CN106370859A

CN106370859A - 一种检测犬cTnI的试纸条及其制备方法

Info

Publication number: CN106370859A
Application number: CN201610700082.XA
Authority: CN
Inventors: 林斯
Original assignee: BEIJING ELCOTEQ BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING ELCOTEQ BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-08-22
Filing date: 2016-08-22
Publication date: 2017-02-01

Abstract

本发明公开了一种检测犬cTnI的试纸条，包括：反应膜，其两端各设有一连接段，两连接段中间为检测段，检测段表面设有检测带，检测带上喷涂有包被用鼠抗犬cTnI单克隆抗体；样本垫，其一端设有连接段，样本垫的连接段覆盖并固定于硝酸纤维素膜的一连接段上，样本垫上喷涂有标记物，标记物中含有乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体；吸收垫，其一端设有连接段，吸收垫的连接段覆盖并固定于硝酸纤维素膜的另一连接段上。本发明提供的检测犬cTnI的试纸条，操作方便、快捷且灵敏度高。

Description

一种检测犬cTnI的试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于宠物疾病临床诊断领域，具体涉及一种用免疫层析技术检测犬cTnI的试纸条及其制备方法。

背景技术

肌钙蛋白复合物由3个亚基：心肌肌钙蛋白T（cTnT）、心肌肌钙蛋白I（cTn I）和肌钙蛋白C（TnC）组成，它们帮助调节细胞的兴奋收缩偶联。cTnI是cTnC和钙离子结合前防止肌动蛋白与肌球蛋白相互作用的抑制元件。肌小节损伤导致cTnI和肌动蛋白脱离，随后细胞膜破裂cTnI进入血液循环。因此，在血清或血浆中检测到高水平的cTnI，被认为是心肌损伤和坏死的一个高度敏感和特异性的指标。cTnI在哺乳动物中密切同源，这也使得在犬猫上可以使用为人类开发的免疫测定方法来进行精确的测定。

cTnI的免疫测定分析已经被证实可应用于犬。心肌肌钙蛋白可结合其他诊断方法，为脓毒血症和胃扩张扭转的预后提供有用的信息。急性心律失常或心收缩功能不全的犬，其cTnI水平极度升高，这与心肌炎时的表现相符，cTnI水平可以作为监测该疾病治疗效果的一个工具。Oyama等评估了269只有和无心脏病的cTnI。他们发现，与健康犬相比，心肌病犬、二尖瓣病变犬和主动脉下狭窄犬，其cTnI水平都显著增高。

在市场上，用于诊断犬类cTnI的试剂非常少，而且大多是酶联免疫试剂，这种试剂不稳定且检测效率低，在实际应用中还同时存在检测时间过长、重复性差等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：现有技术中用于检测犬类cTnI的试剂少，且存在不稳定、检测效率低、检测时间长和重复性差的缺点。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种方便、快捷且高灵敏度的检测犬cTnI的试纸条和及其制备方法。

本发明提供的一种检测犬cTnI的试纸条，包括：

反应膜，其两端各设有一连接段，两连接段中间为检测段，所述检测段表面设有检测带，所述检测带上喷涂有包被用鼠抗犬cTnI单克隆抗体；

样本垫，其一端设有连接段，所述样本垫的连接段覆盖并固定于所述硝酸纤维素膜的一连接段上，样本垫上喷涂有标记物，标记物中含有乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体；

吸收垫，其一端设有连接段，所述吸收垫的连接段覆盖并固定于所述硝酸纤维素膜的另一连接段上。

作为优选技术方案，所述反应膜的检测段还设有质控带，所述质控带位于所述检测段上靠近所述吸收垫的一侧，而检测带位于所述检测段上靠近所述样本垫的一侧；

其中，所述质控带上覆有特异性抗体；所述标记物中还含有乳胶荧光微球标记的与所述特异性抗体结合的抗原。

作为优选技术方案，所述抗原为兔IgG，所述特异性抗体为羊抗兔IgG。

作为优选技术方案，所述标记物中乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体与乳胶荧光微球标记的所述抗原的体积比为1:1~3:1。

作为优选技术方案，所述标记物中乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体与所述乳胶荧光微球标记的兔IgG的体积比为2:1。

作为优选技术方案，所述样本垫为玻璃纤维素膜，所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述吸收垫为吸水纸。

作为优选技术方案，上述的检测犬cTnI的试纸条，还包括底板，所述反应膜、样本垫和吸收垫均固定于所述底板上。

本发明提供上述的检测犬cTnI的试纸条的制备方法，包括如下步骤：

1）包被液制备：取包被用鼠抗犬cTnI单克隆抗体加入磷酸盐缓冲液中，制成检测带包被液；取所述特异性抗体加入磷酸盐缓冲液中，制成质控带包被液；

2）反应膜的处理：反应膜的检测段上标记检测带和质控带，在检测带上喷覆检测带包被液，在质控带上喷覆质控带包被液，然后干燥；

3）样本垫的预处理：将样本垫浸泡于样本垫处理液中，然后干燥（预处理能够降低背景信号，提高有效光信号，同时减小变异。）；

4）乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体：乳胶荧光微球的分散液，离心，弃上清液后，用标记缓冲液复溶，并且同时加入碳二亚胺、标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应，随后加入赖氨酸，搅拌，然后离心，弃上清液，最后用标记稀释液复溶；

5）乳胶荧光微球标记的所述抗原：取乳胶荧光微球的分散液，离心，弃上清液后用标记缓冲液复溶，并且同时加入碳二亚胺、所述抗原、N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应，随后加入赖氨酸，搅拌，然后离心，弃上清液，最后用标记稀释液复溶；

6）取步骤4）得到的混合液与步骤5）得到的混合液混合，得到标记物混合液，然后喷覆在步骤3）得到的预处理后的样本垫的上表面，干燥；

7）步骤6）得到的样本垫的连接段的下表面覆盖并且固定于所述反应膜的一连接段上，吸收垫的连接段覆盖并且固定于所述反应膜的另一连接段上。

作为优选技术方案，步骤3）中所述样本垫处理液的配方如下：0.99g 磷酸二氢钠，5.16g磷酸氢二钠，1g牛血清白蛋白，0.9g氯化钠，0.224g CTAC，0.05g叠氮钠，溶于100mL水中。

作为优选技术方案，步骤4）和步骤5）中，所述标记缓冲液的配方为：碳酸钠4.33g、碳酸氢钠2.96g，溶于1000mL水中；所述标记稀释液的配方为：柠檬酸三钠7.33g、柠檬酸4.44g、氢氧化钠1g，溶于1000mL水中。

本发明提供的检测犬cTnI的试纸条，操作方便、快捷且灵敏度高。

附图说明

图1：本发明检测犬cTnI的干式荧光免疫层析试纸条纵向截面结构示意图；

图2：本发明检测犬cTnI的干式荧光免疫层析试纸条俯视图；

图3：犬不同cTnI浓度的检测试纸条在紫外光照射下所拍照片，从左到右依次为0ng/mL、0.05ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、20ng/mL。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

如图1和图2所示，本发明提供的检测犬cTnI的试纸条，包括：

反应膜2（硝酸纤维素膜），其两端各设有一连接段（如图所示第一连接段20、第二连接段22），两连接段中间为检测段21，检测段21表面设有检测带5，检测带5上喷涂有包被用鼠抗犬cTnI单克隆抗体；样本垫1（玻璃纤维素膜），其一端设有连接段10，样本垫的连接段10覆盖并固定于反应膜的第一连接段20上；样本垫1上喷涂有标记物8，标记物8中含有乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体，具体在一实施方式中，是在靠近连接段10附近（距连接段2mm，标记物沿反应膜长度方向的长度为5mm）喷涂标记物8，乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体。

吸收垫3（吸水纸），其一端设有连接段30，吸收垫的连接段30覆盖并固定于反应膜2的第二连接段22上；

底板4，反应膜2、样本垫1和吸收垫3均固定于底板上。

在实际应用中，反应膜的检测段还设有质控带7，质控带7位于检测段21上靠近吸收垫3的一侧，而检测带5位于检测段21上靠近样本垫1的一侧；

其中，质控带7上覆有一特异性抗体层60；乳胶荧光微球层中还含有乳胶荧光微球标记的与交联特异性抗体结合的抗原。考虑到检测灵敏性，在本发明的优选实施方式中，抗原为兔IgG，特异性抗体为羊抗兔IgG，样本垫中乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体与乳胶荧光微球标记的抗原的体积比为1:1~3:1。最优选地，样本垫中乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体与乳胶荧光微球标记的兔IgG的体积比为2:1。

考虑到，检测时的层析效果、检测时的灵敏度以及使用时的方便性，本发明的试纸条为矩形，其各部件的尺寸设置如下：

样品垫1，长度为24mm，样品垫的连接段10长度为3mm;

反应膜2，长度为25mm，第一连接段20长度为3mm，第二连接段22长度为2mm；检测带5第一连接段20的距离为7mm，质控带7距第一连接段20的距离为15mm，检测带5和质控带7垂直于硝酸纤维素膜的长度方向，检测带5和质控带7沿反应膜的长度方向的宽度为0.4mm；

吸收垫3，长度为26mm，吸收垫的连接段长度为2mm；

底板4为PVC板，其长度为70mm。

样品垫1、反应膜2、吸收垫3和底板4的宽度均为4mm。

实施例1：检测犬cTnI的干式荧光免疫层析试纸条的制备

包被缓冲液：称取磷酸二氢钠0.99g、磷酸氢二钠5.16g，加纯化水定容至1000mL。

将包被用鼠抗犬cTnI单克隆抗体用包被缓冲液稀释至2mg/mL，作为试纸条检测带包被液，同时将羊抗兔IgG稀释至2mg/mL，作为质控带包被液。通过划膜喷金仪，将检测带包被液以0.6μL/cm划至如图1和图2所示的检测带处，随后将质控带包被液以0.6μL/cm划至如图1和图2所示的质控带处，划好后移入湿度<35%的干燥间进行干燥处理2小时。

标记物所需溶液：

标记缓冲液（CB溶液）：称取碳酸钠4.33g、碳酸氢钠2.96g，加纯化水定容至1000mL。

标记稀释液（LM溶液）：称取柠檬酸三钠7.33g、柠檬酸4.44g、氢氧化钠1g，加纯化水定容至1000mL。

样本垫处理液：称取0.99g 磷酸二氢钠，5.16g磷酸氢二钠，1g牛血清白蛋白，0.9g氯化钠，0.224g CTAC，0.05g叠氮钠，加纯化水定容至100mL。

样本垫的预处理：将玻璃纤维素膜浸泡于样本垫处理液中2小时，随后取出移入湿度<35%的干燥间进行干燥处理8小时备用。

进一步的，标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体或兔IgG的氨基端与乳胶荧光微球（羧基乳胶微球）的羧基端交联步骤：

取浓度为0.01g/mL的乳胶荧光微球10mL（167nm乳胶荧光微球），离心30分钟，转速为10000 r/min，弃上清液后用0.05mol/L的CB溶液10mL复溶，并且同时加入10mg碳二亚胺（EDC）、2mg标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体、10mg N-羟基琥珀酰亚安（NHS），在室温下搅拌1小时，随后加入5mg 赖氨酸后室温下搅拌15分钟，然后将其在10000 r/min的条件下离心15分钟，弃上清液，最后用0.06 mol/L的LM溶液复溶即可。

取浓度为0.01g/mL的乳胶荧光微球5mL，离心30分钟，转速为10000 r/min，弃上清液后用0.05mol/L的CB溶液5mL复溶，并且同时加入5mg 碳二亚胺（EDC）、1mg兔IgG、5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），在室温下搅拌1小时，随后加入2.5mg赖氨酸后室温下搅拌15分钟，然后将其在10000 r/min的条件下离心15分钟，弃上清液，最后用10mL的0.06 mol/L的LM溶液复溶即可。

标记完成后将乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体与乳胶荧光微球标记的兔IgG以2:1的体积比混合，通过划膜喷金仪，将混合溶液以15μL/cm喷于样品垫1玻璃纤维素膜上，喷好后移入湿度<35%的干燥间进行干燥处理2小时。

试纸条中间品的组装：将干燥好的玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸收垫依次贴于PVC底板上，如图1所示。

裁剪：将试纸条中间品按照图2所示尺寸裁剪成单个试纸条。

装壳：将试纸条装到塑料卡底壳中，盖上塑料卡上壳，压紧，随后将其装入铝箔袋中，并加入独立包装的干燥剂后封口即可。

定量检测方法：将试纸条、待测校准品、样本平衡至室温（20-25℃），拆开试纸条的铝箔袋后将其放置在平整的表面上，取50μL校准品/样本加入试纸条样本孔（滴加于样品垫1上，样本由于毛细渗透作用向上层析，若样本中含有目的抗原，则会结合标记物中的抗体一起层析，然后在检测带会被固相抗体抓住。从而组成固相抗体-抗原-检测抗体复合物，就可以判断结果），15分钟后用荧光免疫层析分析仪检测即可。

1、用以上方法绘制标准曲线，结果如下：

表一：不同犬cTnI的浓度所测得的T/C的值（图片见图3）

单位（ng/mL）	0	0.05	0.2	1	5	20
							1	0.005	0.016	0.045	0.215	1.059	3.215
2	0.004	0.015	0.050	0.226	1.159	3.160
							3	0.005	0.017	0.055	0.195	1.201	3.048
4	0.003	0.020	0.049	0.215	1.148	3.521
							5	0.004	0.016	0.052	0.227	1.184	3.254
平均值	0.0042	0.0168	0.0502	0.2156	1.1502	3.2396
							标准差=	0.0008	0.0019	0.0037	0.0129	0.0551	0.1754
变异系数=	19.92%	11.45%	7.37%	5.97%	4.79%	5.41%

将理论浓度与所测得的T/C值进行四参数Logistic曲线拟合，方程y=（A-D）/[1+(X/C)B+D]，其中，A=5.92726, B=-1.16615，C=17.08392，D=0.00979，将此曲线录入荧光免疫层析分析仪中。

2、犬cTnI的干式荧光免疫层析试纸条重复性和准确性

配制0.2ng/mL和5ng/mL的犬cTnI的标准品，采用本试纸条进行检测，各浓度分别检测10次，分别计算测定均值和标准差。计算变异系数作为重复性检测，计算相对偏差作为准确性检测，结果如表二：

表二，犬cTnI的干式荧光免疫层析试纸条重复性和准确性

序号	标准值 0.2ng/mL	标准值 5ng/mL
			1	0.21	4.89
2	0.19	5.14
			3	0.21	5.43
4	0.19	5.43
			5	0.22	5.04
6	0.20	4.52
			7	0.19	4.97
8	0.18	5.09
			9	0.22	5.41
10	0.20	5.39
			平均值=	0.201	5.131
标准差=	0.0137	0.2965
			变异系数=	6.82%	5.78%
相对偏差=	0.50%	2.62%

3、临床比对：选择30只经临床诊断为健康的犬作为对照组，选择15只经诊断为二尖瓣病变的犬作为实验组，结果如表三所示。

表三，健康犬与二尖瓣病变犬的cTnI结果：

从上表中可以看出，30例健康犬的cTnI的测值分布在0.03-0.08ng/mL（平均值为0.05ng/mL），如果将正常范围定为0.03-0.08ng/mL，则15例二尖瓣病变检出14例（平均值0.42 ng/mL）。

由此可以看出本试纸条能够很好的诊断病变犬，且具有其他技术所不具有的检测效率，即重复性好，检测所需时间少。

实施例2

本实施例的检测犬cTnI的干式荧光免疫层析试纸条的制备方法与实施例1相同，区别仅在于乳胶荧光微球层中微球的体积比例：标记完成后将乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体与乳胶荧光微球标记的兔IgG以1:1的体积比混合，通过划膜喷金仪，将混合溶液以15μL/cm喷于玻璃纤维素膜上，喷好后移入湿度<35%的干燥间进行干燥处理2小时。

对本实施例的检测犬cTnI的干式荧光免疫层析试纸条的重复性和准确性进行检测，检测方法同实施例1。结果如表四：

表四

序号	标准值 0.2ng/mL	标准值 5ng/mL
			1	0.17	5.11
2	0.17	4.98
			3	0.19	5.06
4	0.17	4.06
			5	0.16	5.01
6	0.17	4.60
			7	0.18	5.29
8	0.16	5.33
			9	0.20	4.36
10	0.17	4.58
			平均值=	0.174	4.838
标准差=	0.0126	0.4185
			变异系数=	7.27%	8.65%
相对偏差=	-13.00%	-3.24%

实施例3

本实施例的检测犬cTnI的干式荧光免疫层析试纸条的制备方法与实施例1相同，区别仅在于乳胶荧光微球层中微球的体积比例：标记完成后将乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体与乳胶荧光微球标记的兔IgG以3:1的体积比混合，通过划膜喷金仪，将混合溶液以15μL/cm喷于玻璃纤维素膜上，喷好后移入湿度<35%的干燥间进行干燥处理2小时。

对本实施例的检测犬cTnI的干式荧光免疫层析试纸条的重复性和准确性进行检测，检测方法同实施例1。结果如表五：

表五

序号	标准值 0.2ng/mL	标准值 5ng/mL
			1	0.21	4.40
2	0.22	5.42
			3	0.22	4.93
4	0.20	5.44
			5	0.22	5.87
6	0.19	5.20
			7	0.25	5.00
8	0.21	4.99
			9	0.19	5.08
10	0.24	5.52
			平均值=	0.215	5.185
标准差=	0.0196	0.4037
			变异系数=	9.11%	7.79%
相对偏差=	7.50%	3.70%

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种检测犬cTnI的试纸条，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的检测犬cTnI的试纸条，其特征在于，所述反应膜的检测段还设有质控带，所述质控带位于所述检测段上靠近所述吸收垫的一侧，而检测带位于所述检测段上靠近所述样本垫的一侧；

3.根据权利要求2所述的检测犬cTnI的试纸条，其特征在于，所述抗原为兔IgG，所述特异性抗体为羊抗兔IgG。

4.根据权利要求2或3所述的检测犬cTnI的试纸条，其特征在于，所述标记物中乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体与乳胶荧光微球标记的所述抗原的体积比为1:1~3:1。

5.根据权利要求4所述的检测犬cTnI的试纸条，其特征在于，所述标记物中乳胶荧光微球标记的标记用鼠抗犬cTnI单克隆抗体与所述乳胶荧光微球标记的兔IgG的体积比为2:1。

6.根据权利要求1所述的检测犬cTnI的试纸条，其特征在于，所述样本垫为玻璃纤维素膜，所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述吸收垫为吸水纸。

7.根据权利要求1所述的检测犬cTnI的试纸条，其特征在于，还包括底板，所述反应膜、样本垫和吸收垫均固定于所述底板上。

8.权利要求2~5任一项所述的检测犬cTnI的试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3）样本垫的预处理：将样本垫浸泡于样本垫处理液中，然后干燥；

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中所述样本垫处理液的配方如下：0.99g 磷酸二氢钠，5.16g磷酸氢二钠，1g牛血清白蛋白，0.9g氯化钠，0.224g CTAC，0.05g叠氮钠，溶于100mL水中。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤4）和步骤5）中，所述标记缓冲液的配方为：碳酸钠4.33g、碳酸氢钠2.96g，溶于1000mL水中；所述标记稀释液的配方为：柠檬酸三钠7.33g、柠檬酸4.44g、氢氧化钠1g，溶于1000mL水中。