CN106381280B - 用于诱导人类多能干细胞的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于诱导人类多能干细胞的方法和组合物。本发明提供了多能性干细胞样(PSCL)细胞或无性系、培养基和它的上清和生产和使用多能干细胞的方法。

Description

用于诱导人类多能干细胞的方法和组合物
相关申请的相互参考
本申请要求2010年5月13日提交的美国临时申请号61/334,315的利益，该临时申请所教的内容的整体被纳入文本作为参考。
技术领域
本发明大体上涉及用于诱导人类多能干细胞(human pluripotent stem cells)的方法和组合物(composition)
背景技术
胚胎干细胞(ES)是多能细胞，它能够在细胞培养中增殖和向表现出多能性质的多种细胞系限制性细胞(lineage-restricted cell)群体分化(Odorico et al.,Stem Cells19:193-204(2001))。由于这些特征，包括人类胚胎干细胞的胚胎干细胞能够成为非常特定的细胞类型，该细胞类型表现出多种功能。
通常人类胚胎干细胞是高度成分均一，具有自我复制能力和分化成人体中的任意功能细胞的能力。在合适的条件下，自我复制能够导致长期增殖能力，具有在细胞培养中无限扩增的潜力。另外，如果人类胚胎干细胞以无向的方式(undirected fashion)分化，用于表达用于多数不同组织类型标志的细胞的异质性群体(heterogeneous population)被获得(WO 01/51616；和Shamblott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:113(2001))。这些特征使得人类胚胎干细胞独特、均一，用于制备具有治疗功效的细胞的起源群体。
人类胚胎干细胞能够被用于制备多种用于科学和商业研究用途的分化细胞类型。目前，许多类型的分化人类细胞不易获得且在体外培养中不能大量的扩增。然而，人类胚胎干细胞在培养中能够无限地扩增，且能够分化成许多(即使不是全部)人体的分化细胞类型。这样以来，诱导人类胚胎干细胞分化成任何数量的人体的特定细胞类型的培养技术正在被开发。用于科学和商业研究的许多分化人类细胞可被大量地供应的可能性已经被人类胚胎干细胞的可用性开启。
从事人类胚胎干细胞的一个困难是不使用动物产品或产品，如血清，开发用于人类胚胎干细胞的标准培养的条件，动物产品或产品，如血清趋向于批次到批次不同。这样以来，本领域希望人类胚胎干细胞培养的培养条件尽可能界定。
为了实现那个想法，一组培养条件最近被描述即允许在界定的条件下长期培养未分化的人类胚胎干细胞。Ludwig et al.,Nat.Methods 3:637-646(2006)，整体纳入文本作为参考。Ludwig等描述了一种培养基，本文该培养基被称为TeSRTM培养基，其用于培养人类胚胎干细胞，该培养基的每种成分被充分公开和表征。因此，TeSRTM是一种用于人类胚胎干细胞培养的被充分界定且足够的培养基。TeSRTM已经被证明在用于新鲜人类胚胎干细胞系的衍生中的使用也有效，新鲜人类胚胎干细胞系的衍生甚至比未分化的人类胚胎干细胞培养更有挑战性限制。
当生长在细胞与其它细胞或它们环境中的物理结构(physical structures)直接接触的环境中时，人类胚胎干细胞优先地保持未分化。在其它细胞环境中，人类胚胎干细胞开始分化且不能无限增殖。
在克隆一种胚胎干细胞培养的过程中，这是有意义的。本文使用的“克隆”意思是从起始培养启动一种胚胎干细胞培养的方法，理想地，从单个胚胎干细胞或至少从极少数个胚胎干细胞。允许未分化的胚胎干细胞的克隆培养的培养条件也许是在常规的胚胎干细胞培养和增殖中要求的所有条件中的最基本条件。
尽管在有效地培养胚胎干细胞中取得了进展，这些方法的几个重大缺点仍然存在。例如，通过MEF调节的培养基(MEF-conditioned medium)或基质胶(matrigel matrix)，暴露于动物病原体仍然是一种可能。在人类治疗中使用人类胚胎干细胞的主要障碍是最初描述的繁殖人类胚胎干细胞的方法，该方法涉及在非人类起源的一层饲养细胞(feedercells)上，且在非人类起源的营养血清的存在下培养人类胚胎干细胞。最近，广泛研究改进用于人类胚胎干细胞的培养体系已经集中在在无血清/无饲料的条件下种植胚胎干细胞的能力上。例如，为了保证一种用于人类胚胎干细胞的生长的无饲料的环境，包括血清替代物(SR)，转化生长因子.beta.1(TGF-.beta.1),LIF,bFGF和基质纤连蛋白(fibronectinmatrix)的培养基的替代体系也已经被尝试(Amit et al(2004),Biol.Reprod.70(3):837-45)。评价在人类饲料或无饲料基质上衍生和繁殖未分化的人类胚胎干细胞的方法在继续。
发明内容
本发明提供了一种用于重新编程细胞进入多能干细胞样(a pluripotent stemcelllike)(PSCL)细胞或无性系(clone)的方法和组合物，用于本发明的方法的一种培养基、PSCL细胞或无性系和使用所述PSCL细胞或无性系治疗或减轻紊乱(disorder)的一种方法。
在一方面，本发明提供了一种细胞培养基组合物，所述组合物包括纤维调节素(FMOD)或它的衍生物或片段，其中所述组合物对重新编程细胞以便形成多能干细胞样(PSCL)无性系是有效的，其中所述PSCL克隆，在免疫荧光染色中，由针对人类Oct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60(S)或TRA-1-181的抗体识别。
在一些实施例中，所述FMOD是FMOD蛋白质或肽。
所述细胞培养基组合物可以具有不同浓度的FMOD蛋白质或肽。在一些实施例中，所述组合物具有浓度从约200nM到约800nM的FMOD。
在上述组合物中，所述细胞可以为任意哺乳动物的细胞。在一些实施例中，所述细胞是人类细胞、小鼠细胞(mouse cell)或大鼠细胞(rat cell)。人类细胞的例子包括，例如，BJ、和NHDF。
在另一方面，本发明提供了一种重新编程哺乳动物细胞进入PSCL细胞或无性系的方法。在一些实施例中，所述方法包括：
用细胞培养基处理哺乳动物细胞从一天到一个月的一段时间，和
有规律地更换所述细胞培养基直至多能干细胞样(PSCL)无性系形成；
其中所述培养基包括纤维调节素(fibromodulin)(FMOD)或它的衍生物或片段，
其中所述组合物对重新编程所述细胞以便形成PSCL无性系是有效的，和
其中所述PSCL无性系，在免疫荧光染色中，由针对人类Oct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60(S)或TRA-1-181的抗体识别。
在一些实施例中，所述FMOD是FMOD蛋白质或肽。
在上述方法中，所述细胞培养基组合物可以具有不同浓度的FMOD蛋白质或肽。在一些实施例中，所述组合物具有浓度从约200nM到约800nM的FMOD。
在上述方法中，所述细胞可以为任意哺乳动物的细胞。在一些实施例中，所述细胞是人类细胞、小鼠细胞或大鼠细胞。人类细胞的例子包括，例如，BJ、、NHDF、角化细胞、黑色素细胞、外周血细胞(例如，CD34+)、脐带血细胞或甚至某些干细胞(例如，脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells)、血管周围干细胞或神经干细胞)。
在本发明的进一步方面，它提供了一种多能干细胞样(PSCL)细胞或无性系，其由一种方法产生，所述方法包括：
用细胞培养基处理哺乳动物细胞从一天到一个月的一段时间，和
有规律地更换细胞培养基直至多能干细胞样(PSCL)无性系形成；
其中所述培养基包括纤维调节素(FMOD)或它的衍生物或片段，
其中所述组合物对重新编程细胞以便形成PSCL无性系是有效的，和
其中，所述PSCL无性系，在免疫荧光染色中，由针对人类Oct4A、Sox2、Nanog、SSEA4、TRA-1-60(S)或TRA-1-181的抗体识别。
在一些实施例中，所述FMOD是FMOD蛋白质或肽。
在上述方法中，所述细胞培养基组合物可以具有不同浓度的FMOD蛋白质或肽。在一些实施例中，所述组合物具有FMOD浓度从约200nM到约800nM。
在上述方法中，细胞可以为任意哺乳动物的细胞。在一些实施例中，细胞是人类细胞、小鼠细胞或大鼠细胞。人类细胞的例子包括，例如，BJ、NHDF、角化细胞、黑色素细胞、外周血细胞(例如CD34+)、脐带血细胞或甚至某些干细胞(例如，脂肪源性干细胞、血管周围干细胞或神经干细胞)。所述PSCL细胞或无性系能够被用于治疗或减轻任意紊乱，这些紊乱能够被多能或全能干细胞治疗或减轻。通常，所述方法包括给予哺乳动物受试者(例如，人类或动物)本文公开的PSCL细胞或无性系。在一些实施例中，所述紊乱可以是神经组织退化的紊乱(neurodegenerative disorder)。
在一些实施例中，所述紊乱可以是中枢神经系统(CNS)疾病、心血管病、血液病、克罗恩病(Crohn’s disease)、骨疾病、肌病或软骨疾病。
在一些实施例中，所述紊乱可以是视网膜疾病。
在一些实施例中，所述紊乱可以是对组织的创伤和损害。这样的组织的例子可以是皮肤、肌肉、软骨、筋、末梢神经、脊髓、血管或骨头。
在一些实施例中，所述紊乱可以是骨骼疾病。
在一些实施例中，所述紊乱可以是器官疾病。
在另一方面，本发明提供了一种包括本文公开的培养基的上清(supernatant)，所述上清的实施例在上文和下文中都被描述。所述上清对治疗或减轻紊乱是有效的，就像本文公开的PSCL细胞或无性系。在一些实施例中，本发明提供一种包括本文公开的上清的组合物。所述组合物可以是药物或化妆组合物，所述组合物可以被给予哺乳动物受试者以便治疗或减轻本文公开的紊乱。
附图说明
图1a和图1b显示的是暴露于FMOD之后，大鼠-2成纤维细胞形成具有胚胎干细胞(ES)形貌的无性系。
图2a-2c显示的是对人类新生儿包皮皮肤成纤维细胞(human newborn foreskindermal fibroblast)BJ细胞测试结果。
图3显示的是人类正常成人皮肤成纤维细胞NHDF细胞测试结果。
图4显示的是对人类新生儿包皮皮肤成纤维细胞BJ细胞测试结果。
图5显示的是用针对人类iPS细胞的核心转录调控因子(key transcriptionalregulators)(NANOG、OCT4SOX2)的抗体和在所有人类多能细胞(SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)的细胞表面上被表达的抗原，BJ-FiPS细胞进一步通过免疫荧光染色被识别。标尺：200μm.
图6显示的是BJ-FiPS细胞进一步被RT-PCR识别。未处理的BJ细胞被用作对照。用于iPS表征(SOX2、OCT4、NANOG和hTERT)、外胚层标记(KRT-18和巢蛋白(NESTIN))、内胚层标记(AFP和GATA-4)，中胚层标志(FLT-1、BMP-4和血管内皮钙粘蛋白(VE-Cadherin))的引物被用做针对β-肌动蛋白的对照引物。
图7显示的是使用AggreWell 800协议表达(AggreWell 800protocolexpression)，BJ-FiPS在悬浮培养中形成胚胎体(EBs)。
图8a-8c显示的是经过14天悬浮培养后，免疫染色显示BJ-FiPS EBs用iPS标记(a)和外胚层(b)及中胚层标记(c)表达。
图9显示的是BJ-FiPS细胞在体外分化成造骨细胞。
图10显示的是NHDF-FiPS细胞在体外分化成造骨细胞。
图11显示的是在SCID-小鼠睾丸中FiPS细胞分化成骨组织。
图12显示的是FiPS细胞被转移入脂肪生成培养基(adipogenesis medium)(Lonza)中21天。
图13a和图13b显示的是对BJ-FiPS细胞的测试结果。
图14a和图14b显示的是对BJ-FiPS EBS细胞的试验结果。
图15a和图15b显示的是对在饲养细胞上BJ-FiPS细胞生长的试验结果。
具体实施方式
在一方面，本发明提供一种用于重新编程哺乳动物细胞进入多能干细胞样(PSCL)细胞的方法。该方法一般包括用培养基处理哺乳动物细胞足够长的一段时间，导致哺乳动物细胞被重新编程进入细胞或无性系，所述细胞或无性系表现出或具有多能干细胞的一个或多个特征或性质。在一些实施例中，所述培养基包括纤维调节素(FMOD)蛋白质或肽，或它的衍生物或片段。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约1nM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约1nM到约10nM，从约1nM到约20nM，从约1nM到约50nM，从约1nM到约100nM，从约1nM到约200nM，从约1nM到约500nM，从约1nM到约1000nM，从约1nM到约2μM，从约1nM到约5μM，从约1nM到约10μM，从约1nM到约20μM，从约1nM到约50μM，从约1nM到约100μM，从约1nM到约200μM或从约1nM到约500μM。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约10nM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约10nM到约20nM，从约10nM到约50nM，从约10nM到约100nM，从约10nM到约200nM，从约10nM到约500nM，从约10nM到约1000nM，从约10nM到约2μM，从约10nM到约5μM，从约10nM到约10μM，从约10nM到约20μM，从约10nM到约50μM，从约10nM到约100μM,从约10nM到约200μM或从约10nM到约500μM。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约20nM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约20nM到约50nM，从约20nM到约100nM，从约20nM到约200nM，从约20nM到约500nM，从约20nM到约1000nM，从约20nM到约2μM，从约20nM到约5μM，从约20nM到约10μM，从约20nM到约20μM，从约20nM到约50μM，从约20nM到约100μM,从约20nM到约200μM或从约20nM到约500μM。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约50nM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约50nM到约100nM，从约50nM到约200nM，从约50nM到约500nM，从约50nM到约1000nM，从约50nM到约2μM，从约50nM到约5μM，从约50nM到约10μM，从约50nM到约20μM，从约50nM到约50μM，从约50nM到约100μM，从约50nM到约200μM或从约50nM到约500μM。
在一些实施例中，培养基可以包括浓度从约100nM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约100nM到约200nM，从约100nM到约500nM，从约100nM到约1000nM，从约100nM到约2μM，从约100nM到约5μM，从约100nM到约10μM，从约100nM到约20μM，从约100nM到约50μM，从约100nM到约100μM，从约100nM到约200μM或从约100nM到约500μM。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约200nM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约200nM到约500nM，从约200nM到约1000nM，从约200nM到约2μM，从约200nM到约5μM，从约200nM到约10μM，从约200nM到约20μM，从约200nM到约50μM，从约200nM到约100μM，从约200nM到约200μM，或从约200nM到约500μM。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约500nM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约500nM到约1000nM，从约500nM到约2μM，从约500nM到约5μM，从约500nM到约10μM，从约500nM到约20μM，从约500nM到约50μM，从约500nM到约100μM，从约500nM到约200μM或从约500nM到约500μM。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约1000nM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约1000nM到约2μM，从约1000nM到约5μM，从约1000nM到约10μM，从约1000nM到约20μM，从约1000nM到约50μM，从约1000nM到约100μM，从约1000nM到约200μM或从约1000nM到约500μM。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约2μM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约2μM到约5μM，从约2μM到约10μM，从约2μM到约20μM，从约2μM到约50μM，从约2μM到约100μM，从约2μM到约200μM或从约2μM到约500μM。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约5μM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约5μM到约10μM，从约5μM到约20μM，从约5μM到约50μM，从约5μM到约100μM，从约5μM到约200μM或从约5μM到约500μM。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约10μM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约10μM到约20μM，从约10μM到约50μM，从约10μM到约100μM，从约10μM到约200μM或从约10μM到约500μM。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约20μM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约20μM到约50μM，从约20μM到约100μM，从约20μM到约200μM或从约20μM到约500μM。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约50μM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约50μM到约100μM，从约50μM到约200μM或从约50μM到约500μM。
在一些实施例中，所述培养基可以包括浓度从约100μM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽，例如，从约100μM到约200μM或从约100μM到约500μM。
在一些实施例中，培养基可以包括浓度从约500μM到约1000μM的FMOD蛋白质或肽。
除了所述FMOD蛋白质或肽或它的衍生物或片段，所述培养基可以是在本领域普遍使用的任意细胞培养基。例如，培养基通常包括盐水。细胞培养基的一个例子包括，例如，盐水、pH为7.4的PBS、DMEM培养基或成纤维细胞碱性培养基(FBM,Lonza)。在一些实施例中，所述培养基可以包括额外的成分或试剂，例如，转化生长因子(TGF)-β。
在培养基中FMOD蛋白质或肽的浓度的例子可以是，例如，约10nM，约20nM，约50nM，约100nM，约200nM(例如220nM)，约500nM，约1000nM，约2μM，约5μM，约10μM，约20μM，约50μM，约100μM，约200μM或约500μM。
本文所使用的术语“足够时间”意思是足够长的一段时间由本文公开的培养基重新编程哺乳动物细胞。在一些实施例中，术语“足够时间”范围从数小时到约180天，例如，从8小时到约12小时，从约8小时到约24小时，从约8小时到约2天，从约8小时到约7天，从约8小时到约14天，从约8小时到约21天，从约8小时到约30天，从约8小时到约45天，从约8小时到约60天，从约8小时到约90天，从约8小时到约120天，从约8小时到约150天或从约8小时到约180天。
在一些实施例中，术语“足够时间”范围从1天到约180天，例如，从约1天到约2天，从约1天到约7天，从约1天到约14天，从约1天到约21天，从约1天到约30天，从约1天到约45天，从约1天到约60天，从约1天到约90天，从约1天到约120天，从约1天到约150天，或从约1天到约180天。
在一些实施例中，术语“足够时间”范围从2天到约180天，例如，从约2天到约7天，从约2天到约14天，从约2天到约21天，从约2天到约30天，从约2天到约45天，从约2天到约60天，从约2天到约90天，从约2天到约120天，从约2天到约150天，或从约2天到约180天。
在一些实施例中，术语“足够时间”范围从7天到约180天，例如，从约7天到约14天，从约7天到约21天，从约7天到约30天，从约7天到约45天，从约7天到约60天，从约7天到约90天，从约7天到约120天，从约7天到约150天，或从约7天到约180天。
在一些实施例中，术语“足够时间”范围从14天到约180天，例如，从约14天到约21天，从约14天到约30天，从约14天到约45天，从约14天到约60天，从约14天到约90天，从约14天到约120天，从约14天到约150天，或从约14天到约180天。
在一些实施例中，术语“足够时间”范围从21天到约180天，例如，从约21天到约30天，从约21天到约45天，从约21天到约60天，从约21天到约90天，从约21天到约120天，从约21天到约150天，或从约21天到约180天。
在一些实施例中，术语“足够时间”范围从30天到约180天，例如，从约30天到约45天，从约30天到约60天，从约30天到约90天，从约30天到约120天，从约30天到约150天，或从约30天到约180天。
在一些实施例中，术语“足够时间”范围从45天到约180天，例如，从约45天到约60天，从约45天到约90天，从约45天到约120天，从约45天到约150天，或从约45天到约180天。
在一些实施例中，术语“足够时间”范围从60天到约180天，例如，从约60天到约90天，从约60天到约120天，从约60天到约150天，或从约60天到约180天。
在一些实施例中，术语“足够时间”范围从90天到约180天，例如，从约90天到约120天，从约90天到约150天，或从约90天到约180天。
在一些实施例中，术语“足够时间”范围从120天到约180天，例如，从约12天到约150天，或从约60天到约180天。
在一些实施例中，本文提供的方法进一步包括有规律地用新鲜培养基更换培养基。术语“有规律地”意思是每小时一次、每两小时一次、一天四次、一天两次、每天一次、每两天一次、每两周一次，每周一次、每两个月一次、或每月一次更换培养基。
本发明的另一方面，它提供了一种本文公开的PSCL细胞或无性系的上清。所述上清包括本发明的培养基和生长因子(growth factors)和/或由本文提供的PSCL细胞或无性系分泌的转录因子(transcriptional factors)。本文公开的上清对治疗或减轻紊乱是有效的，就像本文公开的PSCL细胞或无性系。在一些实施例中，上清能形成一种组合物(可选择地和载体)。所述组合物可以被应用到哺乳动物受试者用于治疗或减轻紊乱。在一些实施例中，所述组合物可以是化妆组合物或药用组合物。
多能干细胞样细胞或无性系
本文所使用的术语PSCL细胞或无性系意思是细胞，该细胞不是多能细胞但至少具有PSC特征之一。本文公开的PSCL细胞或无性系有能力在组织的生理环境中分化成想要得到的组织细胞。
PSC的特征或属性在本领域是众所周知的，PSC的一些特征被描述如下。PSC的公认的特征包括它的在适当的条件下分化成不同组织细胞的能力。PSC的其它属性包括，例如，表达转录调控因子，例如Oct-4、Sox2或Nanog或抗原，例如SSEA-4、TRA-1-60或TRA-1-81和高效表达碱性磷酸酶(ALP)。
在一些实施例中，本文公开的PSCL细胞或无性系具有多能干细胞的所有属性。在这些实施例中，所述PSCL细胞或克隆据推测是所述PSC。
在一些实施例中，本文公开的PSCL细胞或克隆具有多能干细胞的属性中的一个或多个即使不是全部。在这些实施例中，本文公开的所述PSCL细胞或无性系并不等同于PSC。
这些转录调控因子或抗原，在例如免疫荧光染色中，可以容易地由针对这些调控因子或抗原的抗体识别。
本文所使用的术语PSC也包括多能干细胞。
使用的方法
所述PSCL细胞或无性系可以被用于医药，就像用于治疗或减轻哺乳动物(例如，人类或动物)中的紊乱的PSC。通常，该方法包括给予具有紊乱的受试者PSCL细胞或无性系以便治疗或减轻紊乱。使用多能干细胞治疗紊乱的方法在本领域中已被广泛建立和熟知，因为它将很类似于用于胚胎干细胞的协议(protocols)(参见，例如Sun,et al.,Cell Cycle9:5,880-885(2010))。尽管还没有被认可的产品，但是有许多潜在的应用如移植、基因修复和用于多种基因性疾病的细胞取代治疗(参见，例如Gunaseelie,et al.,Curr Med Chem.；17(8):759–766(2010))。
紊乱可以为任意紊乱，这些紊乱能够通过多能干细胞被治疗或减轻。在一些实施例中，紊乱可以为退化性疾病，例如神经组织退化的紊乱或心脏退化性疾病。
在一些实施例中，所述紊乱可以是中枢神经系统(CNS)疾病，心血管病、血液病、克罗恩病、骨疾病、肌病、脱发、癌症、不孕症或软骨疾病，例如腺苷脱氨酶严重复合型免疫缺乏症(adenosine deaminase deficiency-related severe combined immunodeficiency)(ADA-SCID)、舒-戴二氏综合症(Shwachman-Bodian-Diamond syndrome)(SBDS)，III型戈谢(Gaucher)病(GD)、假肥大型肌营养不良症(Duchenne)(DMD)和贝克(Becher)型肌肉萎缩症(BMD)、帕金森(Parkinson)病(PD)、亨廷顿(Huntington)病(HD)、青少年糖尿病(juvenile-onset)、1型糖尿病(JDM)、唐氏(Down)综合症(DS)/三体性21、莱施-奈恩(Lesch-Nyhan)综合症的携带状态、阿兹海默症或缺血性心脏病(参见例如,Gunaseelie,et al.,Curr MedChem.；17(8):759–766(2010))。
在一些实施例中，所述紊乱可以为视网膜疾病。
在一些实施例中，所述紊乱可以是对组织的创伤和损害。这样的组织的例子可以是皮肤、肌肉、软骨、筋、末梢神经、脊髓、血管或骨头。创伤的例子可以是由身体冲击遭受的创伤或由医学中的手术造成的创伤，例如在治疗癌症中组织的除去等。
在一些实施例中，所述紊乱可以是骨骼紊乱。
在一些实施例中，所述紊乱可以是器官疾病。
本说明书中提到的“多能干细胞”均为非人类胚胎干细胞。
实施例
下面的例子阐述，而不是限制本发明。
对暴露于蛋白质试剂之后iPS细胞的诱发和它的肽衍生物(例子1-15)的研究
说明
体细胞的直接重新编程提供了一种产生患者-或疾病-特定多能干细胞(patient-or disease-specific pluripotent stem cells)的可能。最近，由Yamanaka和同事的开创性工作确认了核心转录因子，当过表达时，核心转录因子能够重新编程体细胞到多能性状态(Takahashi,K.&Yamanaka,S.Cell 126,663-676(2006))。通过所述因子OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC或针对因子的不同的一组(a different set of for factors)(OCT4、SOX2、NANOG和LIN-28)的异位表达重新编程小鼠和人类的体细胞到被诱导的多能干(iPS)细胞现在是可能的(Okita,K.,et al.,Nature 448,313-317(2007)；Takahashi,K.,et al.,NatProtoc 2,3081-3089(2007)；Maherali,N.,et al.Cell Stem Cell 1,55-70(2007)；Wernig,M.,et al.,Nature 448,318-324(2007)；Yu,J.,et al.,Science 318,1917-1920(2007)；Park,I.H.,et al.,Nature 451,141-146(2008)；和Lowry,W.E.,et al.,ProcNatl Acad Sci U S A 105,2883-2888(2008)。人类iPS细胞在基因表达中很类似于胚胎干细胞(ES)，具有多能性和后生状态(epigenetic states)，并对再生医药和在体外疾病建模具有较大的潜力。然而，将小瓶转基因(vial transgenes)整合到体细胞基因组，尤其是致癌基因，例如c-MYC和KLF，限制了iPS细胞的实用。确实，在嵌合子小鼠中，c-Myc逆转录酶病毒的再活化促进来源于iPS细胞的肿瘤的形成(Okita,K.,et al.,Nature 448,313-317(2007)；和Nakagawa,M.,et al.,Nat Biotechnol 26,101-106(2008))。通过优化重新编程方法，用一些取代一些转录因子的小分子化学物质重新编程小鼠和人类的体细胞现在是可能的。(Nakagawa,M.,et al.,Nat Biotechnol 26,101-106(2008)；Lowry,W.E.&Plath,K.,Nat Biotechnol 26,1246-1248(2008)；Huangfu,D.,et al.,Nat Biotechnol 26,1269-1275(2008)；Huangfu,D.,et al.,Nat Biotechnol 26,795-797(2008)；和Maherali,N.,etal.,Cell Stem Cell 3,340-345(2008))。然而，至少一些转录因子，例如OCT4，不得不被整合(Nakagawa,M.,et al.,Nat Biotechnol 26,101-106(2008)；Lowry,W.E.&Plath,K.,NatBiotechnol 26,1246-1248(2008)；Huangfu,D.,et al.,Nat Biotechnol 26,1269-1275(2008)；Huangfu,D.,et al.,Nat Biotechnol 26,795-797(2008)；和Maherali,N.,etal.,Cell Stem Cell 3,340-345(2008))。因此，针对iPS的应用，安全问题仍然存在。另外，转基因过程借助大量的确认和表征iPS每个方法的选择(Takahashi,K.&Yamanaka,S.,Cell126,663-676(2006)；Lowry,W.E.&Plath,K.,Nat Biotechnol 26,1246-1248(2008)；Huangfu,D.,et al.,Nat Biotechnol 26,1269-1275(2008)；Huangfu,D.,et al.,NatBiotechnol 26,795-797(2008)；Maherali,N.,et al.,Cell Stem Cell 3,340-345(2008)；和Takahashi,K.,et al.,Cell 131,861-872(2007)),转基因过程是非常耗时间的。对临床实践，产生iPS的新方法是更安全和更有效，该方法在下面的例子中被建立。
纤维调节素(FMOD)是小分子富含亮氨酸的间质蛋白多糖(member of smallleucine rich proteoglycan)(SLRP)中的成员之一。FMOD是具有表达特征的细胞溶质分泌蛋白(cytosolic secreted protein)，其主要被限制在结缔组织和富含胶原蛋白的组织，如软骨、骨头、筋和皮肤(Heinrich,W.,et al.,FEBS Lett 16,63-67(1971)；和Heinegard,D.,et al.,Pathol Immunopathol Res 1988；7(1-2):27-31 7,27-31(1988))。纤维调节素被涉及到原纤维形成、细胞粘着和细胞因子活性调节(cytokine activity modulation)中(Hildebrand,A.,et al.,Biochem J 302,527-534(1994)；Zheng,Z.,et al.,WoundRepair and Regeneration 16,A28-A28(2008)；Zheng,Z.,et al.,J Am Coll Surgeons211,S127-S127(2010)；和Zheng,Z.,et al.,Journal of Investigative Dermatology131,769-778(2011))。先前的研究已经表明FMOD可以既与转化生长因子(TGF)-β亚型又和胶原蛋白结合以便调节信号传导和细胞外基质的分布(Hildebrand,A.,et al.,Biochem J302,527-534(1994)；Zheng,Z.,et al.,Wound Repair and Regeneration 16,A28-A28(2008)；Zheng,Z.,et al.,J Am Coll Surgeons 211,S127-S127(2010)；Hedbom,E.&Heinegard,D.,J Biol Chem 1989Apr 25；264(12):6898-905 264,6898-6905(1989)；和Kalamajski,S.&Oldberg,A.,Journal of Biological Chemistry 282,26740-26745(2007))。
最近，FMOD被发现是对多能干细胞的合适环境(niche environment)的关键成分(Bi,Y.,et al.,Nat Med 13,1219-1227(2007))。有趣的是，我们发现暴露于FMOD之后，大鼠成纤维细胞细胞系大鼠-2形成了具有胚胎干细胞形貌的无性系(实施例1，图1)，这表明FMOD有诱导iPS细胞的潜力。
实施例1
在这个实施例中，暴露于FMOD之后，大鼠-2成纤维细胞形成了具有胚胎干细胞(ES)形貌的无性系。图1a显示的是未经过FMOD处理的大鼠-2，图1b大鼠-2被暴露于200nMFMOD一周的结果。
实施例2-3
在例子2-3中，两种人类细胞包括人类新生儿包皮皮肤成纤维细胞BJ细胞(ATCC,CRL-2522)和正常人类成人皮肤成纤维细胞NHDF细胞(Lonza Group Ltd.)被用于核实这种现象。暴露于FMOD三到四周之后，这三种细胞都能形成了ES样的无性系(图2-3)。
图2a-2c显示的是人类新生儿包皮皮肤成纤维细胞BJ细胞(a)被播种在24孔板中，且在转移到饲养细胞上之前用200nM FMOD w/o血清处理三周(用6000拉德(rads)的γ辐照处理小鼠胚胎成纤维细胞，GlobalStem)的实验结果。每天更换培养基，ES样无性系用针对iPS表征的碱性磷酸酶(AP)染色(c)被观察(b)。每20,000起始被播种的BJ细胞，形成6-8个无性系。标尺：200μm。
图3显示的是人类正常成人皮肤成纤维细胞NHDF细胞被播种在24孔板中，并在转移到饲养细胞上之前用无血清的200nM FMOD处理四周的实验结果。每天更换培养基，ES样无性系被观察，每50，000起始被播种的BJ细胞，形成4-10个无性系。
实施例4
为进一步证实，在暴露于FMOD之前，用包括编码与Nanog促进剂[BJ(Nanog-EGFP)细胞]结合的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein)(EGFP)的基因的慢病毒，预转染BJ细胞。经过三周的FMOD处理之后，BJ(Nanog-EGFP)细胞也形成了具有EGFP表达的ES样无性系，它表明Nanog基因在这些FMOD诱导的iPS(FiPS)细胞中被强烈地表达，正像由Yamanaka或Thomson因子的异位表达诱导的其它iPS(Takahashi,K.&Yamanaka,S.,Cell 126,663-676(2006)；Yu,J.,et al.,Science 318,1917-1920(2007)；和Takahashi,K.,et al.,Cell 131,861-872(2007))。
图4显示的是在暴露于FMOD之前，用包括编码与Nanog促进剂[BJ(Nanog-EGFP)细胞]结合的EGFP的基因的慢病毒，预转染人类新生儿包皮皮肤成纤维细胞BJ细胞的实验结果。在转移到饲养细胞上之前，每天更换培养基。ES样无性系用EGFP表达被观察。
实施例5和6
通过免疫荧光染色，用针对人类iPS细胞的核心转录调控因子(NANOG和OCT4SOX2)的抗体和在所有人类多能细胞(SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)的细胞表面上被表达的抗原，从BJ细胞(BJ-FiPS)诱导出的FiPS细胞进一步被识别(图5)。RT-PCR靶向人类iPS细胞的关键iPS标记也作为第二证据被执行(图6)。
图5显示的是通过免疫荧光染色，用针对人类iPS细胞的核心转录调控因子(NANOG和OCT4SOX2)的抗体和在所有人类多能细胞(SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)的细胞表面上被表达的抗原，BJ-FiPS细胞进一步被识别。标尺：200μm。
图6显示的是BJ-FiPS细胞进一步被RT-PCR识别。未处理的BJ细胞被用作对照。用于iPS表征(SOX2、OCT4、NANOG和hTERT)、外胚层标记(KRT-18和巢蛋白)、内胚层标记(AFP和GATA-4)，中胚层标记(FLT-1,BMP-4和VE-Cadherin)的引物被用做针对β-肌动蛋白的对照引物。
实施例7和8
在悬浮培养中，使用AggreWell 800协议(StemCell)，BJ-FiPS形成了胚胎体(EBs)(图7)。再者，免疫染色显示了BJ-FiPS EBs一贯地表达iPS标记，例如NANOG、OCT4和SOX2以及外胚层和中胚层标记(图8)，它表明了BJ-FiPS细胞的多能性。
图7显示的是在悬浮培养中，使用AggreWell 800协议表达，BJ-FiPS形成了胚胎体(EBs)。标尺：200μm。
图8a-8c显示的是经过14天悬浮培养后，免疫染色显示了BJ-FiPS EBs用iPS标记(a)以及和外胚层(b)和中胚层标记(c)表达。
实施例9
为进一步证明BJ-FiPS细胞的多能性，体外分化试验被采用。首先，BJ-FiPS细胞被转移入含有10％胎牛血清(FBS)，50g/ml抗坏血酸，10mMβ-甘油磷酸酯和10-8M地塞米松的α-MEM培养基中21天。每隔三天培养基被更换。茜素红(Alizarin Red S)染色显示BJ-FiPS细胞能够分化成造骨细胞(中胚层细胞)(图9)。
图9显示的是BJ-FiPS细胞在体外分化成造骨细胞。骨头结节被茜素红染色。
实施例10-13
体外分化中的类似物由从NHDF细胞(NDHF-FiPS)诱导出的FiPS细胞证实(图10)。再者，当FiPS细胞被注入到SCID-小鼠睾丸中，在体内，该细胞分化成骨组织(图11)。另外，FiPS细胞能够分化成脂肪细胞和心肌细胞，两者都是中胚层细胞(图12-13)。
图10显示的是在体外，NHDF-FiPS细胞分化成造骨细胞。骨头结节被茜素红染色。
图11显示的是在SCID-小鼠睾丸中，FiPS细胞分化成骨组织。
图12显示的是FiPS细胞被转移入脂肪生成培养基(Lonza)中21天。培养基每隔三天被更换。油红染色(Oil Red)显示了BJ-iPS细胞可以在体外分化成脂肪细胞。
图13a和图13b显示的是BJ-FiPS细胞被转移入DMEM/F12(1:1)培养基中，四天悬浮培养以便形成EBs，DMEM/F12(1:1)培养基由20％FBS、1mM谷氨酸盐、0.1mM非必需氨基酸和0.1mM 2-巯基乙醇(EB20培养基)供给。接着，EBs细胞被转移到明胶涂层板上培养十天以便体外心肌细胞分化。心肌细胞由平滑肌肌动蛋白(SMA)(a)的免疫染色、心肌肌钙蛋白(cTNT)和转录因子NKX2.5(b)表征。细胞核是用DAPI被计数染色，标尺：100μm。
实施例14-15
实施例14和15显示的是不仅iPS细胞能够分化成多个中胚层组织，起源于成纤维细胞的FiPS细胞也能分化成外胚层(图14)和内胚层细胞(图15)。
图14a和图14b显示的是BJ-FiPS EBS在基因敲除(Konckout)DMEM培养基中被悬浮培养8天，基因敲除DMEM培养基由10％基因敲除血清、2mM谷氨酸盐、10μM全反式维甲酸(RA)和100nM人类音速克刺猬(human sonic hedgehog)(Shh)的N-末端活性片段供给。RA每天被重新供给，且每隔两天整个悬浮培养基被更换。之后，被诱导的EBs被转移到具有DMEM/F12(1:1)培养基的多聚-鸟氨酸/纤维蛋白连接素涂层板上，用于神经细胞分化，DMEM/F12(1:1)培养基由N2,GDNF,BDNF,CNTF,B27和2％FBS供给。三天后，BJ-FiPS分化成神经细胞(外胚层细胞)，该神经细胞通过βIII-微管蛋白(a)的免疫染色和谷氨酸盐受体1(GRIA1)(b)表征。细胞核是用DAPI被计数染色，标尺：100μm。
图15a和图15b显示的是在RPMI 1640培养基中，暴露于100ng/ml重组活化素A后，饲养细胞上的BJ-FiPS细胞生长向内胚层细胞分化四天，由α-胎蛋白(AFP)(a)的免疫染色表征，该培养基由2％FBS和2mM谷氨酸盐供给。之后，在RPMI 1640培养基中，BJ_FiPS培养另外八天，保存于胰腺世系细胞(pancrease lineage cell)的体外分化中，由胰腺/十二指肠同源框1(PDX1)(b)表征，RPMI 1640培养基由2％FBS和2mM谷氨酸盐供给，没有活化素A，。细胞核是用DAPI被计数染色，标尺：100μm。
因此，FiPS细胞表现出多能性是清晰的。另外，体内试验表明FiPS细胞将不会诱导肿瘤形成(图11)。因此，用暴露于FMOD诱导iPS细胞和它的肽衍生物，将是更安全和更好的直接重新编程体细胞的方法。
尽管上述发明通过说明和用于理解清晰目的的例子被相当详细地描述了，应该理解为，对本领域技术人员来说，某些适应性修改是路线优化问题，在不脱离本发明精神，或权利要求的范围的前提下，可被实施。

Claims (5)

1.一种组合物，所述组合物包括由一种方法制备的多能干细胞样无性系，所述方法包括：
用无血清细胞培养基体外处理哺乳动物细胞从一天到一个月的一段时间，和
有规律地更换所述无血清细胞培养基直至多能干细胞样(PSCL)无性系形成；
其中，所述无血清细胞培养基包括纤维调节素(FMOD)，
其中，所述无血清细胞培养基对重新编程细胞以便形成PSCL无性系是有效的，
其中，所述PSCL无性系，在免疫荧光染色中，由针对人类Oct4A、Nanog、TRA-1-60(S)或TRA-1-181的抗体识别，
其中，所述无血清细胞培养基包含不含血清的200nM FMOD至800nM FMOD，
其中，所述被重新编程的哺乳动物细胞是人类正常成人皮肤成纤维细胞NHDF细胞，
其中，所述多能干细胞样无性系是ES样无性系，和
其中，所述多能干细胞不是人胚胎干细胞。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述FMOD是FMOD蛋白质或肽。
3.根据权利要求1或2所述的组合物用于分化成选自由以下组成的群组的细胞的用途：
骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和神经细胞。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述细胞属于选自由以下组成的群组的组织：中枢神经系统(CNS)组织、骨和视网膜。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述细胞属于末梢神经或脊髓。
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