳环芳基环相同的方式取代。
术语“烷芳基”或“烷基芳基”是指具有芳基取代基的烷基。术语“芳烷基”或“芳基烷基”是指具有烷基取代基的芳基。更具体地，烷基芳基是C1-6烷基结合到C5-10芳基或杂芳基环，例如苄基，芳基烷基是C5-10芳基或杂芳基环结合到C1-6烷基。
本文中，术语“卤素”包括氯、溴、碘和氟。
术语“酰基”是指羧酸酯，其中酯基的非羰基基团选自直链、支链或环状的烷基或低级烷基、烷氧基烷基包括但不限于甲氧基甲基、芳烷基包括但不限于苄基、酰氧基烷基例如苯氧基甲基、芳基包括但不限于苯基优选地用卤素(F、Cl、Br、I)、烷基(包括但不限于C1、C2、C3和C4)或烷氧基(包括但不限于C1、C2、C3和C4)取代、磺酸酯例如烷基或芳烷基磺酰基包括但不限于甲磺酰基、单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯、三苯甲基或单甲氧基三苯甲基、取代的苄基、三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。酯类中的芳基优选地包含苯基。术语“低级酰基”是指其中的非羰基基团为低级烷基的酰基。
术语“烷氧基”和“烷氧基烷基”包括具有烷基的直链或支链含氧基团，例如甲氧基。术语“烷氧基烷基”还包括具有连接到烷基的一个或多个烷氧基以形成单烷氧基烷基和二烷氧基烷基的烷基。“烷氧基”还可被一个或多个卤素原子例如氟、氯、溴取代以提供“卤代烷氧基”。所述基团的实例包括氟甲氧基、氯甲氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟乙氧基、氟乙氧基、四氟乙氧基、五氟乙氧基和氟丙氧基。
术语“烷基氨基”是指分别含有连接到氨基的一个或两个烷基的“单烷基氨基”和“二烷基氨基”。术语芳基氨基是指分别含有连接到氨基的一个或两个芳基的“单芳基氨基”和“二芳基氨基”。术语“芳烷基氨基”包含连接到氨基的芳烷基。术语芳烷基氨基是指分别含有连接到氨基的一个或两个芳烷基的“单芳烷基氨基”和“二芳烷基氨基”。术语芳烷基氨基还指示包含一个芳烷基和连接到氨基的一个烷基的“单芳烷基单烷基氨基”。
本文中，术语“杂原子”是指氧、硫、氮和磷。
在一些实施方案中，活性化合物以胺类及其药学上可接受的盐的形式存在。适合的药学上可接受的盐的实例包括无机酸加成盐例如氯化物、溴化物、硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐；有机酸加成盐例如乙酸盐、粘酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、乙醇酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、苯甲酸盐和抗坏血酸盐；含氨基酸的盐例如赖氨酸盐酸盐、天冬氨酸盐和谷氨酸盐。所述盐在某些情况下可以是水合的或乙醇溶剂化的。所述盐可通过使本文所述活性化合物与适合的酸反应来制备。对于经皮肤施用，优选的酸是脂肪酸以形成相对容易穿透皮肤的盐。
本文所述任意实施方案中，活性混合物的剂型通常包括一种或多种药学上可接受的粘合剂、赋形剂、载体、稀释剂、粘结剂、润滑剂、助流剂或崩解剂，取决于活性成分应用的目的。通常，经皮肤制剂由其他成分制成，包括但不限于赋形剂、稀释剂、载体、渗透促进剂及其混合物。
I.化合物
在一些实施方案中，本发明的化合物本身不抑制EPPIN-精液凝固蛋白结合，而是结合到EPPIN中抗-EPPIN抗体结合的部分。代表性抗-EPPIN抗体公开于O’Rand et al.,Biology of Reproduction,80,279–285(2009)中。
其他实施方案中，本发明的化合物可抑制或增强EPPIN-精液凝固蛋白结合，并且可抑制人类及其他灵长类精子的前向运动。EPPIN-精液凝固蛋白复合体位于精子表面上。可用的化合物包括a)可结合到EPPIN上精液凝固蛋白(本文也称为Sg)结合位点的化合物；b)以抑制精液凝固蛋白结合且模拟精液凝固蛋白效应即阻止精子游动的方式结合到变构位点的化合物；和c)增强精液凝固蛋白与EPPIN的结合的化合物。
理想地，模拟抗-EPPIN抗体结合的那些化合物可以比抗体本身更高的亲和力结合，和/或干扰EPPIN精液凝固蛋白结合的那些化合物可以比精液凝固蛋白更高的亲和力结合到活性结合口袋。这可使受试者施用比以较低结合亲和力结合的化合物更低的有效浓度的所述化合物。理想地，以变构方式结合的那些化合物也是高亲和力化合物，以使得也可以施用较低有效浓度的所述化合物。
经高通量测定鉴定为可模拟抗-EPPIN抗体结合的化合物或可抑制EPPIN和精液凝固蛋白结合的化合物以及经鉴定为对精子活力有负面影响的化合物可用于本发明的方法。
在一个实施方案中，本发明的化合物通常具有下式之一：
及其互变异构体、前药和药学上可接受的盐，
其中：
R1是-CH2R5,
R2是H、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、C(X)R6或C(X)XR6，
R3是-NHR7、-C(X)NHR7、-NHC(X)R7、-NHC(X)XR7、-R8或–C(X)R8；
R4是OR7或-C(X)OR7，
R5是H、F、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、-XC(X)XR6、C(X)XR6或C(X)R6,
R6和R7是H、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、芳基、芳基烷基或烷基芳基；
R8是
X是O、S或NR7，优选是O,
Y是O、S、NR7或C(R7)2,
Zj是指数量为j的取代基Z，该取代基可以存在于苯环上的任意碳原子，其中j是0、1或2，每个Z取代基可独立地选自包含C1-8烷基、C1-8取代的烷基、C2-8烯基、C2-8取代的烯基、杂环基、取代的杂环基、C3-8环烷基、C3-8取代的环烷基、芳基(包括杂芳基)、取代的芳基(包括杂芳基)、烷基芳基、取代的烷基芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-OR7、-N(R7)2、-CF3、-CN、-NO2、-C2R7、-SR7、-N3、-C(＝O)N(R7)2、-NR7C(＝O)R7、-C(＝O)R7、-C(＝O)OR7、-OC(＝O)R7、-O(CR6R7)rC(＝O)R7-、-O(CR6R7)rNR7C(＝O)R7、-O(CR6R7)rNR7SO2R7、-OC(＝O)NR6R7、-NR7C(＝O)OR7、-SO2R7、-SO2NR6R7和-NR7SO2R7的组。
r是1到6的整数，且
n是0、1、2或3。
用于烷基、芳基(包括杂芳基)、环烷基等的术语“取代的”是指始于卤素止于-NR7SO2R7的上述取代基；和
其中所述化合物可以单个立体异构体形式或立体异构体混合物的形式存在。
优选的卤代烷基是单-氟烷基，例如氟甲基。
对于优选的结构，上式中所示的两种类型杂芳环各包含三个环氮原子。当进行计算机分析和/或体外分析时，具有0、1或2个环氮原子的化合物不能很好地起作用。因此，上述提供的每一种式包含三个环氮原子。
R5为H时，化合物的活性不如R5为F、-XC(X)XR6或C(X)XR6时的化合物活性。
在一个实施方案中，一种或多种C＝X基团是羰基(C＝O)。该实施方案的一个方面，所有的C＝X基团都是C＝O。
当C(X)XR6是酯(即两个X变量都是O)时，所述酯可在体内容易地被水解形成羧酸，也可能耐受体内水解例如叔丁酯。这同样适用于氨基甲酸酯和碳酸酯。
当C1-8卤代烷基基团存在并且是氟代甲基时，检测到一个氟具有很好的作用，两个氟作用较好但不如仅存在一个氟时，三氟甲基作用不好由于其将化合物推出了结合口袋。也就是说，存在一个氟或者两个氟时是有利的。依据信息和理论，氟原子妨碍了化合物水解的速率。
提供的代表性化合物如下：
TZ4_121(EP007)
EP012 TZ4_121的脱乙基产物
TZ4_125
EP013 TZ4_125的脱乙基产物
TZ4_132
EP025 TZ4_132的脱乙基产物
闭环结构
EP017(来自EP012)
EP021(来自EP012)
EP024(来自EP012)
其中R1包含酯基的那些化合物例如-CH2-C(O)-OCH3，除非所述酯基空间受阻，否则其典型地在体内代谢产生羧酸基团。这些代谢产物是相对长久的，并且被认为是活性形式。
另一个实施方案中，化合物通常具有下式：
及其互变异构体、前药和药学上可接受的盐，
该式中，R1、R3和R4定义如上。
该实施方案的代表性化合物包括以下：
本实施方案中最具活性的化合物是化合物B4(也称作甲基N-{3-[(2-乙氧基-2-氧代乙基)硫烷基]-5-氧代-2,5-二氢-1,2,4-三嗪-6-基}甘氨酸盐)。发现该化合物具有极强的活性(CASA＝11.4μM)。
II.高通量测定
开发了2种不同的高通量测定。一种是基于磁珠的测定，另一种是计算机测定。
AlphaScreen TM 测定
AlphaScreen测定是基于磁珠的技术，其可研究不同类型的生物分子相互作用。当受体珠和供体珠通过相互作用分子聚到一起(200nm)时，激发供体珠产生单重态氧分子(t1/2；4μsec)，其启动受体珠中的化学发光反应发射520–620nm光。AlphaScreen测定是在白色不透明384-孔微孔板(OptiPlate-384；PerkinElmer)中进行的，终体积20μl或30μl，取决于所示的实验。除非另有说明，否则所有稀释均使用测定缓冲液(100mM Tris-HCl,0.1％牛血清白蛋白,质量/体积,0.01％酪蛋白,质量/体积,0.01％吐温-20,体积/体积,pH 8.0)制备。AlphaScreenTM IgG(蛋白A)检测试剂盒(PerkinElmer)中，受体珠与蛋白A共轭，供体珠与链霉亲和素共轭。实验在室温、弱光下进行。
每种重组EPPIN构建体(野生型、截短的和突变体)与抗-EPPIN Q20E抗体和蛋白A受体珠预孵育30min。平行进行地，重组生物素化的(bt)-SEMG1或bt-LTF与链霉亲和素供体珠在相同条件下预孵育。将等体积的每种EPPIN/Q20E/蛋白A受体珠和bt-SEMG1/链霉亲和素供体珠或bt-LTF/链霉亲和素供体珠移入平板的孔中。测定组分的终浓度是58nM EPPIN、1nM bt-SEMG1或4nM bt-LTF、2nM Q20E抗体和10μg/ml珠。
以至少4个重复吸取每组样本。将平板顶部密封覆盖并转移到Synergy 2多平台自动读板装置(Biotek)。摇动2分钟后，在16小时过程中每2小时进行平板读数：使用680/30滤波器激发，使用570/100滤波器发射，使用Gen5软件(Biotek)中改良的AlphaScreenTM方案获取数据。每个实验产生9个时间点。阴性对照在不含EPPIN、bt-SEMG1或bt-LTF且仅存在珠的相同条件下进行。每个时间点的具体信号通过从其相应的总信号减去背景信号(不存在bt-SEMG1或bt-LTF时得到)计算。为检测测定敏感度和稳定性，信号背景(S/B)比和Z0值依据此前描述[Wilson et al.,J.Biomol.Screen,2003；8:522–532.]计算。
浓度-响应及竞争性实验
浓度-响应实验是在20μl测定体积中、使用渐增浓度的wt-EPPIN(1nM–1μM)、存在恒定浓度bt-SEMG1(0.5–4nM)或bt-LTF(4–8nM)条件下按照如上所述进行的。类似地，渐增浓度的bt-SEMG1(0.1pM–1nM)或bt-LTF(3pM–8nM)存在恒定浓度EPPIN(58nM)条件下孵育。珠浓度为10μg/ml。每个数据点的具体计算按如上所述计算并用于通过非线性回归曲线拟合确定EC50值。对于竞争性实验，30μl测定体积中将wt-EPPIN(10or 30nM)和bt-SEMG1(1nM)或bt-LTF(2nM)在渐增浓度的非生物素化SEMG1(10pM–150nM)或LTF(100pM–600nM)存在下孵育。在此情况下，将wt-EPPIN和bt-SEMG1或bt-LTF与其上述相应的珠预孵育，并将溶液按以下顺序移入平板的孔中：5μl竞争蛋白稀释液、10μl wt-EPPIN/Q20E/蛋白A受体珠和15μlbt-SEMG1/链霉亲和素供体珠或bt-LTF/链霉亲和素供体珠。珠浓度为15μg/ml。每种竞争浓度点具体信号的计算如上所述。通过非线性回归曲线拟合计算IC50值，使用归一化数据作为不存在竞争时特异性结合的百分比。与补充方法中所述相同条件下的AlphaScreenTruHits测定用作阳性对照(用于非特异性效应)。
EPPIN同源建模
使用SWISS-MODEL工作站[Arnold et al.,Bioinformatics 2006；22:195–201；Schwede et al.,Nucleic Acids Res 2003；31:3381–3385；and Bordoli et al.,NatProtocols 2008；4:1–13]建立EPPIN C-末端区域(K73-P133)的三维同源模型。模板鉴定后，基于与EPPIN C-末端序列同一度百分比选择(蛋白质数据库鉴定[PDB ID])4种模板：牛胰蛋白酶抑制剂(抑肽酶；1bpiA)、boophilin(2odyE)、textilinin-1(3bybB)和人类VI胶原蛋白α3链(1kthA)。然后使用所述模板作为参照结构产生EPPIN结构模型。使用QMEAN Z-值比较所得三维模型的质量(所产生模型的整体质量)[22]。选择具有最高QMEAN Z值的模型，然后使用Swiss-PDBViewer 4.04(瑞士生物信息研究所)产生EPPIN C-末端模型图并使用POV-Ray3.6(Persistence of Vision Raytracer Pty Ltd)渲染。
在一个实施方案中，将计算机程序用于管理所述测定，通过记录化合物的种类(identity)以及化合物的一种或多种性质例如其对相关位点的结合亲和力、活性等。通过此方式，可筛选一系列高通量多孔平板，并储存可抑制EPPIN-精液凝固蛋白结合的化合物种类供以后使用。所述计算机程序是高通量筛选领域技术人员所公知的。
II.化合物合成
第一个实施方案的化合物可使用以下一般反应制备：
其中，DIPEA是N,N-二异丙基乙胺、ACN是丙烯腈、MeOH是甲醇、H2是氢、Pd是钯。
当杂芳基不是三嗪时，可以使用以下起始材料：
在一些实施方案中，-SR1是-SCH2C(O)OR7，一种可代谢形成碳环酸的酯。这些代谢物是活性化合物，并且可作为活性化合物施用。合成这些化合物时，由于羧酸基团可能干扰用于制备最终化合物的任意反应，可使用适合的保护基团保护羧酸基团并在合成的稍后阶段脱保护。苄酯是适合的保护基团的一个实例，并且这些酯可与氢反应形成游离酸和甲苯。
本发明该实施方案中的化合物都包含至少1个芳环，并且每个芳环可独立地被一种或多种如本文所定义的取代基进一步取代。本领域技术人员应容易地理解，用作制备本发明化合物的起始材料的芳环以及化合物框架中的其他位点纳入其他取代基可容易地实现。这些取代基本身可提供有用的性能，或者可用作进一步合成加工的手柄。
苯环可通过已知的化学作用(包括下述反应)进行取代。例如，烷基取代基可以使用Friedel Craft烷基化反应来添加。联苯化合物可以通过用铜盐处理芳基苯基镁溴化物、通过芳环的氧化脱氢、或甲苯或其他甲基取代芳环的脱烷基化来合成。
芳环可以是硝化的，并且所得苯环上的硝基可与亚硝酸钠反应形成重氮盐。重氮盐可通过已知的化学作用处理形成苯环上的多种取代基。
重氮盐可使用多种已知的方法被卤化，这依据具体卤素而不同。适合试剂的实例包括浓HBr中的溴/水、亚硫酰氯、pyr-ICl、氟和Amberlyst-A。
在重氮化位置带有取代基的多种其他类似物可由相应的氨基化合物通过重氮中间体合成。重氮化合物可使用已知的化学方法制备，例如以上所述方法。
硝基衍生物可通过与亚硝酸盐的反应而还原成胺化合物，典型地存在酸条件下。其他取代基类似物可使用本领域技术人员公知的常规技术由重氮盐中间体产生，包括但不限于羟基、烷氧基、氟、氯、碘、氰基和巯基。
例如，羟基-芳香族类似物可通过重氮盐中间体与水反应制备。芳环上的卤素可以转化为格氏试剂和有机锂试剂，其然后可以与适合的醛或酮反应以形成含醇的侧链。同样地，烷氧基类似物可由重氮化合物与醇反应产生。重氮化合物还可用于合成氰基或卤素化合物，如本领域技术人员公知的。巯基取代基可使用Hoffman et al.,J.Med.Chem.36:953(1993)中所述的技术获得。以此产生的硫醇继而可通过与氢化钠及适合的烷基溴化物反应转变为烷硫基取代基。随后氧化可产生砜。上述化合物的酰氨基类似物可使用有机合成领域技术人员公知的技术通过相应的氨基化合物与适合的酸酐或酰氯反应来制备。
羟基取代的类似物可用于通过与适合的酸、酰氯或酸酐反应制备相应的烷酰氧基取代的化合物。同样地，羟基化合物是在缺电子芳环上通过亲核芳族取代的芳氧基的前体。这种化学反应是有机合成领域技术人员公知的。醚衍生物也可以通过用烷基卤化物与适合的碱进行烷基化或通过Mitsunobu化学反应由羟基化合物制备，其中通常使用三烷基-或三芳基膦和偶氮二甲酸二乙酯。典型Mitsunobu反应条件见Hughes,Org.React.(N.Y.)42:335(1992)和Hughes,Org.Prep.Proced.Int.28:127(1996)。
氰取代的类似物可被水解以提供相应的甲酰胺取代的化合物。进一步水解形成相应的羧酸取代的类似物。使用氢化铝锂还原氰取代的类似物产生相应的氨基甲基类似物。酰基取代的类似物可由相应的羧酸取代的类似物通过与适合的烷基锂反应制备，使用有机合成领域技术人员公知的技术。
羧酸取代的类似物可以通过与适合的醇和酸催化剂反应而转化成相应的酯。具有酯基的化合物可以用硼氢化钠或氢化铝锂还原，以产生相应的羟甲基取代的类似物。这些类似物可通过使用常规技术与氢化钠和适合的烷基卤化物反应而转化为带有醚基团的化合物。可选择地，羟甲基取代的类似物可与甲苯磺酰氯反应以提供相应的甲苯磺酰氧基甲基类似物，其可通过依次用亚硫酰氯和适合的烷基胺处理而转化为相应的烷基氨基酰基类似物。这些酰胺中的某些已知可容易地进行亲核酰基取代以产生酮。
羟基取代的类似物可用于通过与N-烷基-或N-芳基异氰酸酯反应制备N-烷基-或N-芳基氨基甲酰氧基取代的化合物。氨基取代的类似物可用于通过使用有机合成领域技术人员公知的技术分别与烷基氯甲酸酯和N-烷基-或N-芳基异氰酸酯反应制备烷氧基甲酰胺基取代的化合物和脲衍生物。
上述任意取代基可存在于本文所述化合物的任意或所有芳环上。
第二个实施方案中的化合物可使用以下一般反应方案制备。应理解，所述方法步骤可产生多种异构形式，所以步骤之间可能需要进行产物分离。胺和羟基可以使用已知的化学反应例如酰胺化、酯化、醚化等进一步加工。
III.包含所述化合物的药物组合物
存在药学上可接受载体或稀释剂的条件下，使用本文所详述的任意施用方式对患者施用有效量的上述化合物，可实现临时且可逆的雄性避孕。当然，所述处理对于任一精液来说未必是可逆的，但是一旦停止服用/使用所述化合物，对精子活力的影响即终止并且不育将逆转。
所述活性物质可以液体或固体形式通过任意适合的路径施用，例如经口腔、肠胃外、肠内、静脉内、皮内、皮下、经皮肤、鼻内或局部施用。理想地，将所述化合物经口腔或皮肤递送以确保最大的患者依从度。
所述活性化合物可包含在药学上可接受的载体或稀释剂中，其量足以向患者递送治疗有效量的化合物以抑制所治疗患者的精子活力而不引起严重的毒性作用。“抑制量”意指足以产生对精子活力抑制效应的活性成分量，如通过例如本文所述的测定所测量的。
对于所有上述条件，优选的化合物剂量范围从约1到75mg/kg体重每天，优选地1到20mg/kg体重每天，更普遍地每天给予受试者约0.1mg到约100mg每千克体重。所述化合物的有效剂量范围可通过本领域技术人员公知的方式计算。
所述化合物可方便地以任意适合的剂型单位施用，包括但不限于每单位剂型包含7mg到3000mg，优选地70mg到1400mg活性成分。口服剂量50mg到1000mg通常是方便的。
药物组合物中活性化合物的浓度依赖于药物的吸收、分布、代谢和排泄速率以及本领域技术人员公知的其他因素。还应理解，对于任意具体受试者，具体剂量方案应依据个体需要和施用或指导所述组合物施用的人员的专业判断随时间调整，并且本文所列举的浓度范围仅为示例性的而不意图限定要求保护的组合物的范围或实践。所述活性成分可一次施用或者可分为多个较小的剂量在不同时段施用。
优选地施用所述活性化合物的方式是口服。口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。其可包含在胶囊中或者压缩成片剂。为口服治疗施用，可将所述活性化合物与赋形剂混合，并以片剂、锭剂或胶囊形式使用。可包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的部分。
片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含任意下述成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖、崩解剂如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。当剂量单位形式为胶囊时，除上述类型的物质外还可包含液态载体例如脂肪油。此外，剂量单位形式可包含多种其他物质，其改变剂量单位的物理形式，例如糖、虫胶或其它肠溶剂的包衣。
所述化合物可作为酏剂、悬液、糖浆剂、晶片、口香糖等的组分施用。除所述活性化合物外，糖浆剂还可包含蔗糖作为甜味剂以及某些防腐剂、染料及着色剂和调味剂。
用于经肠胃外、皮内、皮下或局部施用的溶液或悬液可包含以下组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。
控释制剂
本部分引用的关于控释制剂的所有美国专利均以引用方式全文纳入本文。
自从Kulkarni et al.,in 1966("Polylactic acid for surgical implants,"Arch.Surg.,93:839)报道了聚乳酸的合成和生物降解性以来，生物可降解聚合物领域发展迅速。已报道可用作递送装置的基质材料的其他聚合物实例包括聚酐、聚酯如聚乙交酯和聚丙交酯-共-乙交酯、聚氨基酸如聚赖氨酸、聚环氧乙烷的聚合物和共聚物、丙烯酸封端的聚环氧乙烷、聚酰胺、聚氨酯、聚原酸酯、聚丙烯腈和聚磷腈。见例如Langer的美国专利No.4,891,225和No.4,906,474(聚酐)、Hutchinson的美国专利No.4,767,628(聚丙交酯，聚丙交酯-共-乙交酯酸)和Tice等的美国专利No.4,530,840(聚丙交酯、聚乙交酯和共聚物)。还可见于Hubbell等的美国专利No.5,626,863，其描述了作为组织接触材料和可控释放载体的可光聚合生物可降解水凝胶(聚合和交联的大分子单体的水凝胶，其包含具有生物可降解单体或低聚物延伸的亲水性低聚物，其是能够聚合和交联的封端单体或低聚物)；和Focal，Inc.提交的PCT WO 97/05185，其涉及用作药物递送和组织治疗剂的控制释放剂的多嵌段生物可降解水凝胶。
生物来源的可降解材料是公知的，例如交联明胶。透明质酸可交联并作为可降解溶胀聚合物用于生物医学用途(授予Della Valle等的美国专利No.4,957,744(1991)"Surface modification of polymeric biomaterials for reduced thrombogenicity,"Polym.Mater.Sci.Eng.,62:731 735])。
许多分散系统目前用作或正在被开发用作物质特别是生物活性化合物的载体。用于药物和化妆品制剂的分散体系统可以分为悬液或乳剂。悬液定义为尺寸范围从数纳米到数百微米的固体颗粒，使用悬浮剂分散在液态介质中。固体颗粒包括微球体、微胶囊和纳米球。乳剂定义为一种液体在另一种液体中的分散体，其通过乳化剂例如表面活性剂和脂质的界面膜稳定。乳剂制剂包括油包水和水包油乳剂、多重乳剂、微乳剂、微滴和脂质体。微滴是单层磷脂囊泡，其由具有内部油相的球形脂质层组成，如授予Haynes的美国专利No.4,622,219和No.4,725,442。脂质体是通过将水不溶性极性脂质与水溶液混合而制备的磷脂囊泡。将不溶性脂质混入水中形成的不利熵可产生高度有序组装的具有包埋的水溶液的同心封闭磷脂膜。
Dunn,et al.,等的美国专利No.4,938,763公开了通过将非反应性的水不溶性热塑性聚合物溶解在生物相容性的水溶性溶剂中以形成液体，将液体置于体内，并使溶剂消散以产生固体植入物而原位形成植入物的方法。聚合物溶液可以通过注射器置于体内。植入物可以呈现其周围空腔的形状。另一个实施方案中，植入物由反应性、液体低聚物聚合物形成，其不含溶剂并且在适当位置固化以形成固体，通常添加固化催化剂。
Elan Corporation，PLC的美国专利No.5,641,745公开了可控释放的药物制剂，其包含在生物可降解聚合物中的活性药物以形成微球或纳米球。生物可降解的聚合物适当地是聚-D,L-丙交酯或聚-D,L-丙交酯和聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯的混合物。ElanCorporation，PLC的美国专利No.5,616,345描述了每天一次施用的可控吸收制剂，其包括与有机酸结合的活性化合物和围绕该核心并含有主要比例的药学上可接受的成膜的水不溶性合成聚合物和次要比例的药学上可接受的成膜的水溶性合成聚合物的多层膜。美国专利No.5,641,515公开了基于生物可降解纳米颗粒的可控释放制剂。美国专利No.5,637,320公开了每天一次施用的可控吸收制剂。美国专利No.5,505,962描述了可控释放的药物制剂。
经皮肤递送
用于经皮肤施用的组合物包括活性化合物或其药学上可接受的盐包括脂肪酸盐，并且可任选地还可以包括其他成分包括但不限于载体和赋形剂例如经皮肤施用后可促进活性成分经皮肤吸收的渗透促进剂。
相对于口服剂型例如片剂或胶囊，经皮肤递送可以提供更快速或更持续的吸收，控制释放并因此控制治疗作用的开始，并避免肝首过代谢。对于吞咽片剂、胶囊或其他固体有困难的患者或具有肠衰竭的患者，可以优选经皮肤递送途径。由于其易于使用，对于否则可能忘记每日服用一次丸剂的患者，这种施用途径也是优选的。
药物的吸收量取决于许多因素。这些因素包括药物浓度、药物递送载体、皮肤接触时间、皮肤给药面积、在吸收位点pH下药物离子化和非离子化形式的比例、药物分子的分子大小、药物的相对脂溶性以及药物对皮肤与制剂的相对亲和力(如果药物不容易从其制剂基质释放，则将实现非常少的药物吸收)。本领域技术人员可容易地制备适合的经皮肤组合物，其可考虑这些因素递送适量的活性剂。
经皮肤递送装置
用于递送本发明化合物的经皮肤递送装置可以是本领域公知的任意类型，包括通常用于通过经皮肤途径施用药物的单片、基质、膜和其它类型。除其他之外，所述装置还公开于美国专利No.3,996,934、No.3,797,494、No.3,742,951、No.3,598,122、No.3,598,123、No.3,731,683、No.3,734,097、No.4,336,243、No.4,379,454、No.4,460,372、No.4,486,193、No.4,666,441、No.4,615,699、No.4,681,584和No.4,558,580、No.5,533,995中，其公开内容以引用方式纳入本文。
所述装置倾向于是柔性的，可良好地粘附到皮肤，并且具有对于待递送药物不可渗透的聚合物背衬(覆盖物)，使得药物通过皮肤施用。所述药物或其药学上可接受的盐通常存在于溶液或分散相中，其可以是凝胶的形式，并且有助于药物通过表皮的角质层递送并到达真皮供吸收。
膜装置
膜装置通常具有4层：(1)不可渗透的背衬；(2)储层；(3)膜层(其可以是致密聚合物膜或微孔膜)，和(4)接触粘合剂层，其以连续或不连续的涂层覆盖整个装置表面或围绕膜层。可以用作不可渗透层的材料的实例是高、中和低密度聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和层压或涂覆有铝箔的聚合物。其他的公开于本文提及的标准经皮肤递送装置专利中。在其中储层是流体或是聚合物的某些实施方案中，背衬层的外边缘可以覆盖储层的边缘并且通过与扩散膜层的粘合或熔合而被密封。在这种情况下，储层不需要具有暴露的表面。
储层在不可渗透的背衬下面并且含有载体液体通常为水和/或醇或其多元醇或酯，并且可包含或不含活性化合物。药物在储库中的量取决于从所述装置通过皮肤吸收的期望速率和预期的治疗持续时间。除了载体液体和活性化合物之外，储层还可包含稀释剂、稳定剂、载体、胶凝剂等。
层压装置的扩散膜层可以由致密或微孔的聚合物膜制成，其对药物和载体液体具有必需的渗透度。优选地，所述膜对于除药物和载体液体以外的成分是不可渗透的，但是当需要在皮肤表面缓冲时所述膜也应当对制剂中的缓冲液是可渗透的。可用于制备膜层的聚合物膜的实例公开于美国专利No.3,797,454和No.4,031,894中。优选的材料是聚氨酯、乙烯/乙烯醇共聚物或乙烯/乙酸乙烯酯。
单片基质(Monolithic Matrices)
第二类经皮肤系统是由单片基质代表的。所述单片装置的实例是美国专利No.4,291,014、美国专利No.4,297,995、美国专利No.4,390,520和美国专利No.4,340,043。其他的是本领域技术人员公知的。
经皮肤递送装置的单片和基质类型屏障通常包括：
(1)多孔聚合物或开孔泡沫聚合物，例如聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯、聚丙烯等。
(2)高度溶胀或增塑的聚合物如纤维素、HEMA或MEMA或其共聚物、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基甲基纤维素(HEMC)等、聚乙烯醇(PVA)/聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其它水凝胶或PVC、聚氨酯、乙烯/乙酸乙烯酯或其共聚物。
(3)液体凝胶，通常包括水和/或含羟基溶剂如乙醇，并且通常含有胶凝剂如PVP、羧甲基纤维素(CMC)、Klucel、HPMC、藻酸盐、高岭石、膨润土或蒙脱石、其他粘土填料、硬脂酸盐、二氧化硅颗粒等。
(4)无纺材料，由织物、纤维素、聚氨酯、聚酯或其他纤维制成。
(5)海绵，其可以由天然或泡沫聚合物形成。
(6)粘合剂，理想地，皮肤病学可接受的压敏粘合剂例如有机硅粘合剂或丙烯酸粘合剂。
下文更详细地描述了经皮肤递送制剂的各种组分。
聚合屏障材料
代表性的聚合物屏障材料包括但不限于：
聚碳酸酯，例如通过二羟基芳族化合物例如双酚A的光气化形成的那些，包括以商品名(通用电气公司)出售的材料；
聚氯乙烯，例如121(B.G.Goodrich化学公司)；
聚酰胺类(“尼龙”)，例如聚己二酰己二胺，包括(E.I.DuPont deNemours&Co.)。
改性丙烯酸共聚物，例如由聚氯乙烯(60％)和丙烯腈(40％)形成的苯乙烯-丙烯酸共聚物等。
聚砜，例如含有二亚苯基砜基团的那些，例如P-1700(Union Carbide Corporation)。
卤化聚合物，例如聚偏二氟乙烯例如(Pennsalt Chemical Corporation)、聚氟乙烯例如(E.I.DuPont de Nemours&Co.)和聚氟卤代烃例如(联合化学公司)。
聚氯醚，例如(Hercules Incorporated)及其它热塑性聚醚。
缩醛聚合物，例如聚甲醛例如(E.I.DuPont de Nemours&Co.)。
丙烯酸树脂，例如聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸正丁酯等。
也可以使用其它聚合物如聚氨酯、聚酰亚胺、聚苯并咪唑、聚乙酸乙烯酯、芳族和脂肪族、聚醚、纤维素酯例如三乙酸纤维素、纤维素、colledion(含11％氮的硝酸纤维素)、环氧树脂、烯烃例如聚乙烯、聚丙烯、聚偏二氯乙烯、多孔橡胶、交联的聚(环氧乙烷)、交联的聚乙烯吡咯烷酮、交联的聚(乙烯醇)、由两种离子缔合的聚合物形成的聚电解质结构，其类型如美国专利No.3,549,016和No.3,546,141所述，聚苯乙烯衍生物如聚(苯乙烯磺酸钠)和聚(乙烯基苄基三甲基氯化铵)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(异丁基乙烯基醚)等。还可以使用来自上述聚合物列表的可通过多种比例单体反应形成的大量共聚物。
如果膜或其它屏障不具有足够高的通量，则可以减小膜或屏障的厚度。但是，所述厚度不应该降低到其可能撕裂的点，或者降低到可施用的药物量太低的点。
粘合剂
经皮肤药物递送制剂通常包括将装置粘着到皮肤的接触粘合剂层。在一些实施方案中，活性剂可以存在于粘合剂中。
示例性粘合剂包括聚氨酯；丙烯酸或甲基丙烯酸树脂例如丙烯酸或甲基丙烯酸与醇例如正丁醇、正戊醇、异戊醇、2-甲基丁醇、1-甲基丁醇、1-甲基戊醇、2-甲基戊醇、3-甲基戊醇、2-乙基丁醇、异辛醇、正癸醇或正十二烷醇的酯的聚合物，单独或与烯键式不饱和单体如丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-烷氧基甲基丙烯酰胺、N-烷氧基甲基甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、衣康酸、乙酸乙烯酯、N-支链烷基马来酰胺酸(其中所述烷基具有10到24个碳原子)、乙二醇二丙烯酸酯或其混合物共聚合；天然或合成橡胶例如苯乙烯丁二烯、丁基醚、氯丁橡胶、聚异丁烯、聚丁二烯和聚异戊二烯、聚乙酸乙烯酯、脲醛(unreaformaldehyde)树脂、酚醛树脂、间苯二酚甲醛树脂、纤维素衍生物如乙基纤维素、甲基纤维素、硝化纤维素、乙酸丁酸纤维素和羧甲基纤维素和天然树胶如瓜尔胶、阿拉伯胶、果胶、淀粉、糊精、白蛋白、明胶、酪蛋白等。粘合剂可以与增粘剂和稳定剂复合，如本领域公知的。
代表性有机硅粘合剂包括基于硅烷、卤代硅烷或C1-18烷氧基硅烷单体的有机硅弹性体，特别是聚二甲基硅氧烷，其可以单独使用或与有机硅增粘剂或有机硅增塑剂进行制剂，并且其选自医学上可接受的有机硅流体，即基于硅烷、卤代硅烷或C1-18烷氧基硅烷的非弹性体有机硅。典型的有机硅粘合剂可从Dow Corning获得，商品名为
液态载体
经皮肤制剂可包括多种组分，包括液态载体典型地C2-4烷醇例如乙醇、异丙醇、正丙醇、丁醇、多元醇或二醇如丙二醇、丁二醇、己二醇、乙二醇和/或纯水。载体通常存在的量在约5％和约75％w/w之间，更典型地在约15.0％和约65.0％w/w之间，并且优选在约20.0％和55.0％w/w之间。水可增加亲水性活性剂在制剂中的溶解度，并可加速亲脂性活性剂从制剂释放。醇例如乙醇可增加角质层脂质流动性或从角质层提取脂质的功能。如本文所讨论的，二醇类也可以充当渗透促进剂。
渗透促进剂
成功的经皮肤递送取决于药物穿过皮肤的足够的通量和足够的皮肤表面积，以产生有效的血浆药物浓度。出于消费者接受的原因，经皮肤系统的实际表面积被限制在约5cm2至100cm2。由于表面积的这种限制，许多药物的治疗性经皮肤递送需要增加固有的皮肤渗透度以获得需要的通量。因此，开发了增强待施用药物经皮吸收的化合物。
渗透促进剂的描述可见于例如美国专利No.5,785,991、No.4,764,381、No.4,956,171、No.4,863,970、No.5,453,279、No.4,883,660、No.5,719,197以及文献"Pharmaceutical Skin Penetration Enhancement",J.Hadgraft,Marcel Dekker,Inc.1993；"Percutaneous Absorption",R.Bronaugh,H.Maibach,Marcel Dekker,Inc.(1989)，B.W.Barry,"Penetration Enhancers in Skin Permeation",Proceedings ofthe 13th international Symposium on Controlled Release of BioactiveMaterials,ed.by Chaudry&Thies,Controlled Release Society,Lincolnshire,Ill.,pp.136-137(1986),and Cooper&Berner,"Penetration Enhancers",in The TransdermalDelivery of Drugs,Vol.II ed.by Kydonieus and Berner,CRC Press,Boca Raton,Fla.pp.57-62(1986),其每个的内容以引用方式纳入本文。
渗透促进剂应该既可增强皮肤的渗透度，又在重复暴露时是无毒的、非刺激性的和非致敏的。代表性渗透促进剂包括例如蔗糖单椰油酸酯、单油酸甘油酯、蔗糖单月桂酸酯、单月桂酸甘油酯、二甘醇单烷基醚如二甘醇单乙基或单甲基醚( P)、酯组分如丙二醇单月桂酸酯、月桂酸甲酯和乙酸月桂酯、单甘油酯如单月桂酸甘油酯、脂肪醇如月桂醇和2-乙基-1,3-己二醇，单独或与油酸组合。
在一个实施方案中，提供了具有皮肤渗透促进益处的经皮肤组合物，通过将活性化合物与饱和脂肪醇组合或形成所述化合物与一种或多种脂肪酸例如分别为式CH3-(CH2)n-CH2OH或CH3-(CH2)n-CH2COOH，其中n是8到22的整数，优选8到12，最优选10；或者与分别为式CH3-(CnH2(n-x))-OH或CH3-(CnH2(n-x))-COOH的不饱和脂肪醇或脂肪酸(其中n是8到22的整数并且x是双键的数量)形成的盐；并且优选载体(vehicle)或载体(carrier)组合物中还有第二组分，其是二甘醇的单烷基醚优选二甘醇单乙基醚或二甘醇单甲基醚，整合有C1-4醇优选乙醇，多元醇优选丙二醇以及纯水。
可使用二元体系，包括油酸或油醇和低级醇的组合或聚羧酸的低级烷基酯、脂肪族单羟基醇和脂肪族二醇的组合。
代表性渗透增强剂包括脂肪醇和脂肪酸，以及二甘醇的单烷基醚例如二甘醇单乙基醚或二甘醇单甲基醚。脂肪醇通常以约0.1％至约20.0％w/w，优选约0.2％至约10.0％w/w，更优选约0.4％至约3.0％w/w的量存在。二甘醇单烷基醚通常以至多40.0％w/w，优选约0.2％至25.0％w/w，更优选约2.0％至约8.0％w/w的量存在。
尽管不希望受特定理论的束缚，但据信某些渗透增强剂起作用以增强活性剂通过角质层的渗透性的机制如下：
脂肪醇因为其亲脂性主要分布于角质层，并与角质层脂质相互作用。
二甘醇单烷基醚可将亲水性和亲脂性活性剂溶解其中，并且促进活性剂渗透到皮肤。
二醇例如丙二醇充当活性剂的助溶剂，因此可增加他们在制剂中的溶解度。此外，其倾向于溶剂化角质层的细胞内角蛋白，从而增强药物的流动性和皮肤含水量。
胶凝剂
胶凝剂例如卡波姆、羧乙烯或聚丙烯酸例如980或940NF、981或941NF、1382或1342NF、5984或934NF、ETD 2020、2050、934P NF、971P NF、974P NF、 AA-1USP等；纤维素衍生物如乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、乙基羟乙基纤维素(EHEC)、羧甲基纤维素(CMC)、羟丙基纤维素(HPC)(不同级别)、羟乙基纤维素(HEC)(级)、HPMCP 55，级等；天然树胶如阿拉伯胶、黄原胶、瓜尔胶、藻酸盐等；聚乙烯吡咯烷酮衍生物例如级；聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物例如 F级68,127等；其他例如壳聚糖、聚乙烯醇、果胶、veegun级等也可使用。本领域技术人员知晓可适用于本发明的其他胶凝剂或粘度剂(viscosant)。
代表性胶凝剂包括但不限于980NF、 F 127、 F 68和 AA-1USP。胶凝剂可存在约0.2％到约30.0％w/w，取决于聚合物的类型。
防腐剂
经皮肤组合物还可包括一种或多种防腐剂和/或抗氧化剂。代表性防腐剂包括季铵盐例如劳拉氯铵、苯扎氯铵、苯度氯铵、十六烷基氯化吡啶、溴化十六烷基三甲铵、度米芬；醇类例如苄醇、氯丁醇、邻甲酚、苯乙醇；有机酸或其盐例如苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸酯；或者络合物形成剂如EDTA。代表性抗氧化剂包括丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、乙二胺四乙酸及其钠盐、D,L-α-生育酚。
其他组分
其它组分可包括稀释剂例如纤维素、微晶纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、羟丙基甲基纤维素等。可以加入赋形剂以调节组合物的张力，例如氯化钠、葡萄糖，右旋糖、甘露醇、山梨醇、乳糖等。也可加入酸性或碱性缓冲液以控制pH。也可加入共溶剂或增溶剂如甘油、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇660羟基硬脂酸酯(来自BASF的Solutol HS15)、丁二醇、己二醇等。
控制释放活性剂
可使用控释制剂来控制活性剂的施用，其可依据所述制剂提供快速或持续的释放，或其二者。
存在多种本领域技术人员公知的颗粒状药物递送载体，其可以包括活性成分并以可控制的方式递送他们。实例包括颗粒状聚合药物递送载体例如生物可降解聚合物和非聚合组分形成的颗粒。所述颗粒状药物递送载体可以是粉末、微粒、纳米颗粒、微胶囊、脂质体等形式。典型地，如果活性剂是未加入组分的颗粒形式，则其释放速率依赖于活性剂自身的释放。相反地，如果活性剂是作为活性剂和聚合物共混物的颗粒形式，则活性剂的释放至少部分地通过除去聚合物(通常通过溶解或生物降解)来控制。
在一些实施方案中，所述组合物可提供起始快速释放活性成分，然后持续释放活性成分。美国专利No.5,629,011提供了该类型制剂的实例，其以引用方式全文纳入本文。有多种使用经皮肤递送以时间-释放方式递送尼古丁的经皮肤组合物(例如速率控制膜)，包括目前市售的用于女性避孕和尼古丁替代的治疗剂。其还适于施用本发明的组合物。
IV.提供可逆和临时雄性避孕的方法
用于口服或皮肤施用的化合物和组合物可用于提供可逆且临时的雄性避孕。因为所述化合物通过模拟抗-EPPIN抗体与EPPIN的结合或者抑制或增强EPPIN与精液凝固蛋白的结合起作用，一旦终止化合物施用，这种结合的抑制将终止，从而恢复生育力。
一方面，所述化合物经口服施用，优选以每日一次形式，以提供雄性避孕。另一方面，所述化合物经皮肤施用，理想地以较低频率，例如每周一次或者每月一次，以提供雄性避孕。
本领域技术人员可有效地遵循这些治疗的施用而不需要过度试验。在确定用于个体患者适合的剂量以前，可能需要患者服用所述剂量一段特定的时间，例如一周或者一月，并定期测定精子活力以确保用于具体患者的剂量是适合的剂量。对于雄性避孕，所述组合物可以数种不同的剂量水平提供，以提供每个患者最佳的剂量。理想的剂量是，能可靠地提供避孕但不显著超越实现所述避孕需要的剂量。
V.杀精子组合物
对于某些个体，预防疾病传播与预防怀孕同样重要。因此，需要与避孕套结合使用本发明的化合物来抑制精子前向运动(从而抑制受精)。
对于某些其他个体，希望预防怀孕、希望避免口服避孕药(个体或其配偶)以及希望避免使用避孕套。对于这类个体，需要与隔膜、女用避孕套或杀精润滑剂或胶冻剂结合使用本发明的化合物以抑制精子前向运动(从而抑制受精)。
这些实施方案中，所述组合物可包含其他试剂例如可局部抑制病毒、真菌和/或细菌感染的试剂。
润滑剂组合物
在一个实施方案中，本发明的化合物存在于用于性关系期间的预防性润滑剂组合物中。所述润滑剂组合物可以不与避孕套、女性避孕套或隔膜一起使用，但是当与这样的装置一起使用时，可以在常规装置有缺陷的情况下提供额外的安全限度(safety margin)。
润滑剂组合物通常包括有效的润滑剂、有效浓度的活性化合物以及可任选的抗微生物化合物，其可有效破坏人类免疫缺陷病毒(HIV，例如HIV-1和HIV-2)、疱疹病毒、人类乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎或丙型肝炎(HBV和HCV)病毒和其他病毒和/或细菌例如梅毒、淋病或衣原体，或真菌例如可引起酵母感染的真菌。所述抗微生物化合物也可以是以与本发明化合物不同的方式起作用的杀精子剂(即不抑制EPPIN-精液凝固蛋白结合或不抑制精子前向运动)。例如，某些化合物与阴道粘膜反应以形成对精子细胞渗入子宫的屏障，而没有实质性的有害副作用。
预防性润滑剂组合物还可以包括杀真菌剂，例如对羟基苯甲酸甲酯。
一种代表性的抗微生物化合物是氯己定及其盐，特别是葡萄糖酸盐或者双葡糖酸盐。氯己定扩散到宫颈粘液中，产生限制排卵期间精子细胞穿透的悬浮液，并且导致其迅速失去活力。这在氯己定浓度超过0.1％时发生。因此，通过使用氯己定作为依据本发明的活性抗微生物化合物，氯己定在射精之前扩散到宫颈粘液中并且实际上产生阴道的“密封袋”，其将保留所有的身体分泌物包括精液。存在的任何病毒也可以被氯己定破坏，高于0.1％浓度的氯己定可有效地破坏病毒的包膜，从而防止病毒穿透人体细胞。
因此，包含本发明化合物和抗微生物化合物的润滑剂可应用于性器官以减少阴茎和阴道壁之间的摩擦，杀死体液中的任何细菌和病毒，并抑制精子活力(并可能破坏精子)。
理想地，润滑剂组合物的pH接近阴道组织的pH，因为如果润滑剂的pH显着超出该正常范围，则这些组织可能被抑制再生。
润滑剂可以是化妆品应用可接受的任何有效的润滑剂或润滑剂的组合。润滑剂组合物可以包括醇或醇的混合物，并且优选是水溶性的，因此它们可以与避孕套、女性避孕套和隔膜一起使用，并且还使可能在衣服或床单上形成的任何污渍最小化。可以使用任何水溶性润滑剂，优选的润滑剂包括甘油和丙二醇。代表性的水溶性润滑剂包括KY-胶冻剂和其它水基润滑剂组合物中的那些。
通过以下非限制性实施例可更好地理解本发明。
实施例1:制备本发明化合物的合成方法
本文所述化合物TZ4_121、TZ4_125和TZ4_132的结构如下所示：
讨论
合成的所有化合物经历通用中间体3。从氰尿酰氯1开始，巯基乙酸乙酯取代一个氯，得到化合物2。然后用肼基甲酸甲酯处理化合物2，得到化合物3。
TZ4_121的合成开始于使用氯甲酸甲酯和碳酸钙形成氨基甲酸甲酯。然后将硝基官能团还原，得到化合物6，其不经进一步纯化即使用。两当量的化合物6与化合物3反应，得到TZ4_121。
TZ4_125的合成始于羧酸7。甲酯在含有催化性硫酸的甲醇中形成。然后将氨基甲酸甲酯引入步骤-2，一锅法，但用光气处理苯胺，然后用甲醇和分子筛处理，得到化合物9。还原硝基官能团，得到化合物10，其无需进一步纯化即可使用。使化合物10与化合物3在Hunig's碱(DIPEA)存在下反应，得到TZ4_125。
TZ4_132从羧酸7开始，其用在MeOH中的催化性硫酸处理以形成甲酯8。将硝基官能团还原，得到化合物11，其不经进一步纯化即使用。使化合物11与化合物3在Hunig’s碱的存在下反应，得到TZ4_132。
结论:
合成了多种TZ4系列的类似物并测试其活性。氰尿酰氯的容易获得性允许通过改变分子的单个“臂”来合成多种类似物。例如，硫醇可以随任意数量的硫醇而变化，氨基甲酸酯也可以改变为各种其它胺类，并且第三臂也可以变化以产生大量的类似物。
实验:
分析方法细节
分析性HPLC按如下进行：
化合物2(338BPAL58):
将氰尿酰氯(5.4g，29.2mmol)和二异丙基乙胺(8ml，46.8mmol)在四氢呋喃(THF)(50ml)中合并，冷却至0℃。在30分钟内滴加巯基乙酸乙酯(3.5g，29.2mmol)的THF溶液(10ml+2×1ml冲洗液)。将溶液温热至室温，一旦达到室温即反应完成。除去溶剂。通过硅胶色谱(10％EtOAc/庚烷)纯化，得到4.13g纯化合物2。53％产率。
化合物3(333PAL05):
使化合物2(2.4g，9mmol)与二异丙基乙胺(1.9ml)在DCM(50mL)中合并。将反应混合物在冰水浴中冷却，滴加肼基甲酸甲酯(0.822g，9.1mmol)的DCM(20ml)溶液。使反应烧瓶温热至室温，其中通过LC/MS确定反应完成。将混合物倒入水中，有机层用水(3×)洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。通过硅胶色谱法(20-50％EtOAc的庚烷溶液)纯化，得到2.2g纯物质。77％产率。
化合物5(336PAL36):
向化合物4(1.5g，9.7mmol)在二恶烷(30ml)中的溶液中加入碳酸钙(0.49g，4.9mmol)，然后加入氯甲酸甲酯(1.38g，14.6mmol)。将混合物加热至80℃过夜。通过LC-MS指示反应完成。过滤固体，真空蒸发溶剂。通过柱色谱法(3-10％MeOH/DCM)纯化残余物，得到1.3g纯物质。63％产率。
化合物6(336PAL38):
向化合物5(06.g，2.8mmol)在MeOH(25ml)中的溶液中加入Pd/C(10％，0.1g)，并用氢气(50psi)处理1小时。通过LC-MS指示反应完成。过滤固体，并浓缩得到0.6g产物。材料用于下一步而不需要纯化。
TZ4_121(336PAL39):
向化合物3(0.1g，0.3mmol)在乙腈(10ml)中的溶液中加入化合物5(0.113g，0.6mmol)。将混合物室温搅拌过夜。LC-MS显示形成约83％的产物。将溶剂蒸发。将粗产物加载到ISCO柱上，通过色谱法(4-50％丙酮在二氯甲烷(DCM)中)纯化，得到125mg产物。86％产率。
化合物8(316PAL51):
将5-硝基邻氨基苯甲酸(1g，5.5mmol)悬浮于MeOH(20mL)中，加入0.5ml浓H2SO4。开始加热，当温度达到回流时，固体开始溶解。将混合物在回流下加热24小时，然后使其冷却至室温经过整个周末。加入甲苯(20ml)，并将大部分甲醇(MeOH)煮沸掉。将溶液加热至95℃3小时，并浓缩。将材料溶于乙酸乙酯(EtOAc)，用饱和NaHCO3(3×50mL)洗涤，然后用盐水洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩成黄色固体。1g。93％产率。
化合物9(338BPAL62):
在氮气下，向苯胺8(0.2g，1.02mmol)和K2CO3(0.42g，3.06mmol)的甲苯(10mL)溶液中逐滴加入光气(15％的甲苯溶液，1.5mL)。立即产生黄色沉淀。搅拌1小时，直到反应停止进行(通过TLC消耗约50％起始材料)。加入干MeOH并使其剧烈搅拌～15小时。用EtOAc(100ml)和H2O(100ml)稀释。将有机层用H2O(3×)洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。通过柱色谱法(15％EtOAc的庚烷溶液)纯化该物质，得到100mg产物。41％产率。
化合物10(338BPAL63):
将硝基化合物9(100mg，0.42mmol)与Pd/C(10％，25mg)一起悬浮于乙醇(EtOH)(15ml)中。将反应混合物氢化1.5小时，通过TLC确定反应完成。通过硅藻土过滤催化剂并浓缩滤液。90mg。100％产率。
TZ4_125(338BPAL64):
向0℃下、化合物3(115mg，0.36mmol)和二异丙基乙基胺(DIPEA)(73μl，0.43mmol)的乙腈(20ml)溶液中历时30分钟逐滴加入苯胺10(82.5mg，0.36mmol)的乙腈(8ml+4ml冲洗液)溶液。除去冰水浴，将反应混合物温热至室温。将物质通过硅胶色谱法纯化，但仍不纯。将柱中的物质悬浮于Et2O(75ml)中并超声处理。滤出固体，将滤液蒸发至泡沫状。将泡沫状物溶于Et2O(5ml)中，加入戊烷(50ml)。将烧瓶置于冷冻器中过夜。将固体过滤，用戊烷洗涤并干燥，得到所需化合物。19mg。11％产率。
化合物11(316PAL53):
在Parr瓶中将化合物8(1g，5.1mmol)溶解于THF(50ml)中，并脱气。加入Pd/C(10％，150mg)，吹扫烧瓶并充入氢气。在40psi氢化24小时。LC-MS显示起始物质被消耗。通过硅藻土过滤掉催化剂，并用MeOH洗涤。将滤液浓缩成棕色油状物。～1g。>95％产率。
TZ4_132(316PAL54):
向化合物3(250mg，0.78mmol)的ACN(5ml)溶液中加入化合物11(129mg，0.78mmol)，搅拌内容物直至溶解。加入DIPEA(110mg，0.86mmol)的ACN(2ml)溶液，将反应物在室温下搅拌过夜。将反应浓缩至棕色油状物，然后在EtOAc和水之间分配。分离有机层。将水层用EtOAc反萃取，并将合并的有机萃取物用0.1N HCl和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。用乙醚(Et2O)研磨后，HPLC纯度仅为93％。用ISCO泵(0-5％MeOH的DCM溶液)纯化，得到白色固体。150mg。43％产率。
实施例2：化合物TZ4121的多种性质分析
使用上述合成方法制备化合物TZ4_121，其具有以下结构：
该化合物的某些物理特性在下表中提供，其它性质在图1中提供。
LogP 2.9
LogD(7.4) 2.88
分子量 467.456
极性表面积 211.22
范德华SA 615.77
受体，供体 11，5
pl 5.54
使用15个主要物理化学描述符的主成分分析(PCA)评价化合物，并与eDrugs和DrugBank的两个亚文库进行比较，这些文库定义了口服生物可利用的化合物。该评价显示该化合物落在与其它已知的口服活性药物相同的空间(特征)内。
进行ADME(吸收、分布、代谢和排泄)研究。确定该化合物具有以下性质：
1.良好的溶解度100μM；
2.Caco-2细胞渗透性差；0.2×10-6cm/sec；
3.回收率高(93％)；无非特异性结合；
4.人肝微粒体代谢T1/2＝41分钟；
5.体外毒理学；IC50～2×10-5M
可以使用相同的方案测试另外的化合物：
ADME-Tox:溶液性质
水溶解度(比浊测量法)
在具体的测试浓度下由DMSO储备溶液制备测试化合物的溶液。将溶液充分混合并等分到384孔板中，在37℃孵育1小时，并使用基于激光的微板浊度计在635nm下测量每种溶液中的光散射程度。计算每个浓度下的平均浊度计读数，并与空白溶液和阳性对照(足以产生高于空白溶液的平均读数的最小浓度下的胶乳溶液，通过校准曲线确定)进行比较。如果平均读数小于阳性对照的读数，则判定该化合物在该具体浓度可溶。如果平均读数大于或等于阳性对照，将溶液报告为具有沉淀，并使用下式计算沉淀百分比值：
％沉淀＝(测试化合物平均值–空白对照平均值)/(阳性对照平均值–空白对照平均值)×100
体外吸收
体外吸收使用Hidalgo,I.J.et al.(1989),Gastroenterology,96:736-749中所述方法进行测量。
渗透度
测试化合物的表观渗透系数(Papp)如下计算：
其中，VR是受体室的体积，CR,end是在结束时间点受体室中测试化合物的浓度，Δt是孵育时间，A是细胞单层的表面积。CD,mid是供体侧测试化合物的经计算的中点浓度，其是在时间0分钟的供体浓度和在结束时间点的供体浓度的平均值。CR,mid是受体侧测试化合物的中点浓度，其是结束时间点的受体浓度的一半。将测试化合物的浓度表示为测试化合物的峰面积。
从渗透度测定中回收测试化合物
测试化合物的回收率计算如下：
其中VD和VR分别是供体室和受体室的体积。CD,end是在结束时间点供体样本中测试化合物的浓度。CR,end是在结束时间点受体样本中测试化合物的浓度。CD0是在零时间时供体样本中测试化合物的浓度。将测试化合物的浓度表示为测试化合物的峰面积。
用于渗透度测定的荧光素评估
使用荧光素作为细胞单层完整性标记。在测试化合物的渗透度测定之后进行荧光素渗透度评价(在两侧在pH7.4下的A-B方向)。Caco-2和MDR1-MDCKII细胞具有小于1.5×10-6cm/s的荧光素渗透度和MDCKII细胞具有2.5×10-6cm/s的荧光素渗透度的细胞单层被认为是完整的，报告来自完整细胞单层的测试化合物的渗透度结果。
ADME-Tox:体外代谢
使用Obach,R.S.et al.(1997),J.Pharmacol.Exp.Ther.,283:46-58所述的方法评价体外代谢。
固有清除率(微粒体，S9，冷冻保存的肝细胞，重组CYP，重组UGT)代谢稳定性，表示为剩余母体化合物的百分比，通过比较化合物在某时间点相对于时间-0的峰面积进行计算。根据化合物剩余(％)对时间的对数曲线初始线性范围的斜率估计半衰期(T1/2)，假设一级动力学。根据下式计算表观固有清除率(CLint，单位为μL/min/pmol，μL/min/mg或μL/min/Mcell)：
ADME-Tox:体外毒性
细胞活力
通过比较存在测试化合物时的荧光读数与不存在测试化合物(对照)时的荧光读数来计算对照活性百分比。随后，通过从100减去对照值的百分比计算抑制百分比。通过浓度-响应曲线的非线性回归分析确定IC50值。参数通过Hill方程曲线拟合获得。见例如Nociari,M.M.et al.(1998),J.Immunol.Meth.,213:157-167。结果见图2,其显示IC50约为17μM。
实施例3:计算机测定
该实施例的目的是确定保持与EPPIN结合并可抑制精子活力的关键SEMG1(在NCBI数据库记录的基因ID：6406)，残基Cys239(肽中的C11)的任一侧上的最小序列。确定该SEMG1序列为E229至Q247：
E1HS3SKVQ7TS9LC11PAHQDKLQ19(SEQ ID NO:3)
作为该信息的结果，使用Silva et al.,Biology of Reproduction,(2012)87(3):56,1–8中讨论的方法构建3D肽模型。简言之，使用SWISS-MODEL工作站[Arnold etal.,Bioinformatics 2006；22:195–201；Schwede et al.,Nucleic Acids Res 2003；31:3381–3385；and Bordoli et al.,Nat Protocols 2008；4:1–13.]构建了EPPIN C末端区域(K73-P133)的三维同源性模型。模板鉴定后，基于与EPPIN C-末端序列同一度百分比选择(蛋白质数据库鉴定[PDB ID])4种模板：牛胰蛋白酶抑制剂(抑肽酶；1bpiA)、boophilin(2odyE)、textilinin-1(3bybB)和人类VI型胶原蛋白α3链(1kthA)。然后使用所述模板作为参照结构产生EPPIN结构模型。使用QMEAN Z-值比较所得三维模型的质量(所产生模型的整体质量)[22]。选择具有最高QMEANZ值的模型，然后使用Swiss-PDBViewer 4.04(瑞士生物信息研究所)产生EPPIN C-末端模型图并使用POV-Ray3.6(Persistence of VisionRaytracer Pty Ltd)渲染。
使用该模型，将SEMG1肽对接到EPPIN上。对接结果可将结合该肽的EPPIN的氨基酸残基作图。确定与SEMG1肽残基特异性结合的EPPIN残基：
尽管不希望受到具体理论的束缚，但据信这些EPPIN残基最可能是阻断以抑制精子活力的关键残基。如本文所述，化合物TZ4_121可结合EPPIN残基Y107、N116和Q118。来自SEMG1肽结合的信息表明，活性化合物需要覆盖结合位点约的表面积。这种相对大的尺寸对于蛋白质-蛋白质相互作用位点并非出乎意料。
实施例5:AlphaScreenTM测定:表位测定显示可抑制抗EPPIN结合到EPPIN
该化合物筛选测定中，将组氨酸标记的重组人EPPIN附着到NTA-供体珠，将抗-EPPIN(S21C；针对EPPIN C-末端结构域)附着到蛋白A-受体珠。所述表位特异的测定产生EPPIN和抗体之间强且稳定的结合。为高通量筛选(HTS)化合物，调整了PerkinElmer(Waltham,MA)开发的AlphaScreenTM测定。AlphaScreenTM(扩增发光邻近均质测定)测定中，将供体珠和受体珠(～200nm)用于保持相互作用蛋白分子。当相互作用蛋白分子结合时(例如EPPIN{在供体珠上}和抗-EPPIN{在受体珠上})，单重态氧分子从供体珠扩散到受体珠(～4μsec)，随后荧光团发射520-620nm光。
实施例4:计算机辅助精子测定(CASA)结果
将计算机辅助精子测定(CASA)作为用于确定化合物对人类精子活力影响的活细胞化合物筛选。计算机辅助精子测定(CASA)使用Mitra et al.,Biology ofReproduction,Vol.82,p 491(2010)所指示的方法进行，以确定对照比化合物处理精子的参数。测量的参数是：平均路径速度(VAP：以lm/sec为单位的平滑细胞路径的平均速度)、直线速度(VSL：在从轨迹的开始到结束的直线上测量的平均速度lm/sec)、曲线速度(VCL：以lm/sec计的在细胞的实际点对点轨迹上测量的平均速度)、头部侧向移位幅度(ALH：以1m计的头部侧向位移的幅度)、交打频率(BCF：精子头部穿过精子平均路径的频率，单位为Hz)、平直度(STR：VSL/VAP比率的平均值，以％计)和线性度(LIN：VSL/VCL比率的平均值，以％计)。精子活力参数在预热(37℃)的两或四室20-mm Leja载玻片中评估，每个室中分别加载5μL或2μL样品，并立即使用CASA。该计算机测定装置包括相差显微镜(Olympus CX41)、照相机、微型热台加热器、图像数字化仪和用于存储和分析数据的计算机。用于数据分析的软件是HTR Ceros 12.3(Hamilton-Thorne Biosciences)。从每个室扫描13至20个视野的范围。前向运动细胞必须具有最小25μm/sec的VAP和80％的STR。Hamilton-Thorne Ceros12.3的参数列于下表中。
Hamilton-Thorne Ceros 12.3的参数
参数值
帧速率(Hz)60
采集的帧数60
最小对比度80
最小尺寸(像素)3
默认单元格大小(像素)6
VAP(μm/sec)25
STR(％)80
慢细胞静态VAP截值(μm/sec)5
VSL截值(μm/sec)11
标准物镜10X
腔室深度(μm)20
温度(℃)37
在图3和4中分别显示了精液凝固蛋白和TZ4-121的数据。精液凝固蛋白的IC50值(约9μM)和TZ4-121的IC50值(约7.5μM)比较接近，因此预期活性大致相当，TZ4-121活性略强。所述图中，RMI＝相对活力。
为促进使用不同精液的化合物IC50评价，减少由于不同精液样品中精子质量差异而导致的测定间误差，开发了相对活力抑制指数(RMI)。计算为：RMI＝[％活力*VSL]；活动精子的百分比(％活力)或前向运动精子百分比(％前向运动，RPMI)乘以直线速度(VSL)；在从精子轨迹的开始到结束的直线上测量的以μm/sec为单位的平均速度。通过用每个实验条件的RMI除以其各自的DMSO对照计算归一化RMI(RPMI)。
评估精子活力的时间曲线(图5)，并且数据显示在约20μM的浓度下，TZ4-121可能在约3-5分钟内导致不育。
使用该筛选测定，可以高通量方式鉴定可有效抑制EPPIN与精液凝固蛋白结合的化合物。此技术已设计用于高通量筛选，并可适用于384孔板筛选化合物数据库。
强的阳性结果可以系列稀释后重新测试，并且可以检查仍然保持阳性的那些化合物的水溶解度、亲脂性(穿过细胞膜的能力)和化学稳定性。具有药物开发潜力(即溶解度、选择性和效力)的化合物将被作为进一步药物开发的候选物，并且可能用于先导物优化的化学过程。
实施例6.作用机制–降低内部精子pH
进行了一系列实验以确定本发明化合物的作用机制。如O’Rand and Widgren,“Loss of Calcium in Human Spermatozoa via EPPIN,the Semenogelin Receptor,”Biology of Reproduction,(2012)86(2):55,1–7中所述进行所述实验。
精子活力测定
精子活力测定使用计算机辅助精子测定(CASA)(Ceros version 12.3software；Hamilton-Thorne)进行，使用Mitra et al.,Biology of Reproduction,Vol.82,p 491(2010)中所述技术。
测定细胞内游离钙
在37℃在50μl M16M中以1.13105-0.93105个精子/孔将负载Fluo-4AM的精子移入96孔黑壁板(Perkin Elmer，Waltham，MA)中，并在BioTek(Winookski，VT)Synergy2多平台自动平板读数器(带加热器和振动器)中读数。使用485/20滤器激发孔，用528/20滤器读取发射，并使用Gen5软件程序(BioTek)中的Alexafluor 488方案的动力学修饰获得数据。在板中Fluo-4的校准表明，无金属的Fluo-4具有钙饱和复合物的荧光的1/183。在用对照或测试试剂处理每个孔中的精子处理完成后(10-15分钟)，通过加入离子霉素(2.5μM)校准每个孔精子中的Fluo-4，15分钟后加入Mn2(2mM MnCl2)使荧光(F)达到饱和染料的30％。15分钟后，用1％Triton X-100裂解精子得到背景信号。使用每个孔的值，根据Kao等人的方法计算Fmax和Fmin[Kao et al.，J Biol Chem。1989；264：8179-8184]。
依据以下等式将荧光测定值转换为钙浓度
[Ca2+]＝Kd([F-Fmin]/[Fmax-F])
Fluo-4的Kd(解离常数)＝345nM
将每个孔的读数归一化、平均，并且表示为百分数。报告来自3个精液样品的数据。
每15分钟(从t＝5分钟至t＝65分钟)从培养基中移出精子，离心并测量上清液中Fluo-4荧光，测定来自Fluo-4负载精子的染料渗漏[12]。在15分钟时渗漏最小，孵育1小时后渗漏为5％。
pH检测
将pH-敏感染料BCECF的AM酯衍生物(5μM；分子探针)用于检测经SEMG1处理的精子的pH变化。在不含牛血清白蛋白的培养基中用BCECF-AM加载精子30分钟，离心以除去胞外染料，并重悬于M16M中。调节到50μl M16M中1.13105-0.93105个精子/孔，在37℃3.2μMSEMG1处理后使用BioTek(Winookski，VT)Synergy2多平台自动平板读数器(带加热器和振动器)检测，使用485/20滤器激发孔，用528/20滤器读取发射。立即读取荧光并每10秒进行记录，将每个时间点的读数归一化，进行平均，并表示为相对荧光单位降低的百分数。报告来自3个精液样品的数据。
经活性化合物处理的精子中的钙变化
避孕的EPPIN的C-末端表位经鉴定为氨基酸101-125(TCSMFVYGGCQGNNNNFQSKANCLN)(SEQ ID NO.1)。针对EPPIN S21C表位(SMFVYGGAQGNNNNFQSKANC)(SEQ ID NO.4)的亲和纯化的兔抗体(抗-S21C抗体)具有与重组SEMG1类似的效应，即可剂量依赖地抑制精子前向运动[O’Rand,et al.,Biol.Reprod.2009；80:279–285]。为确定施用本发明的化合物是否会导致[Ca2+]损失，在具有150μg/ml抗S21C抗体的自动读板仪中的单个96孔黑壁板的孔中在M16-改良的介质(M16M)中，使用所述化合物例如浓度为10μM处理负载钙指示剂Fluo-4的精子，并测定钙水平。
使用活性化合物处理人类精子
用TZ4-121处理精子导致钙显著损失，其伴随着pH的显著降低(图6)和前向运动显著降低(图7)。这些图显示，所述化合物具有与精液凝固蛋白类似的作用，即，可降低精细胞中的pH，导致活力抑制。
该研究的结果显示，靶向EPPIN的雄性避孕药可通过结合活性化合物、导致pH降低及其后的细胞内钙损失，控制精液中的精子活力。因此，所述活性化合物可取代SEMG1并模拟抗-EPPIN结合，提供非抗体非激素雄性避孕药的基础。
实施例7:使用Clus Pro 2的对接结果
ClusPro2是基于网络的服务，使用来自波士顿大学结构生物信息学实验室的交互软件程序。可将受体(蛋白)和配体(肽)输入程序，并确定肽与受体对接位点的最佳匹配。ClusPro2的描述可见于例如Kozakov et al.,“How good is automated protein dockingProteins:Structure,Function,and Bioinformatics,”2013Aug；2159–2166中。
SEMG1肽结合到EPPIN
经确定可保持结合EPPIN并抑制精子活力的关键SEMG1残基Cys239(肽中的C11)任一侧上的最小序列是SEMG1序列E229至Q247：E1HS3SKVQ7TS9LC11PAHQDKLQ19(SEQ ID NO.3)。
所述信息被用于构建3D肽模型，并随后将SEMG1肽对接至EPPIN。结果见图8。
实施例8:应用SwissDock的对接结果
SwissDock，基于EADock DSS的蛋白质小分子对接网络服务，是来自瑞士生物信息研究所的交互式软件程序。可将小的有机化合物结构和具有对接位点的蛋白质结构输入所述程序，并确定所述化合物与对接位点的最佳匹配。
EPPIN同源建模
使用SWISS-MODEL工作站(Silva et al.,Biology of Reproduction(2012)87(3):56,1–8)构建EPPIN C-末端区(K73-P133)的三维同源模型。模板鉴定后，基于与EPPINC-末端序列同一度百分比选择(蛋白质数据库鉴定[PDB ID])4种模板：牛胰蛋白酶抑制剂(抑肽酶；1bpiA)、boophilin(2odyE)、textilinin-1(3bybB)和人类VI胶原蛋白α3链(1kthA)。然后使用所述模板作为参考结构产生EPPIN结构模型。使用QMEAN Z-值比较所得三维模型的质量(所产生模型的整体质量)[22]。选择具有最高QMEANZ值的模型，然后使用Swiss-PDBViewer 4.04(瑞士生物信息研究所)产生EPPIN C-末端模型图并使用POV-Ray3.6(Persistence of Vision Raytracer Pty Ltd)渲染。
由于Clus Pro仅能分析肽，并且目标是评价小分子与EPPIN的结合，因此使用Swiss-Dock。将EPPIN结合位点的氨基酸输入，然后添加TZ4_121的化学式，并使用所述软件计算“最佳匹配”(最低能量：Δg)。通过该方法，评价了TZ4_121化合物(实心圆)在EPPIN表面的SEMG1结合位点的对接(图9)。EPPIN与所述化合物之间的氢键如下所示(n＝3次独立实验)。
实施例9:代谢物的结果
TZ4_121包含乙酯基团。该基团在体内可代谢，因此使用以上所列技术进行实验以比较TZ4_121及其脱乙基化代谢物对精子活力的影响。图10中数据显示，代谢物的活性略强，其前向活力的IC50约为3.4μM，而母体化合物为4.3μM。
虽然上述说明书教导了本发明的原理，提供了实施例用于说明目的，应理解本发明的实践包括落入所附权利要求及其等同物的范围内的所有通常的变化，修改和/或修改。本文引用的所有参考文献以引用方式全文纳入本文用于所有目的。
序列表
<110> 北卡罗来纳大学，教堂山
<120> 用于抑制雄性生育力的小分子
<130> 33859-001 PCT (223022)
<150> 61/953,293
<151> 2014-03-14
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人类
<400> 1
Thr Cys Ser Met Phe Val Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Asn Asn Asn
1 5 10 15
Phe Gln Lys Ala Asn Cys Leu Asn
20
<210> 2
<211> 461
<212> PRT
<213> 人类
<400> 2
Met Lys Pro Asn Ile Ile Phe Val Leu Ser Leu Leu Leu Ile Leu Glu
1 5 10 15
Lys Gln Ala Ala Val Met Gly Gln Lys Gly Gly Ser Lys Gly Arg Leu
20 25 30
Pro Ser Glu Phe Ser Gln Phe Pro His Gly Gln Lys Gly Gln His Tyr
35 40 45
Ser Gly Gln Lys Gly Lys Gln Gln Thr Glu Ser Lys Gly Ser Phe Ser
50 55 60
Ile Gln Tyr Thr Tyr His Val Asp Ala Asn Asp His Asp Gln Ser Arg
65 70 75 80
Lys Ser Gln Gln Tyr Asp Leu Asn Ala Leu His Lys Thr Thr Lys Ser
85 90 95
Gln Arg His Leu Gly Gly Ser Gln Gln Leu Leu His Asn Lys Gln Glu
100 105 110
Gly Arg Asp His Asp Lys Ser Lys Gly His Phe His Arg Val Val Ile
115 120 125
His His Lys Gly Gly Lys Ala His Arg Gly Thr Gln Asn Pro Ser Gln
130 135 140
Asp Gln Gly Asn Ser Pro Ser Gly Lys Gly Ile Ser Ser Gln Tyr Ser
145 150 155 160
Asn Thr Glu Glu Arg Leu Trp Val His Gly Leu Ser Lys Glu Gln Thr
165 170 175
Ser Val Ser Gly Ala Gln Lys Gly Arg Lys Gln Gly Gly Ser Gln Ser
180 185 190
Ser Tyr Val Leu Gln Thr Glu Glu Leu Val Ala Asn Lys Gln Gln Arg
195 200 205
Glu Thr Lys Asn Ser His Gln Asn Lys Gly His Tyr Gln Asn Val Val
210 215 220
Glu Val Arg Glu Glu His Ser Ser Lys Val Gln Thr Ser Leu Cys Pro
225 230 235 240
Ala His Gln Asp Lys Leu Gln His Gly Ser Asp Ile Phe Ser Thr Gln
245 250 255
Asp Glu Leu Leu Val Tyr Asn Lys Asn Gln His Gln Thr Lys Asn Leu
260 265 270
Asn Gln Asp Gln Gln His Gly Arg Lys Ala Asn Lys Ile Ser Tyr Gln
275 280 285
Ser Ser Ser Thr Glu Glu Arg Arg Leu His Tyr Gly Glu Asn Gly Val
290 295 300
Gln Lys Asp Val Ser Gln Ser Ser Ile Tyr Ser Gln Thr Glu Glu Lys
305 310 315 320
Ala Gln Gly Lys Ser Gln Lys Gln Ile Thr Ile Pro Ser Gln Glu Gln
325 330 335
Glu His Ser Gln Lys Ala Asn Lys Ile Ser Tyr Gln Ser Ser Ser Thr
340 345 350
Glu Glu Arg Arg Leu His Tyr Gly Glu Asn Gly Val Gln Lys Asp Val
355 360 365
Ser Gln Arg Ser Ile Tyr Ser Gln Thr Glu Lys Leu Val Ala Gly Lys
370 375 380
Ser Gln Ile Gln Ala Pro Asn Pro Lys Gln Glu Pro Trp His Gly Glu
385 390 395 400
Asn Ala Lys Gly Glu Ser Gly Gln Ser Thr Asn Arg Glu Gln Asp Leu
405 410 415
Leu Ser His Glu Gln Lys Gly Arg His Gln His Gly Ser His Gly Gly
420 425 430
Leu Asp Ile Val Ile Ile Glu Gln Glu Asp Asp Ser Asp Arg His Leu
435 440 445
Ala Gln His Leu Asn Asn Asp Arg Asn Pro Leu Phe Thr
450 455 460
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人类
<400> 3
Glu His Ser Ser Lys Val Gln Thr Ser Leu Cys Pro Ala His Gln Asp
1 5 10 15
Lys Leu Gln
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 人类
<400> 4
Ser Met Phe Val Tyr Gly Gly Ala Gln Gly Asn Asn Asn Asn Phe Gln
1 5 10 15
Ser Lys Ala Asn Cys
20

Claims (21)

1.一种提供避孕的方法，其包括对需要雄性避孕的患者施用有效量的、模拟抗-EPPIN抗体与EPPIN的结合的小分子。
2.权利要求1所述的方法，其中所述小分子模拟抗-EPPIN抗体与EPPIN的C-末端表位的结合。
3.权利要求1所述的方法，其中所述小分子具有下式之一：
及其互变异构体、前药和药学上可接受的盐，
其中：
R1是-CH2R5,
R2是H、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、C(X)R6或C(X)XR6,
R3是-NHR7、-C(X)NHR7、-NHC(X)R7、-NHC(X)XR7、-R8或–C(X)R8；
R4是OR7或-C(X)OR7,
R5是H、F、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、-XC(X)XR6、C(X)XR6或C(X)R6,
R6和R7是H、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、芳基、芳基烷基或烷基芳基；
R8是
X是O、S或NR7,优选地是O,
Y是O、S、NR7或C(R7)2，
Zj是指数量为j的取代基Z，所述取代基可以存在于苯环上的任意碳原子，其中j是0、1或2，每个Z取代基可独立地选自包含C1-8烷基、C1-8取代的烷基、C2-8烯基、C2-8取代的烯基、杂环基、取代的杂环基、C3-8环烷基、C3-8取代的环烷基、芳基(包括杂芳基)、取代的芳基(包括杂芳基)、烷基芳基、取代的烷基芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-OR7、-N(R7)2、-CF3、-CN、-NO2、-C2R7、-SR7、-N3、-C(＝O)N(R7)2、-NR7C(＝O)R7、-C(＝O)R7、-C(＝O)OR7、-OC(＝O)R7、-O(CR6R7)rC(＝O)R7-、-O(CR6R7)rNR7C(＝O)R7、-O(CR6R7)rNR7SO2R7、-OC(＝O)NR6R7、-NR7C(＝O)OR7、-SO2R7、-SO2NR6R7和-NR7SO2R7的组，
r是1到6的整数，且
n是0、1、2或3,
应用于烷基、芳基(包括杂芳基)、环烷基等的术语“取代的”是指始于卤素止于-NR7SO2R7的上述取代基，；
及其互变异构体、前药和药学上可接受的盐，
其中所述化合物可作为单个立体异构体或立体异构体的混合物存在。
4.权利要求3所述的化合物，其中卤代烷基是单氟甲基。
5.权利要求3所述的化合物，其中R5是F、-XC(X)XR6或C(X)XR6。
6.权利要求3所述的化合物，其中一种或多种C＝X基团是羰基(C＝O)。
7.权利要求3所述的方法，其中所述小分子具有下式之一：
TZ4_121(EP007)
EP012 TZ4_121的脱乙基产物
TZ4_125
EP013 TZ4_125的脱乙基产物
TZ4_132
EP025 TZ4_132的脱乙基产物
EP017(来自EP012)
EP021(来自EP012)
EP024(来自EP012)
8.权利要求1所述的方法，其中所述小分子具有下式：
及其互变异构体、前药和药学上可接受的盐，其中R1、R3和R4如权利要求3中所定义的。
9.权利要求5所述的方法，其中所述化合物具有下式之一：
10.一种用于提供雄性避孕的药物组合物，其包含有效量的、权利要求3-9任一项的化合物。
11.一种杀精子组合物，其包含水溶性润滑剂和有效量的、权利要求3-9任一项的化合物。
12.权利要求3-9任一项的化合物在制备用于提供雄性组合物的药物中的用途。
13.权利要求12所述的用途，其中所述药物是杀精子组合物。
14.一种化合物，具有下式之一：
及其互变异构体、前药和药学上可接受的盐，
其中：
R1是-CH2R5,
R2是H、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、C(X)R6或C(X)XR6,
R3是-NHR7、-C(X)NHR7、-NHC(X)R7、-NHC(X)XR7、-R8或–C(X)R8；
R4是OR7或-C(X)OR7，
R5是H、F、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、-XC(X)XR6、C(X)XR6或C(X)R6,
R6和R7是H、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、芳基、芳基烷基或烷基芳基；
R8是
X是O、S或NR7,优选地是O,
Y是O、S、NR7或C(R7)2,
Zj是指数量为j的取代基Z，所述取代基可以存在于苯环上的任意碳原子，其中j是0、1或2，每个Z取代基可独立地选自包含C1-8烷基、C1-8取代的烷基、C2-8烯基、C2-8取代的烯基、杂环基、取代的杂环基、C3-8环烷基、C3-8取代的环烷基、芳基(包括杂芳基)、取代的芳基(包括杂芳基)、烷基芳基、取代的烷基芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-OR7、-N(R7)2、-CF3、-CN、-NO2、-C2R7、-SR7、-N3、-C(＝O)N(R7)2、-NR7C(＝O)R7、-C(＝O)R7、-C(＝O)OR7、-OC(＝O)R7、-O(CR6R7)rC(＝O)R7-、-O(CR6R7)rNR7C(＝O)R7、-O(CR6R7)rNR7SO2R7、-OC(＝O)NR6R7、-NR7C(＝O)OR7、-SO2R7、-SO2NR6R7和-NR7SO2R7的组，
r是1到6的整数，且
n是0、1、2或3,
应用于烷基、芳基(包括杂芳基)、环烷基等的术语“取代的”是指始于卤素止于-NR7SO2R7的上述取代基；
及其互变异构体、前药和药学上可接受的盐，
其中所述化合物可作为单个立体异构体或立体异构体的混合物存在。
15.权利要求14所述的化合物，其中卤代烷基是单氟甲基。
16.权利要求14所述的化合物，其中R5是F、-XC(X)XR6或C(X)XR6。
17.权利要求14所述的化合物，其中一种或多种C＝X基团是羰基(C＝O)。
18.权利要求14所述的化合物，其中所述化合物具有下式之一：
19.权利要求14所述的化合物，其中所述化合物具有下式：
20.权利要求14所述的化合物，其具有下式之一：
21.权利要求14所述的化合物，其具有下式:
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021147954A1 (zh) * 2020-01-21 2021-07-29 上海柏全生物科技有限公司 Semg2抗体及其用途
WO2022193993A1 (zh) * 2021-03-16 2022-09-22 上海柏全生物科技有限公司 精液凝固蛋白的中和抗体及其表位和应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220249598A1 (en) * 2019-06-10 2022-08-11 Kent State University Compositions targeting sperm calcineurin
US20230390298A1 (en) * 2022-06-06 2023-12-07 Eppin Pharma, Inc. Method and compositions for use in providing male contraception

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009042565A2 (en) * 2007-09-26 2009-04-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Inhibitors of eppin/semenogelin binding as male contraceptives
CN101402674A (zh) * 2008-10-20 2009-04-08 中国人民解放军第三军医大学 附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段及应用

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL134681C (zh) 1966-04-26
US3546141A (en) 1966-08-08 1970-12-08 Mc Donnell Douglas Corp Phosphorus-nitrogen polymers and process
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3734097A (en) 1969-04-01 1973-05-22 Alza Corp Therapeutic adhesive tape
US3598122A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3797494A (en) 1969-04-01 1974-03-19 Alza Corp Bandage for the administration of drug by controlled metering through microporous materials
US3731683A (en) 1971-06-04 1973-05-08 Alza Corp Bandage for the controlled metering of topical drugs to the skin
US3742951A (en) 1971-08-09 1973-07-03 Alza Corp Bandage for controlled release of vasodilators
US3996934A (en) 1971-08-09 1976-12-14 Alza Corporation Medical bandage
US3747480A (en) 1971-09-08 1973-07-24 P Kalikow Box forming machine
US4031894A (en) 1975-12-08 1977-06-28 Alza Corporation Bandage for transdermally administering scopolamine to prevent nausea
EP0011471B1 (en) 1978-11-17 1983-02-09 SMITH &amp; NEPHEW RESEARCH LIMITED Adhesive-coated sheet material incorporating anti-bacterial substances
US4291014A (en) 1979-01-11 1981-09-22 Key Pharmaceuticals, Inc. Polymeric diffusion matrix containing estradiol diacetate
US4297995A (en) 1980-06-03 1981-11-03 Key Pharmaceuticals, Inc. Bandage containing attachment post
GB2079194B (en) 1980-07-09 1983-08-03 Westering Insulation Systems L Coil shaping apparatus
US4336243A (en) 1980-08-11 1982-06-22 G. D. Searle & Co. Transdermal nitroglycerin pad
JPS5843368B2 (ja) 1980-10-30 1983-09-27 日東電工株式会社 消炎鎮痛貼付剤
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4460372A (en) 1981-02-17 1984-07-17 Alza Corporation Percutaneous absorption enhancer dispenser for use in coadministering drug and percutaneous absorption enhancer
US4379454A (en) 1981-02-17 1983-04-12 Alza Corporation Dosage for coadministering drug and percutaneous absorption enhancer
US4460585A (en) 1981-07-06 1984-07-17 William H. Rorer, Inc. 1-Aryl-4-hydrazinyl-s-triazin-2-ones
US4486193A (en) 1981-07-22 1984-12-04 Alza Corporation Method for treating ischemic conditions by administering drug by two routes
US4530840A (en) 1982-07-29 1985-07-23 The Stolle Research And Development Corporation Injectable, long-acting microparticle formulation for the delivery of anti-inflammatory agents
US4906474A (en) 1983-03-22 1990-03-06 Massachusetts Institute Of Technology Bioerodible polyanhydrides for controlled drug delivery
US4725442A (en) 1983-06-17 1988-02-16 Haynes Duncan H Microdroplets of water-insoluble drugs and injectable formulations containing same
US4622219A (en) 1983-06-17 1986-11-11 Haynes Duncan H Method of inducing local anesthesia using microdroplets of a general anesthetic
US5364620A (en) 1983-12-22 1994-11-15 Elan Corporation, Plc Controlled absorption diltiazem formulation for once daily administration
US4891225A (en) 1984-05-21 1990-01-02 Massachusetts Institute Of Technology Bioerodible polyanhydrides for controlled drug delivery
US4615699A (en) 1985-05-03 1986-10-07 Alza Corporation Transdermal delivery system for delivering nitroglycerin at high transdermal fluxes
US4681584A (en) 1985-05-03 1987-07-21 Alza Corporation Transdermal delivery system for delivering nitroglycerin at high transdermal fluxes
US4764381A (en) 1985-12-06 1988-08-16 Key Pharmaceuticals, Inc. Percutaneous penetration enhancer of oleic acid and 2-ethyl-1, 3-hexanediol
US4666441A (en) 1985-12-17 1987-05-19 Ciba-Geigy Corporation Multicompartmentalized transdermal patches
IT1198449B (it) 1986-10-13 1988-12-21 F I D I Farmaceutici Italiani Esteri di alcoli polivalenti di acido ialuronico
US4863970A (en) 1986-11-14 1989-09-05 Theratech, Inc. Penetration enhancement with binary system of oleic acid, oleins, and oleyl alcohol with lower alcohols
US5719197A (en) 1988-03-04 1998-02-17 Noven Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for topical administration of pharmaceutically active agents
IE60383B1 (en) 1988-05-27 1994-07-13 Elan Corp Plc Controlled release pharmaceutical formulation
US4938763B1 (en) 1988-10-03 1995-07-04 Atrix Lab Inc Biodegradable in-situ forming implants and method of producing the same
US4883660A (en) 1988-10-17 1989-11-28 Thames Pharmacal Co., Inc. Gel bases for pharmaceutical compositions
US4956171A (en) 1989-07-21 1990-09-11 Paco Pharmaceutical Services, Inc. Transdermal drug delivery using a dual permeation enhancer and method of performing the same
IE66933B1 (en) 1990-01-15 1996-02-07 Elan Corp Plc Controlled absorption naproxen formulation for once-daily administration
US5626863A (en) 1992-02-28 1997-05-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Photopolymerizable biodegradable hydrogels as tissue contacting materials and controlled-release carriers
EP0612258B1 (en) 1991-11-13 1997-07-09 Elan Corporation Plc Drug delivery device
GB9202464D0 (en) 1992-02-05 1992-03-18 Danbiosyst Uk Composition for nasal administration
US5453279A (en) 1992-04-21 1995-09-26 Tbs Laboratories, Inc. Enhancing transdermal absorption compositions; transdermal dosage form; and process
IE75744B1 (en) 1995-04-03 1997-09-24 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable micro- and nanospheres containing cyclosporin
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
US5785991A (en) 1995-06-07 1998-07-28 Alza Corporation Skin permeation enhancer compositions comprising glycerol monolaurate and lauryl acetate
US6201065B1 (en) 1995-07-28 2001-03-13 Focal, Inc. Multiblock biodegradable hydrogels for drug delivery and tissue treatment
WO2001085700A2 (en) * 2000-05-08 2001-11-15 Janssen Pharmaceutica N.V. Hiv replication inhibiting pyrimidines and triazines
WO2012097478A1 (en) * 2011-01-21 2012-07-26 Abbott Laboratories Bicyclic carboxamide inhibitors of kinases

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009042565A2 (en) * 2007-09-26 2009-04-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Inhibitors of eppin/semenogelin binding as male contraceptives
CN101402674A (zh) * 2008-10-20 2009-04-08 中国人民解放军第三军医大学 附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOVLATYAN, V. V. ET AL.: "Synthesis of α-methylhydrazino-s-triazines", 《ARMYANSKII KHIMICHESKII ZHURNAL》 *
STN: "REGISTRY COPYRIGHT", 《REGISTRY COPYRIGHT》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021147954A1 (zh) * 2020-01-21 2021-07-29 上海柏全生物科技有限公司 Semg2抗体及其用途
WO2022193993A1 (zh) * 2021-03-16 2022-09-22 上海柏全生物科技有限公司 精液凝固蛋白的中和抗体及其表位和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA2942078C (en) 2023-03-14
EP3116861B1 (en) 2020-12-16
US20170057934A1 (en) 2017-03-02
US10472334B2 (en) 2019-11-12
WO2015138919A1 (en) 2015-09-17
EP3116861A1 (en) 2017-01-18
EP3116861A4 (en) 2017-09-13
CA2942078A1 (en) 2015-09-17
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