CN106367508A - 一种用于鉴定杂合型类异戊二烯化合物产生菌的简并引物与应用 - Google Patents

一种用于鉴定杂合型类异戊二烯化合物产生菌的简并引物与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定杂合型类异戊二烯化合物产生菌的简并引物与应用，属于生物技术领域。本发明所提供的简并引物的序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示。同时，本发明还提供了利用简并引物鉴定杂合型类异戊二烯化合物产生菌的方法。本发明采用直接PCR的方法对杂合型类异戊二烯产生菌进行鉴定，避免了传统鉴定方法中的菌株发酵和发酵产物的纯化鉴定等过程的繁琐、费时、盲目性和易漏筛等缺点，极大地提高了工作效率，目的性更强，本发明对杂合型类异戊二烯化合物的微生物天然产物药物的发现和新型异戊烯基转移酶的挖掘具有重要意义。

Description

一种用于鉴定杂合型类异戊二烯化合物产生菌的简并引物与 应用
技术领域
本发明涉及一种用于鉴定杂合型类异戊二烯化合物产生菌的简并引物与应用，属于生物技术领域。
背景技术
类异戊二烯化合物(isoprenoids)是自然界中结构多样性最为丰富的一类化合物，其基本骨架是由异戊二烯(C5)单元组成，根据所含C5数目的不同，可分为单萜、倍半萜、三萜和四萜。类异戊二烯化合物结构的多样性决定了其生物学功能的多样性，可作为抗生素、激素、杀虫剂、杀菌剂、抗癌药物等应用于农业和医药领域。真菌和植物是类异戊二烯化合物的主要来源，近年的研究显示原核生物也可产生类异戊二烯化合物，特别是微生物天然产物药物的重要来源—放线菌，其产生的类异戊二烯化合物具有独特的结构，即杂合型类异戊二烯(hybrid isoprenoids)。杂合型类异戊二烯是指具有不同长度和复杂程度的异戊二烯单元在异戊烯基转移酶的作用下与其它化学结构(如聚酮、核糖体多肽、非核糖体多肽、吩嗪、吡咯等)通过C-N、C-C和C-O键等形成的一类结构复杂的微生物次级代谢产物，如naphterpin、furaquinocins、novobiocin和clorobiocin等。目前仅有30余种由放线菌产生的杂合型异戊二烯化合物被发现报道，但这些化合物却显示出了结构的新颖性和生物学功能的多样性。
研究表明，异戊二烯单元可赋予杂合型类异戊二烯化合物独特的生物学活性。例如furaquinocin、furanonaphthoquinone、napyradiomycin和naphterpin都具有相同的聚酮核心结构，但由于连接的异戊二烯单元数量和连接部位的不同使得这些化合物显示出了完全不同的生物学活性。对杂合型类异戊二烯化合物的生物合成机制研究显示，杂合型类异戊二烯化合物是在异戊烯基转移酶的催化作用下引入异戊二烯单元。如今还难以采用化学合成的方法大量合成杂合型类异戊二烯化合物，因此，对异戊烯基转移酶的研究不仅有助于解析杂合型类异戊二烯化合物的生物合成途径，还可能为合成具有生物活性的杂合型类异戊二烯化合物提供新的路径。
目前，杂合型类异戊二烯化合物产生菌的鉴定主要是建立在大量微生物菌株的分离和发酵产物的纯化鉴定基础之上，通常一株杂合型类异戊二烯化合物产生菌的获得需要发酵成千上万个微生物菌株，成功率远低于1％，具有耗时、费力和盲目性等缺点。另外，由于微生物体内参与杂合型类异戊二烯化合物生物合成的基因表达量低或不表达时，采用发酵和发酵产物纯化鉴定的方法不能分离出杂合型类异戊二烯化合物，从而造成杂合型类异戊二烯化合物产生菌的漏筛。
发明内容
为解决传统杂合型类异戊二烯化合物产生菌的鉴定中大量菌株的发酵和发酵产物的纯化鉴定等过程的繁琐、费时、盲目性、易漏筛的技术问题，本发明提供了一种用于鉴定杂合型类异戊二烯化合物产生菌的简并引物，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种用于鉴定杂合型类异戊二烯化合物产生菌的简并引物，该简并引物的序列为：
上游引物P1-F：5’-TCASACGACSASACSCCGGTSGA-3’；
下游引物P1-R：5’-GYGGTGCCCGAGCCGGYGCAGGGC-3’；
其中，简并碱基代码S＝G或C，B＝G或C或T，Y＝C或T。
含有所述简并引物的检测试剂盒也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述简并引物检测杂合型类异戊二烯化合物产生菌的方法，该方法是提取待检微生物的DNA，利用所述简并引物进行PCR扩增，再利用电泳检测PCR扩增产物中是否含有单一条带。
所述方法的步骤如下：
1)提取待检微生物的基因组DNA；
2)以步骤1)所得基因组DNA为模板，利用如下序列的简并引物进行PCR扩增，获得扩增产物：
上游引物P1-F：5’-TCASACGACSASACSCCGGTSGA-3’；
下游引物P1-R：5’-GYGGTGCCCGAGCCGGYGCAGGGC-3’；
其中，简并碱基代码S＝G或C，B＝G或C或T，Y＝C或T；
3)利用琼脂糖凝胶电泳检测步骤2)所得扩增产物中是否含有单一条带。
优选地，步骤2)所述PCR扩增，扩增条件为：94℃10min；94℃1min；53℃30s；72℃1min。
本发明的另一目的是提供所述简并引物在宏基因组方面的应用。
本发明所提供的简并引物是根据异戊烯基转移酶保守区设计的一对简并引物。
本发明获得的有益效果是：
本发明采用直接PCR的方法对杂合型类异戊二烯产生菌进行鉴定，避免了传统鉴定方法中的菌株发酵和发酵产物的纯化鉴定等过程的繁琐、费时、盲目性和易漏筛等缺点，极大地提高了工作效率，目的性更强，本发明对杂合型类异戊二烯化合物的微生物天然产物药物的发现和新型异戊烯基转移酶的挖掘具有重要意义。
附图说明
图1为异戊烯基转移酶蛋白序列比对结果示意图；
其中，SCO7467、TK24、Saml0654、IptA和CymD分别代表来自Streptomycescoelicolor A3(2)、Streptomyces lividans TK24、Streptomyces ambofaciensATCC2387、Streptomyces sp.neau-D50和Salinispora arenicola CNS-205的异戊烯基转移酶氨基酸序列。
图2为引物P1-F和P1-R对产生杂合型类异戊二烯化合物的微生物的PCR结果示意图；
(其中，1：DNA Marker；2-6：分别以产生杂合型类异戊二烯化合物的微生物Streptomyces coelicolor A3(2)、Streptomyces lividans TK24、Streptomycesambofaciens ATCC2387、Streptomyces sp.neau-D50和Salinispora arenicola CNS-205基因组为模板的PCR结果)。
图3为引物P2-F和P2-R对产生杂合型类异戊二烯化合物的微生物的PCR结果示意图；
(其中，1：DNA Marker；2-6：分别以产生杂合型类异戊二烯化合物的微生物Streptomyces coelicolor A3(2)、Streptomyces lividans TK24、Streptomycesambofaciens ATCC2387、Streptomyces sp.neau-D50和Salinispora arenicola CNS-205基因组为模板的PCR结果)。
图4为引物P3-F和P3-R对产生杂合型类异戊二烯化合物的微生物的PCR结果示意图；
(其中，1：DNA Marker；2-6：分别以产生杂合型类异戊二烯化合物的微生物Streptomyces coelicolor A3(2)、Streptomyces lividans TK24、Streptomycesambofaciens ATCC2387、Streptomyces sp.neau-D50和Salinispora arenicola CNS-205基因组为模板的PCR结果)。
图5为引物P1-F和P1-R对非产生杂合型类异戊二烯化合物的微生物的PCR结果示意图；
(其中，1：DNA Marker；2-6：分别以非产生杂合型类异戊二烯化合物的微生物Streptomyces globisporus C-1027，Streptomyces cyaneogriseus ssp.noncyanogenus，Streptomyces bingchenggensis，Streptomyces avermitilis和Streptomycesvenezuelae基因组为模板的PCR结果)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
所使用的工具酶、DNA分子量标记、胶回收试剂盒、pMD19-T载体均购自大连宝生物公司，使用方法参考商品说明书。
大肠杆菌E.coli DH5α购自上海鼎国生物技术有限责任公司。
引物由大连宝生物公司合成。
实施例1 简并引物对的设计
由于氨基酸密码子存在简并性的现象，即不同的DNA序列其最终表达的蛋白质氨基酸序列可能是相同的，所以比对已公布的由异戊烯基转移酶的蛋白序列，引物对1根据保守区域motif I和motif II设计简并引物。引物对2以异戊烯基转移酶保守区域motif I和motif V设计上下游引物，引物对3以异戊烯基转移酶保守区域motif I和motif IV设计上下游引物。
从NCBI上搜集已知来自不同微生物的异戊烯基转移酶的蛋白序列，Streptomycessp.SN-5936-dimethylallyltryptophan synthase(GenBank number：BAJ07990.1)，Streptomyces coelicolor A3(2)SCO7467(GenBank number：CAC36059.1)，Streptomyceslividans TK24(GenBank number：ZP_05521670.1)，Streptomyces ambofaciensATCC23877sam0654(GenBank number：CAJ89640.1)，Salinispora arenicola CNS-205(GenBank number：YP_001539324.1)，进行多序列比对之后(结果如图1所示)，分别根据保守区域的不同部位(motif I、motif II、motif III、motif IV和motif V)设计上下游引物。设计了如下三组引物：
引物对1 上游引物P1-F：5’-TCASACGACSASACSCCGGTSGA-3’
下游引物P1-R：5’-GYGGTGCCCGAGCCGGYGCAGGGC-3’
引物对2 P2-F：5’-TCASACGACSASACSCCGGTSGA-3’
P2-R：5’-CGAGGAGASGTAGWCCBTCAYCCGGCC-3’
引物对3 P3-F：5’-TCASACGACSASACSCCGGTSGA-3’
P3-R：5’-GWCCYYCCCGTCATGCCGGWCGTA-3’
其中，简并碱基代码S＝G或C，B＝G或C或T，Y＝C或T，W＝G或A；
实施例2 微生物DNA的提取
取5株杂合型类异戊二烯产生菌株：Streptomyces sp.neau-D50，Streptomycescoelicolor A3(2)，Streptomyces lividans TK24，Streptomyces ambofaciensATCC23877，Salinispora arenicola CNS-205，分别提取各自的基因组。
微生物DNA的提取方法如下：(1)向装有微生物菌体的离心管中加入5ml的SET缓冲液，吹打混匀使菌体重悬，然后加入100μl溶菌酶溶液(50mg/ml)至终浓度为1mg/ml，在37℃水浴锅中孵育30-60min，至菌悬液粘稠透明；(2)向菌悬液缓慢加入140μl蛋白酶K溶液(20mg/ml)至终浓度为0.5mg/ml，颠倒混匀，再加入600μl 10％的SDS溶液至终浓度为1％，颠倒混匀，然后置于55℃水浴锅中孵育2h，中间每30min缓慢颠倒混匀一次；(3)加入2ml5mmol/L的NaCl溶液，至终浓度为1.25mol/L，颠倒混匀后加入5ml的氯仿，在20℃颠倒混匀30min；(4)6000rpm离心15min，吸取上清液于干净的烧杯中，向烧杯中加入0.6倍体积的异丙醇，混合均匀，3min后用玻璃棒或封口的毛细管缠绕DNA；(5)对缠绕的DNA用10ml 70％乙醇冲洗，待乙醇挥发完全后，55℃下用适量的TE重新溶解DNA；(6)向提取的DNA溶液中加入适量的RNase，每400μl DNA溶液可加入10-20μl浓度为10mg/ml的RNase溶液，于37℃水浴锅中孵育2-3h或4℃过夜；(7)加入1/10体积的3mol/L的NaAc溶液(pH4.8)和2倍体积的无水乙醇，混合后用封口的毛细管缠绕DNA；(8)对缠绕的DNA用10ml 70％乙醇冲洗，待乙醇挥发完全后，55℃下用适量的TE重新溶解DNA，并存于4℃备用。SET缓冲液(25mmol/L Tris-HCl,75mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，pH7.5)。
实施例3 引物有效性和准确性的验证
使用实施例1设计的三组简并引物对各基因组进行PCR，然后电泳检测。回收PCR产物，并将PCR产物交由宝生物工程(大连)有限公司进行测序。PCR反应体系：10×扩增缓冲液10μl，每种dNTP混合物各200μmol/L，引物各10-100pmol，模板DNA 0.1-2μg，Taq DNA聚合酶1.5U，Mg2+1.5mol/L，加入去离子水至100μL。扩增反应条件为：94℃10min；94℃1min；53℃30s；72℃1min。
结果发现：引物对1的PCR产物在357bp处具有单一条带(如图2所示)，说明使用该引物确实能够从杂合型类异戊二烯化合物产生菌中扩增得到异戊烯基转移酶基因。将PCR产物的测序结果在NCBI上进行比对，结果发现NCBI上比对到的基因序列与实际使用的微生物基因组中异戊烯基转移酶基因序列一致，说明该引物确实能够实现杂合型类异戊二烯产生菌的鉴定。
引物对2和引物对3的扩增产物结果如图3和图4所示。结果表明，当采用引物对2或引物3对5株杂合型类异戊二烯产生菌进行PCR时，会出现多条扩增条带或没有PCR产物出现的情况，引物扩增效果显著不如引物对1。这说明针对异戊烯基转移酶不同区域设计的引物所获得的效果是不同的，并不是针对异戊烯基转移酶所有的保守区域设计的引物都适合进行鉴定。
再取5株已经确认没有异戊烯基转移酶基因的微生物(Streptomycesglobisporus C-1027，Streptomyces cyaneogriseus ssp.noncyanogenus，Streptomycesbingchenggensis，Streptomyces avermitilis和Streptomyces venezuelae)，各自提取基因组，然后使用本发明的引物对1，即P1-F和P1-R进行PCR扩增。结果发现没有单一条带出现(如图5所示)。说明本发明的引物特异性好、检测准确性好，不会导致对非杂合型类异戊二烯化合物产生菌株出现假阳性判定。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种用于鉴定杂合型类异戊二烯化合物产生菌的简并引物，其特征在于，所述简并引物的序列为：
上游引物P1-F：5’-TCASACGACSASACSCCGGTSGA-3’；
下游引物P1-R：5’-GYGGTGCCCGAGCCGGYGCAGGGC-3’；
其中，简并碱基代码S＝G或C，B＝G或C或T，Y＝C或T。
2.含有权利要求1所述简并引物的检测试剂盒。
3.一种利用权利要求1所述简并引物检测杂合型类异戊二烯化合物产生菌的方法，其特征在于，提取待检微生物的DNA，利用权利要求1所述简并引物进行PCR扩增，再利用电泳检测PCR扩增产物中是否含有单一条带。
4.权利要求3所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)提取待检微生物的基因组DNA；
2)以步骤1)所得基因组DNA为模板，利用如下序列的简并引物进行PCR扩增，获得扩增产物：
上游引物P1-F：5’-TCASACGACSASACSCCGGTSGA-3’；
下游引物P1-R：5’-GYGGTGCCCGAGCCGGYGCAGGGC-3’；
其中，简并碱基代码S＝G或C，B＝G或C或T，Y＝C或T；
3)利用琼脂糖凝胶电泳检测步骤2)所得扩增产物中是否含有单一条带。
5.权利要求1所述简并引物在宏基因组检测和分析中的应用。
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