CN106349335A - 一种靶向抗肿瘤药物及其合成方法 - Google Patents

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Abstract

一种靶向抗肿瘤药物及其合成方法，属于药物合成技术领域。本发明首先将胞嘧啶核苷类药物(阿扎胞苷或阿糖胞苷)通过脂肪酶催化与Boc‑6‑氨基己酸结合制得前药，再通过蛋白酶和谷氨酰胺转氨酶的共同催化反应将上一步合成的前药与序列为LTVSPWYGTGTQGTGRGTGDDR的多肽进行修饰连接。整个靶向抗肿瘤药物合成路线使用化学/酶法，反应条件温和，酶促反应结构特异性强，副产物较少。本发明制备的靶向抗肿瘤药物相比原药其毒副作用降低，药效得到提高。

Description

一种靶向抗肿瘤药物及其合成方法
技术领域
本发明涉及一种靶向抗肿瘤药物及其合成方法，属于化学药物合成技术领域。
背景技术
目前治疗癌症的手段主要有手术切除，放疗和化疗。其中化疗不仅可以杀死癌细胞，还可以杀死癌细胞周围的正常细胞，副作用非常大。胞嘧啶核苷类药物如阿扎胞苷和阿糖胞苷都是比较有效的抑制乳腺肿瘤生长的药物，但是此类药物副作用比较强，使用后会引起白细胞减少或肝损害等多种不良反应。有研究表明，含有LTVSPWY序列的多肽具有特异性结合乳腺肿瘤细胞而不与正常细胞相结合的特性(The FASEB Journal,2002,17(2),256)，将胞嘧啶核苷类药物连接在此类具有乳腺肿瘤靶向的多肽药物载体上，既可以维持药物的药效，又可以使药物只作用于特定器官的肿瘤细胞而不会对其他细胞造成损伤。
但是，胞嘧啶核苷类药物以及多肽载体上可用于反应的位点很多，使用常规的化学手段将药物和载体进行连接势必会造成大量的副反应发生，导致药物无法与载体进行特定位点的连接。相比于化学合成而言，酶法合成的条件更加温和，操作更加简单，区域选择性更高，反应中副产物更少，而且很多化学方法难以合成的反应都可以通过一种或多种酶来完成。因此，有必要设计出一种化学/酶法合成路线将胞嘧啶核苷类药物与靶向多肽载体进行特异性连接。
发明内容
为克服上述现有技术的缺点，本发明提供了一种利用化学手段与多种固定化酶共同作用合成靶向抗肿瘤药物(结构如式I所示)的方法。该方法条件温和，合成出的靶向抗肿瘤药物副产物较少。
为了达到上述目的，本发明按照以下技术方案实现:
(1)向烧瓶中加入Boc-6-氨基己酸，乙酸乙烯酯，乙酸汞以及乙酸铜后，在40-70℃搅拌5-30分钟，滴加浓硫酸后继续搅拌24-72小时。之后加入无水乙酸钠，震荡静置后过滤。所得滤液进行硅胶柱(乙酸乙酯/石油醚洗脱)分离得到产物1。
(2)将脂肪酶，产物1和胞嘧啶核苷类药物加入到溶剂中30-60℃搅拌反应24-120小时。反应结束后，减压去除有机溶剂。将粗产物进行硅胶柱(乙酸乙酯/甲醇洗脱)分离得到产物2。
(3)将产物2投入到饱和氯化氢的乙酸乙酯溶液中室温下搅拌12-36小时。使用离心机(3000-12000rpm)对反应生成的沉淀进行离心，室温下烘干得到产物3。
(4)将产物3溶解于饱和碳酸氢钠水溶液中形成溶液A；将靶向肽(序列为LTVSPWYGTGTQGTGRGTGDDR)加入缓冲液(pH＝5-9)中形成溶液B。将溶液A与B混合均匀后，加入胰蛋白酶和谷氨酰胺转氨酶在25-45℃反应6-12小时。反应结束后对溶液通过WelchromC18柱分离得到靶向抗肿瘤药物。
进一步，步骤(1)中Boc-6-氨基己酸：乙酸乙烯酯：乙酸汞：无水乙酸钠：乙酸铜：浓硫酸＝1:5-15:0.005-0.02:0.1-0.3:0.005-0.05:0.005-0.04，质量比。
进一步，步骤(2)中胞嘧啶核苷类药物为阿扎胞苷或阿糖胞苷。
进一步，步骤(2)中溶剂为吡啶与正己烷的混合溶剂，吡啶:正己烷＝1:0.2-0.5，体积比。
进一步，步骤(2)中脂肪酶：产物3：胞嘧啶核苷类药物＝1:30-100:5-20，质量比。
进一步，步骤(4)中产物3：靶向肽：胰蛋白酶：谷氨酰胺转氨酶＝1:1-5:0.5-10:0.5-10，质量比。
进一步，步骤(4)中溶液A：溶液B＝1:0.25-0.5，体积比。
本发明的优点在于:
(1)对阿扎胞苷或阿糖胞苷的羟基进行修饰，可以提高阿扎胞苷或阿糖胞苷的药效(Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2006,38,48)。
(2)将阿扎胞苷或阿糖胞苷与含有LTVSPWY序列的靶向多肽进行连接，可以使药物具有靶向性，作用于乳腺肿瘤细胞的能力增强，对普通细胞的杀伤减弱。
(3)利用酶法对药物与靶向载体进行连接，反应条件温和，反应区域选择性强，反应副产物较少。
附图说明
图1：本发明所述的抗肿瘤靶向药物合成工艺图。当X为N元素时，为靶向阿扎胞苷药物合成工艺图；当X为C元素时，为靶向阿糖胞苷药物合成工艺图。
具体实施方式
以下结合实例详述本发明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1:
向250mL圆底烧瓶中加入Boc-6-氨基己酸12g，乙酸乙烯酯100g，乙酸汞0.1g以及0.1g乙酸铜。将此溶液在60℃搅拌6分钟后，滴加0.25g浓硫酸(质量百分比浓度为98％，以下同，但不局限于此)。反应继续搅拌24h后，加入2g无水乙酸钠，震荡静置后过滤。所得滤液进行柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:8)分离。分离组分抽干淋洗剂得到淡黄色液体1。产物1的产率为70％。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.29(dd,1H,＝CH-),4.87(d,1H；CH2＝),4.60(d,1H；NH),4.56(d,1H；CH2＝),3.11(d,2H；-CH2-),2.39(t,2H；-CH2-),1.70(dt,2H；-CH2-),1.49(m,2H；-CH2-),1.46(s,9H；-C(CH3)3),1.34(m,2H；-CH2-).
将0.01g脂肪酶，0.5g产物1和0.0976g阿扎胞苷加入到12mL溶剂(吡啶：正己烷＝5:1)中50℃搅拌反应72h。反应结束后真空抽干溶剂后得到粗产物。将粗产物进行柱层析(乙酸乙酯：甲醇＝10:1)分离。分离组分抽干淋洗剂得到白色固体粉末2。产物2的产率为60％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6,δ):8.31(s,1H；H-6),7.56(d,2H；NH2),6.75(s,1H；-NH-),5.64(d,1H；H-1’),5.47(d,1H；2’-OH),5.20(d,1H；3’OH),4.28(dd,1H；H-2’),4.23-4.15(m,2H；H-4’,H-5’),4.03–3.98(m,2H；H-3’,H-5’),2.88(dd,2H；-CH2-),2.32(t,2H；-CH2-),1.51(dt,2H；-CH2-),1.36(s,9H；-C(CH3)3),1.23(s,4H；-CH2-).
将产物2投入到饱和氯化氢的乙酸乙酯溶液中室温下搅拌24小时。使用离心机(8000rpm)对反应生成的沉淀进行离心。使用大量乙酸乙酯对产物进行冲洗以去除未反应的物质。剩余沉淀使用真空干燥箱室温下烘干得到产物3。产率为85％。MS(ES+)m/z:[M+H]+calcd for C14H23N5O6,358.2；found,358.3；[M+Na]+calcd for C14H23N5O6,380.2；found,380.3.
将1mg产物3溶解于1mL饱和碳酸氢钠水溶液中形成溶液A。将4mg靶向肽(LTVSPWYGTGTQGTGRGTGDDR)加入到3mL tris-HCl缓冲液(0.1M,pH＝7.0)中形成溶液B。将溶液A与B混合均匀后，投入2mg胰蛋白酶和2mg谷氨酰胺转氨酶35℃搅拌反应6h。反应结束后对溶液通过Welchrom C18柱分离得到靶向阿扎胞苷药物。产率18％。MALDI-TOF/MS:calcd for C88H133N25O30,M＝2019.9Da；found,m/z 2020.9[M+H]+.
实施例2：
向200mL圆底烧瓶中加入Boc-6-氨基己酸10g，乙酸乙烯酯120g，乙酸汞0.15g以及0.2g乙酸铜。将此溶液在50℃搅拌15分钟后，滴加0.2g浓硫酸。反应继续搅拌48h后，加入2.5g无水乙酸钠，震荡静置后过滤。所得滤液进行柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:8)分离。分离组分抽干淋洗剂得到淡黄色液体1。产物1的产率为63％。13C NMR(101MHz,CDCl3,δ):170.6(C＝O),156.0(C＝O),141.1(＝CH-),97.5(CH2＝),79.1(-C(CH3)3),40.3(-CH2-),29.7(-CH2-),28.4(-CH2-),26.2(-CH2-),24.2(-C(CH3)3),22.6,(-CH2-)；FTIR(KBr):3370(NH),1725,1714(C＝O),1649(C＝C).
将0.02g脂肪酶，0.7g产物1和0.2g阿扎胞苷加入到15mL溶剂(吡啶：正己烷＝4:1)中45℃搅拌反应68h。反应结束后真空抽干溶剂后得到粗产物。将粗产物进行柱层析(乙酸乙酯：甲醇＝10:1)分离。分离组分抽干淋洗剂得到白色固体粉末2。产物2的产率为46％。FTIR(KBr):3200-3600(NH,NH2,OH),1703,1693(C＝O).MS(ES+)m/z:[M+H]+calcd forC19H31N5O8,458.2；found,458.1；[M+Na]+calcd for C19H31N5O8,480.2；found,480.2.
将产物2投入到饱和氯化氢的乙酸乙酯溶液中室温下搅拌18小时。使用离心机(10000rpm)对反应生成的沉淀进行离心。使用大量乙酸乙酯对产物进行冲洗以去除未反应的物质。剩余沉淀使用真空干燥箱室温下烘干得到产物3。产率为81％。MS(ES+)m/z:[M+H]+calcd for C14H23N5O6,358.2；found,358.2；[M+Na]+calcd for C14H23N5O6,380.2；found,380.2.
将2mg产物3溶解于2mL饱和碳酸氢钠水溶液中形成溶液A。将5mg靶向肽(LTVSPWYGTGTQGTGRGTGDDR)加入到4mL tris-HCl缓冲液(0.1M,pH＝8.0)中形成溶液B。将溶液A与B混合均匀后，投入3mg胰蛋白酶和5mg谷氨酰胺转氨酶40℃搅拌反应12h。反应结束后对溶液通过Welchrom C18柱分离得到靶向阿扎胞苷药物。产率23％。MALDI-TOF/MS:calcd for C88H133N25O30,M＝2019.9Da；found,m/z 2020.7[M+H]+.
实施例3：
向250mL圆底烧瓶中加入Boc-6-氨基己酸15g，乙酸乙烯酯150g，乙酸汞0.2g以及0.3g乙酸铜。将此溶液在55℃搅拌20分钟后，滴加0.3g浓硫酸。反应继续搅拌72h后，加入3g无水乙酸钠，震荡静置后过滤。所得滤液进行柱层析(乙酸乙酯：石油醚体积比＝1:8)分离。分离组分抽干淋洗剂得到淡黄色液体1。产物1的产率为71％。
将0.015g脂肪酶，0.6g产物1和0.15g阿糖胞苷加入到13mL溶剂(吡啶：正己烷体积比＝2:1)中55℃搅拌反应100h。反应结束后真空抽干溶剂后得到粗产物。将粗产物进行柱层析(乙酸乙酯：甲醇体积比＝11:1)分离。分离组分抽干淋洗剂得到白色固体粉末2。产物2的产率为66％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):7.48(d,1H；H-6),7.07(d,2H；NH2),6.75(s,1H；-NH-),6.09(d,1H；H-1’),5.67(d,1H；H-5),5.62–5.48(m,2H；2’-OH,3’-OH),4.24(ddd,2H；H-5’),4.03–3.77(m,3H；H-2’,H-3’,H-4’),2.89(dd,2H；-CH2-),2.33(t,2H；-CH2-),1.65–1.40(m,4H；-CH2-),1.38(s,9H；-C(CH3)3),1.25(m,2H；-CH2-).
将产物2投入到饱和氯化氢的乙酸乙酯溶液中室温下搅拌30小时。使用离心机(6000rpm)对反应生成的沉淀进行离心。使用大量乙酸乙酯对产物进行冲洗以去除未反应的物质。剩余沉淀使用真空干燥箱室温下烘干得到产物3。产率为83％。MS(ES+)m/z:[M+H]+calcd for C14H23N5O6,357.2；found,357.3；[M+Na]+calcd for C14H23N5O6,379.2；found,379.3.
将1.5mg产物3溶解于1mL饱和碳酸氢钠水溶液中形成溶液A。将2mg靶向肽(LTVSPWYGTGTQGTGRGTGDDR)加入到3.5mL tris-HCl缓冲液(0.01M,pH＝6.0)中形成溶液B。将溶液A与B混合均匀后，投入1.5mg胰蛋白酶和1.8mg谷氨酰胺转氨酶45℃搅拌反应10h。反应结束后对溶液通过Welchrom C18柱分离得到靶向阿糖胞苷药物。产率为30％。MALDI-TOF/MS,calcd for C89H133N24O30,M＝2018.9Da；found,m/z 2019.9[M+H]+.
实施例4：
向200mL圆底烧瓶中加入Boc-6-氨基己酸8g，乙酸乙烯酯75g，乙酸汞0.15g以及0.25g乙酸铜。将此溶液在58℃搅拌10分钟后，滴加0.18g浓硫酸。反应继续搅拌66h后，加入1.8g无水乙酸钠，震荡静置后过滤。所得滤液进行柱层析(乙酸乙酯：石油醚体积比＝1:8)分离。分离组分抽干淋洗剂得到淡黄色液体1。产物1的产率为69％。
将0.01g脂肪酶，0.45g产物1和0.12g阿糖胞苷加入到12mL溶剂(吡啶：正己烷体积比＝2.5:1)中52℃搅拌反应80h。反应结束后真空抽干溶剂后得到粗产物。将粗产物进行柱层析(乙酸乙酯：甲醇＝11:1)分离。分离组分抽干淋洗剂得到白色固体粉末2。产物2的产率为63％。FTIR(KBr):3200-3600(NH,NH2,OH),1728,1690(C＝O).MS(ES+)m/z:[M+H]+calcdfor C20H32N4O8,457.2；found,457.2；[M+Na]+calcd for C20H32N4O8,479.2；found,479.1.
将产物2投入到饱和氯化氢的乙酸乙酯溶液中室温下搅拌25小时。使用离心机(5000rpm)对反应生成的沉淀进行离心。使用大量乙酸乙酯对产物进行冲洗以去除未反应的物质。剩余沉淀使用真空干燥箱室温下烘干得到产物3。产率为84％。MS(ES+)m/z:[M+H]+calcd for C14H23N5O6,357.2；found,357.2；[M+Na]+calcd for C14H23N5O6,379.2；found,379.2.
将1.2mg产物3溶解于1.2mL饱和碳酸氢钠水溶液中形成溶液A。将2.4mg靶向肽(LTVSPWYGTGTQGTGRGTGDDR)加入到3.6mL tris-HCl缓冲液(0.05M,pH＝8.0)中形成溶液B。将溶液A与B混合均匀后，投入1mg胰蛋白酶和1mg谷氨酰胺转氨酶38℃搅拌反应6h。反应结束后对溶液通过Welchrom C18柱分离得到靶向阿糖胞苷药物。产率为24％。MALDI-TOF/MS,calcd for C89H133N24O30,M＝2018.9Da；found,m/z 2019.7[M+H]+.
实施例5：
使用CCK-8试剂盒对实施例1制备的靶向阿扎胞苷作用于MCF-7乳腺肿瘤细胞的毒性进行测试。首先，在96孔板中配置100μL的MCF-7细胞悬液，将培养板在培养箱预培养24小时(37℃，5％CO2)。之后向培养板中分别加入10μL 0.0002mol/L的阿扎胞苷与靶向阿扎胞苷。将培养板在培养箱孵育20小时后，向每孔加入10μL CCK溶液，继续将培养板在培养箱内孵育4小时。最后用酶标仪测定样品在450nm处的吸光度。经测定，靶向阿扎胞苷组MCF-7细胞的存活率是阿扎胞苷组MCF-7细胞的存活率的68％，说明靶向阿扎胞苷对于肿瘤细胞的杀伤力更强。
实施例6：
使用CCK-8试剂盒对实施例2制备的靶向阿扎胞苷作用于MCF-7乳腺肿瘤细胞的毒性进行测试。首先，在96孔板中配置100μL的MCF-7细胞悬液，将培养板在培养箱预培养20小时(37℃，5％CO2)。之后向培养板中分别加入10μL 0.0002mol/L的阿扎胞苷与靶向阿扎胞苷。将培养板在培养箱孵育24小时后，向每孔加入10μL CCK溶液，继续将培养板在培养箱内孵育4小时。最后用酶标仪测定样品在450nm处的吸光度。经测定，靶向阿扎胞苷组MCF-7细胞的存活率是阿扎胞苷组MCF-7细胞的存活率的70％，说明靶向阿扎胞苷对于肿瘤细胞的杀伤力更强。
实施例7：
使用CCK-8试剂盒对实施例3制备的靶向阿糖胞苷作用于MCF-7乳腺肿瘤细胞的毒性进行测试。首先，在96孔板中配置100μL的MCF-7细胞悬液，将培养板在培养箱预培养20小时(37℃，5％CO2)。之后向培养板中分别加入10μL 0.0002mol/L的阿糖胞苷与靶向阿糖胞苷。将培养板在培养箱孵育24小时后，向每孔加入10μL CCK溶液，继续将培养板在培养箱内孵育4小时。最后用酶标仪测定样品在450nm处的吸光度。经测定，靶向阿糖胞苷组MCF-7细胞的存活率是阿糖胞苷组MCF-7细胞的存活率的82％，说明靶向阿糖胞苷对于肿瘤细胞的杀伤力更强。
实施例8：
使用CCK-8试剂盒对实施例4制备的靶向阿糖胞苷作用于MCF-7乳腺肿瘤细胞的毒性进行测试。首先，在96孔板中配置100μL的MCF-7细胞悬液，将培养板在培养箱预培养24小时(37℃，5％CO2)。之后向培养板中分别加入10μL 0.0002mol/L的阿糖胞苷与靶向阿糖胞苷。将培养板在培养箱孵育20小时后，向每孔加入10μL CCK溶液，继续将培养板在培养箱内孵育4小时。最后用酶标仪测定样品在450nm处的吸光度。经测定，靶向阿糖胞苷组MCF-7细胞的存活率是阿糖胞苷组MCF-7细胞的存活率的85％，说明靶向阿糖胞苷对于肿瘤细胞的杀伤力更强。

Claims (9)

1.一种靶向抗肿瘤药物，其结构如式I所示：
2.合成如权利要求1所述的一种靶向抗肿瘤药物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)向烧瓶中加入Boc-6-氨基己酸，乙酸乙烯酯，乙酸汞以及乙酸铜后，在40-70℃搅拌5-30分钟，滴加硫酸后继续搅拌24-72小时；之后加入无水乙酸钠，震荡静置后过滤；所得滤液进行硅胶柱分离得到产物1；
(2)将脂肪酶，产物1和胞嘧啶核苷类药物加入到溶剂中30-60℃搅拌反应24-120小时；反应结束后，减压去除有机溶剂；将粗产物进行硅胶柱分离得到产物2；
(3)将产物2投入到饱和氯化氢的乙酸乙酯溶液中室温下搅拌12-36小时；使用离心机对反应生成的沉淀进行离心，室温下烘干得到产物3；
(4)将产物3溶解于饱和碳酸氢钠水溶液中形成溶液A；将序列为LTVSPWYGTGTQGTGRGTGDDR的靶向肽加入缓冲液中形成溶液B；将溶液A与B混合均匀后，加入胰蛋白酶和谷氨酰胺转氨酶在25-55℃反应6-12小时；反应结束后对溶液通过WelchromC18分离得到靶向抗肿瘤药物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中Boc-6-氨基己酸：乙酸乙烯酯：乙酸汞：无水乙酸钠：乙酸铜：浓硫酸＝1:5-15:0.005-0.02:0.1-0.3:0.005-0.05:0.005-0.04，质量比。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中胞嘧啶核苷类药物为阿扎胞苷或阿糖胞苷。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中溶剂为吡啶与正己烷的混合溶剂，吡啶:正己烷＝1:0.2-0.5，体积比。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中脂肪酶：产物1：胞嘧啶核苷类药物＝1:30-100:5-20，质量比。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中产物3：靶向肽：胰蛋白酶：谷氨酰胺转氨酶＝1:1-5:0.5-10:0.5-10，质量比。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中溶液A：溶液B＝1:0.25-0.5，体积比。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：硅胶柱中采用乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂洗脱。
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