CN106366190A - 一种抗人肝癌干细胞的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人肝癌干细胞的单克隆抗体。具体地，本发明涉及新的靶向抑制人肝癌干细胞的单克隆抗体和分泌该单抗的杂交瘤细胞系，以及该抗体在制备可用于治疗人肝癌复发和耐药药物中的应用。该单抗体外可以显著抑制人肝癌干细胞的自我更新、侵袭、耐药，体内显著抑制人肝癌移植瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期。本发明还提供了该单克隆抗体的生产细胞系小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2(保藏号为CGMCC No.10897)。

Description

一种抗人肝癌干细胞的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及一种抗人肝癌干细胞的单克隆抗体及其生产的杂交瘤细胞系，以及该抗体在治疗肝癌复发和耐药中的应用。

背景技术

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率占全球的45％，5年生存率只有15-30％左右。目前临床上治疗肝癌的手段如手术、放疗、化疗和介入治疗等对晚期肝癌治疗疗效有限，复发和耐药是导致其死亡率高的根本原因。

肿瘤干细胞是肿瘤组织中一小部分具有干细胞特性的癌细胞，具有自我更新和多向分化的能力，在恶性肿瘤的转移、复发及耐药中发挥重要作用。目前现有的治疗手段主要杀灭了敏感的肿瘤子代细胞，而对肿瘤干细胞作用甚微，最终导致了肿瘤患者的复发和转移，因此，靶向肿瘤干细胞的治疗新策略，有望降低肿瘤转移、复发及耐药，提高疗效，降低死亡率，将成肿瘤治疗的最有效的手段。

肿瘤靶向治疗的方案有多种，但已在临床广泛应用，幷证明疗效好，毒副作用低的靶向治疗方案是抗体靶向治疗。抗体靶向治疗已在临床广泛应用几十年，现已有的靶向肿瘤抗体药物在临床应用中显示出良好的疗效。常见的靶向治疗抗体包括有西妥昔单抗、贝伐珠妥昔单抗等均在临床上获得了好的疗效。如果能获得特异性靶向肝癌干细胞的功能性单抗和分子靶标，建立以肝癌干细胞为靶点的分子靶向治疗新方案，必将显著降低和减少肝癌的复发和转移，改善患者的预后。因此靶向肝癌肿瘤干细胞的研究具有良好的临床应用前景。

发明内容

因此，为了克服现有临床治疗现状及抗肝癌抗体药物研发中的不足，本发明提供一种单克隆抗体，其由于2015年06月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，保藏号为CGMCC No.10897的小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2产生。

所述的单克隆抗体为小鼠IgG1型单克隆抗体。

本发明还提供所述的由保藏号CGMCC No.10897的小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2产生的单克隆抗体在制备用于治疗人肝癌复发和耐药的药物中的应用。

本发明进一步提供一种小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2的杂交瘤细胞株，其于2015年06月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，保藏号为CGMCC No.10897，其特征在于分泌产生单克隆抗体。

换言之，本发明的第一个方面在于提供一种新的与人肝癌干细胞结合，并可在体外抑制干细胞自我更新、侵袭和耐药；抑制体内肝癌移植瘤生长和复发的单克隆抗体。目前，国内外尚未有抗肝癌干细胞单克隆抗体的报道。本发明的第二个方面在于提供上述单克隆抗体在制备可用于靶向人肝癌干细胞治疗肝癌复发和耐药药物中的应用。本发明的第三个方面在于提供可分泌产生上述单克隆的小鼠杂交瘤细胞系。

根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种新的抗人肝癌干细胞的单克隆抗体，用于治疗肝癌的复发和耐药。通过将该单克隆抗体以适宜的注射方式，例如静脉注射、腹腔注射等方式注射入机体内，使其进入血液循环扩散至全身，该单克隆抗体即可与肝癌组织中的肝癌干细胞特异结合并发挥生物学功能，抑制肝癌干细胞的自我更新、 侵袭和增殖，从而抑制体内肝癌的生长、耐药和复发，从而达到治疗肝癌的作用。

根据本发明的一个实施方式，本发明提供的单克隆抗体是由小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2(保藏号CGMCC No.10897)分泌产生，而该杂交瘤细胞系是由小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)和经人肝癌组织中分离获得的肝癌干细胞免疫小鼠的脾细胞融合后，再经筛选、鉴定后获得的。

具体地，采用酶消化法以原代结合短暂传代培养从人肝癌组织中分离含人肝癌干细胞的连续传代细胞，在无血清悬浮成球培养的培养基中培养富集。将该细胞洗涤固定后免疫正常BALB/c小鼠。采用间接免疫荧光实验监测免疫小鼠抗血清中的抗人肝癌干细胞的滴度，待特异性抗体滴度超过1:50000后冲击免疫一次，3天后处死小鼠，取脾制备单细胞悬液并与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用甲基纤维素平板法制备抗肝癌干细胞单克隆抗体库。待克隆生长后将其分别挑取至96孔板培养。将肝癌干细胞接种96孔板，用无血清培养基培养24小时后，采用细胞免疫荧光双染色法，检测单抗库中杂交瘤单抗上清与人肝癌干细胞的反应，筛选出识别肝癌干细胞标志物CD90等相关标志物的表达，挑选阳性克隆进一步培养鉴定。ELISA测定单克隆抗体的类和亚类。

根据本发明的提供的多个实施方式，能够识别肝癌干细胞的克隆被进一步采用CCK-8测定法，检测单抗库中杂交瘤单抗上清对人肝癌干细胞增殖的影响；采用Transwell小室侵袭实验，检测单抗对肝癌干细胞侵袭能力的影响；采用干细胞成球培养法，将人肝癌干细胞接种于无血清培养基中，进行成球培养，检测单抗对肝癌干细胞成球能力的抑制作用。采用动物体内致瘤实验，证明单抗能够识别肝癌干细胞。

进一步，采用仅含杂交瘤细胞系HC-7B2产生的单克隆抗体的 PBS溶液注射入荷有人肝癌移植瘤的小鼠体内进行靶向肝癌干细胞的单抗治疗实验，幷观察比较单用化疗药、单用单抗以及单抗联合化疗药靶向肝癌干细胞治疗肝癌的疗效，探讨靶向肝癌干细胞是否能治疗肝癌的生长、复发和耐化疗药，比较分析靶向肝癌干细胞治疗肝癌的最优方案，以期为靶向肝癌干细胞治疗肝癌提供有应用价值的候选单抗药物，且为设计靶向肿瘤干细胞的抗体治疗方案提供科学的实验依据。HC-7B2单抗靶向肝癌干细胞治疗肝癌的动物体内实验研究结果显示，接种肿瘤细胞2个月，停药1个月时，高(10mg/kg)、中(5mg/kg)、低剂量(2.5mg/kg)的HC-7B2单抗治疗组抑制肝癌生长的抑制率分别为87.1％、73.2％和62.6％，单抗HC-7B2(10mg/kg)联合化疗药顺铂治疗的抑制率为92.0％,单抗HC-7B2(2.5mg/kg)联合化疗药顺铂治疗的抑制率为82.4％，但单用化疗药顺铂的抑制率为53.0％，而且近2周单纯化疗组肿瘤生长加快，显示肿瘤复发，这些结果表明单用抗肝癌干细胞单抗的治疗效果显著优于单用化疗药，但略低于联合化疗组，表明HC-7B2单抗靶向肝癌干细胞，不仅能明显抑制肿瘤生长，而且还能治疗肿瘤的复发和耐药。

因此，本发明提供了一种新的抗肝癌干细胞的单克隆抗体，该单克隆抗体可在体内抑制肝癌的生长、复发和耐药。

本发明涉及的单克隆抗体的优势在于：

(1).识别并抑制与肝癌生长、复发和耐药移密切相关的细胞-肝癌干细胞，具有上述作用的单抗尚未见到报道。

(2).可抑制抑制裸鼠人肝癌移植瘤生长、复发和耐药。

(3).由自行制备的小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2(保藏号CGMCCNo.10897)分泌产生，并非产生自已有的杂交瘤细胞系。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了由上述单克隆抗体在制备可用于治疗人肝癌生长、复发和耐药的药剂中的应用。根据本发明 第一个方面提供的单克隆抗体及其在动物模型体内可以抑制人肝癌生长、复发和耐药的特性，并根据本领域内公知的知识，将很容易推知当将足够浓度的纯化的该单克隆抗体的溶液注射入人体，这些抗体将能通过血液循环进入到肝癌组织，并与肝癌干细胞结合，通过与在人体外和动物实验中相同的机制抑制人肝癌干细胞在肝癌组织中的自我更新，即可能起到治疗人肝癌生长、复发和耐药的药效。因此，该单克隆抗体可用于直接制备可用于治疗人肝癌生长、复发和耐药的药剂溶液。另外，根据本领域内公知的知识，将很容易推知将其他化疗药物有效成分与该单克隆抗体制成复方或联合使用，仍然可以发挥治疗人肝癌生长、复发和耐药的药效。

根据本发明的第三方面，本发明还提供了可分泌产生上述单克隆小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2(保藏号CGMCC No.10897)。该细胞系可以用来生产本发明涉及的单克隆抗体。具体但不仅限于，可以采用各种现有的杂交瘤培养基培养该杂交瘤细胞，收获培养上清，从上清中采用公知的各种纯化方法获得纯化的单克隆抗体。

下面将结合实施例来说明如何实施本发明所述的新的抗肝癌干细胞的单克隆抗体，如何将其用于制备可用于治疗人肝癌生长、复发和耐药的药剂，以及如何采用本发明提供的可分泌产生上述单克隆的小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2(保藏号CGMCC No.10897)生产该单克隆抗体。

通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。

附图说明

图1为单抗HC-7B2显著抑制顺铂(Cisplatin)耐药细胞增殖的情 况说明图；

图2为单抗HC-7B2抑制肝癌移植瘤生长的情况说明图；

图3为单抗HC-7B2单独以及联合顺铂治疗肝癌荷瘤小鼠的生存期情况说明图；

图4为纯化的HC-7B2单克隆抗体的电泳图。

具体实施方式

实施例1制备抗人肝癌干细胞的鼠单克隆抗体

采用一种原代培养结合短暂传代培养的新方法，从人肝癌组织中分离可产生肝癌干细胞的连续传代细胞系，并建立一种可有效富集肝癌干细胞的体外无血清悬浮培养技术。将获得的肝癌干细胞采用多聚甲醛固定，免疫Balb/c鼠，直至免疫小鼠血清抗人肝癌干细胞的滴度达到1:50,000后，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合形成杂交瘤。采用甲基纤维素平板法制备杂交瘤克隆，待克隆生长后将其分别挑取至96孔板培养。从96孔板中收集每个杂交瘤克隆的培养上清，该上清中含有这个克隆分泌的单克隆抗体。

实施例2筛选特异识别人肝癌干细胞膜表面抗原的鼠单克隆抗体

将经无血清悬浮培养的MHCC97L球形细胞，轻柔吹散成单细胞，以2000/孔接种96孔板，用无血清培养基培养24h后，细胞经含1％BSA的PBS洗涤后，每孔中分别加入一个杂交瘤克隆的培养上清100ul，室温孵育2小时；1％BSA的PBS洗涤五次后，加入生物素标记二抗室温反应30分钟；再次1％BSA的PBS洗涤五次后Cy3标记Avidin室温反应30分钟；1％BSA的PBS洗涤五次后，荧光显微镜镜检判断单抗库中的杂交瘤单抗上清与肝癌干细胞的反应，获得能与肝癌干细胞膜表面抗原结合的鼠单克隆抗体。同时我们还选择已证明含有肝癌干细胞的细胞系MHCC97L(标志物CD90)为细胞模型，对 单抗HC-7B2进行进一步鉴定。消化MHCC97L细胞后重悬细胞浓度为1×10⁷个/ml，PBS洗1遍后，加入HC-7B2抗体，37℃孵育1h，PBS洗2遍，加入Percp-羊抗小鼠IgG和FITC-CD90，37℃避光孵育30min，PBS洗2遍，用1％多聚甲醛固定后上流式仪检测。结果显示，CD90⁺细胞表达比例为4.6％，单抗HC-7B2识别的细胞比例为3.4％，两者共染比例为2.9％，为进一步证明杂交瘤单抗HC-7B2能够特异识别肝癌干细胞。

实施例3鉴定杂交瘤细胞系HC-7B2分泌的单抗对肝癌干细胞自我更新的影响

将经无血清悬浮培养的MHCC97L球形细胞，轻柔吹散成单细胞，用单抗HC-7B2(1mg/ml)与细胞共孵育，37℃孵育2h，以500个细胞/孔接种于低粘附24孔板中，用含0.8％甲基纤维素的无血清悬浮培养，在37℃，5％CO2孵箱中培养14天后计算成球率。参见表1结果显示，单抗HC-7B2处理组的成球数量为(69±17)个，而阴性对照组的成球数量为(115±20)个，明显高于抗体处理组，结果显示单抗HC-7B2能够抑制肝癌干细胞的自我更新能力。

表1：单抗HC-7B2对肝癌干细胞成球能力的影响

	对照	HC-7B2	抑制率	P值
					成球/500细胞	115±20	69±17	40％	0.013

(*p<0.05)

实施例4鉴定杂交瘤细胞系HC-7B2分泌的单克隆抗体对肝癌干细胞耐药的影响

将经无血清悬浮培养的MHCC97L球形细胞，轻柔吹散成单细胞，并稀释至5×10⁴/ml，100μl/孔接种至96孔板(即5×10³/孔)；同 时分别加入等体积含不同浓度单抗HC-7B2(5.0μg/ml，25μg/ml，125μg/ml)以及不同浓度顺铂(Cisplatin)的完全培养基(0.125μg/ml,0.25μg/ml,0.5μg/ml,1.0μg/ml,2.0μg/ml,4.0μg/ml,8.0μg/ml)，每组细胞中每个药物浓度设置4个平行孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；7天后用CCK-8法检测OD450值，计算抑制率、IC50值。抑制率＝[1-(Ax-A)/(Ao-A)]×100％，公式中Ax为加药孔OD450值，A为对照孔OD450值，Ao为不加药孔OD450值；IC50计算器软件计算50％细胞生长抑制时的药物浓度(IC50)，结果显示(参见图1)，在不同浓度的顺铂作用7d后，顺铂在HC-7B2高、中、低剂量处理组、单用顺铂处理组对肝癌干细胞的IC50分别为0.0890μg/L、0.193μg/L、0.55μg/L和0.77μg/L，表明HC-7B2单抗能识别并杀灭具有抵抗化疗药物的肝癌干细胞。

实施例5鉴定杂交瘤细胞系HC-7B2分泌的单抗对肝癌干细胞侵袭的影响

将经无血清悬浮培养的MHCC97L球形细胞，轻柔吹散成单细胞，用不含血清的培养基稀释；将Matrigel用不含血清的培养基在冰上操作稀释成1μg/μL；Transwell上室加入100μl稀释胶，室温固化1小时，弃稀释液，培养基洗2次；Transwell下室加600μL 10％FBS的培养基，上室加100μL细胞悬液(1×10⁴个细胞/孔)接种于预先包被Matrigel的Transwell上室中，同时加入单抗HC-7B2(100μg/ml)每组细胞设3个副孔，37℃、5％CO2继续培养24小时；取出上室，用干棉球擦去上室的细胞；室温甲醇固定10分钟；用PBS洗2次，用刀片将膜割下，用1μg/ml DAPI、50％甘油的PBS将膜封片；荧光显微镜拍照计数，每个培养孔随机选择3个视野拍照，IPP5.1plus计算每个视野的细胞数。参见表2结果显示，无关抗体对照组的侵袭细胞数为156±18，HC-7B2单抗组的侵袭细胞数为72±19。HC-7B2 单抗显著抑制了肝癌干细胞细胞的侵袭能力，抑制率为53.8％(p＝0.026)，表明HC-7B2单抗具有抑制肝癌干细胞侵袭能力的功能性单抗。

表2：单抗HC-7B2对肝癌干细胞侵袭能力的影响

实施例6小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2分泌的单抗抑制肝癌细胞在动物体内生长和复发

采用裸鼠体内进行靶向肝癌干细胞的单抗治疗实验，幷观察比较单用化疗药，单用单抗HC-7B2以及单抗联合化靶向肝癌干细胞治疗肝癌的疗效，探讨靶向肝癌干细胞是否能治疗肝癌的生长、转移、复发和耐化疗药。

具体举例，56只5-6周龄的雌性BALB/c裸小鼠按分为7组，每组8只。给药途径为腹腔注射，所用抗体为Protein A纯化的抗体，纯度大95％以上，用PBS进行稀释；所用顺铂浓度为0.6mg/kg，注射体积均为0.2ml/只/次。

首先接种5×10⁴个MHCC97L无血清悬浮培养细胞于裸鼠皮下，然后将裸鼠随机分为7组(每组8只)，即PBS组，单用顺铂化疗组(0.6mg/kg)，HC-7B2单抗高剂量组(10mg/kg)，HC-7B2单抗中剂量组(5mg/kg)，HC-7B2单抗低剂量组(2.5mg/kg)，单抗高剂量(10mg/kg)联合顺铂(0.6mg/kg)化疗组及单抗低剂量(2.5mg/kg)联合顺铂(0.6mg/kg)化疗组。接种肝癌细胞后第二天开始治疗。单用顺铂化疗组用0.6mg/kg，每周2次，共治疗4周；单用HC-7B2单抗组治疗方案是第一周每天给药一次，第2周每周给药2次，连续治 疗3周停药。单抗联合化疗组的方案中，单抗用药的时间和次数与单用单抗组相同，化疗药用药的时间、剂量、次数与单用化疗药组相同，一个月后7个组均停止用药，参见图2，结果显示：接种肿瘤细胞2个月，停药1个月时，高(10mg/kg)、中(5mg/kg)、低剂量(2.5mg/kg)的HC-7B2单抗治疗组抑制肝癌生长的抑制率分别为87.1％、73.2％和62.6％，单抗HC-7B2(10mg/kg)联合化疗药顺铂治疗的抑制率为92.0％,单抗HC-7B2(2.5mg/kg)联合化疗药顺铂治疗的抑制率为82.4％，但单用化疗药顺铂的抑制率为53.0％。为了进一步研究单抗是否能延长荷瘤小鼠的生存期，抗体停止治疗手，我们继续观察小鼠的生存状况，结果显示经过38周的观察发现，靶向肝癌干细胞的抗体治疗可以明显延长肝癌荷瘤裸鼠的生存期(参见图3)。这些结果表明单用抗肝癌干细胞单抗的治疗效果显著优于单用化疗药，但略低于联合化疗组，表明HC-7B2单抗靶向肝癌干细胞，不仅能明显抑制肿瘤生长，而且还能治疗肿瘤的复发和耐药。

实施例7小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2分泌的单抗亚类的鉴定

采用单克隆抗体分型试剂盒鉴定HC-7B2分泌的单克隆抗体Ig亚类。具体举例：使用SouthernBiotech公司的isotyping试剂盒鉴定HC-7B2单抗的类和亚类。将捕获抗体(2.5μg/ml)加入96孔酶标板，4℃下孵育16小时，用1％BSA/PBS室温下封闭酶标板1h，加入杂交瘤上(1:2)，室温下作用1h。加入HRP标记的各种类型二抗(HRP-标记的山羊抗小鼠(HRP-labeled goat anti-mouse)IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，κorλ，1:2000)，室温下作用1h，显色，测OD450值。根据个亚型OD 450大小判断HC-7B2分泌的单克隆抗体为IgG1类单抗，轻链为κ型。

实施例8小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2分泌的单克隆抗体的生产

培养小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2(保藏号CGMCC No.10897)可以生产HC-7B2单克隆抗体。培养方式可以采用培养瓶培养与可以采用发酵罐等方法，培养液可以采取有血清培养基或无血清培养基。具体举例：用培养瓶培养小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2，培养基采用Gibco公司的无血清培养基。小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2悬浮在无血清培养基中培养，培养条件为37℃，5％的二氧化碳，到细胞密度达到1×10⁶/ml后，离心收取培养上清，HC-7B2单克隆抗体就存在于培养上清中。

实施例9小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2分泌的单克隆抗体的纯化

采用亲和纯化等方法可以从小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2培养的上清中纯化小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2分泌的单克隆抗体。具体举例：采用Protein G亲和纯化的方法。将小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2培养的上清通过Protein G亲和柱，HC-7B2被结合到亲和柱上，用10倍柱床体积的PBS(pH7.4)洗柱。以0.1M的甘氨酸(PH2.5)洗脱层析柱上HC-7B2单克隆抗体，即可得到纯化的HC-7B2单克隆抗体。纯化的抗体进行SDS-PAGE电泳，在还原电泳中可以看到HC-7B2单克隆抗体在55KD左右的重链，25KD处的轻链(参见图4)。

Claims (4)

1.一种单克隆抗体，其由于2015年06月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.10897的小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2产生。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述的单克隆抗体为小鼠IgG1型单克隆抗体。

3.一种如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于治疗人肝癌复发和耐药的药物中的应用。

4.一种小鼠杂交瘤细胞系HC-7B2的杂交瘤细胞株，其于2015年06月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.10897，其特征在于分泌产生如权利要求1所述的单克隆抗体。