CN106310268B - 一种治疗三阴性乳腺癌的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物组合物领域，涉及治疗乳腺癌的药物组合物，尤其涉及一种含有辛伐他汀与组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药物组合物，以及在制备治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。本发明的药物组合物联用具有显著的协同效应和新的作用机制，明显提高他汀类药物的抗肿瘤效果，降低了给药剂量，起到了增效减毒的作用。

Description

一种治疗三阴性乳腺癌的药物组合物

技术领域

本发明属于药物组合物领域，涉及治疗乳腺癌的药物组合物，尤其涉及一种含有辛伐他汀与组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药物组合物，以及在制备治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。

背景技术

据世界卫生组织调查报告显示，全球肿瘤症状况日益严重，未来20年新患者的人数将由目前的每年1410万增加到2170万，因肿瘤症而死亡的人数也将由目前的每年820万增加至1300万。目前已上市的抗肿瘤药物较多，如烷化剂药物、抗代谢药物、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂等，但是大多药物由于毒性较大，导致病人不耐受。随着肿瘤分子生物学的研究进展，肿瘤分子靶向治疗已成为肿瘤研究的热点，在多种肿瘤的治疗中发挥了重要的作用。然而，研究显示，大部分肿瘤的生物学行为并非由单一信号传导通路所支配，而是多个信号传导通路共同起作用的，因此合理的将多药制成药物组合进行联合用药，结果显示具有单用药物不可比拟的优越性，所述药物组合进行联合用药针对多靶点进行靶向治疗将不仅旨在减少或延缓耐药性的出现、降低毒性，而且通过多种药物对肿瘤细胞杀伤的协同作用取得更好的疗效，因此，采用药物组合进行多靶点药物治疗已成为肿瘤药物干预领域发展的新方向。

已知肿瘤的种类繁多,各种肿瘤症的特性不尽相同，重要信号分子及信号途径也不同，如其中的肿瘤症中Cyclin D1、CDK4、AKT或MYC等表达失控，这些重要分子可能成为治疗靶标；有些分子，如ZAP-70、p-AKT、Cyclin D1的短小变体、cyclin D2、cyclin D3等，它们的表达和肿瘤症的恶化有很强的相关性，这样的分子或几个分子的组合同样可以成为治疗靶标；但是，该些分子本身的活性、稳定性及它们的下游信号均依赖于Hsp90的分子伴侣功能。

研究显示，所述Hsp90是高度保守的、以二聚体存在的ATP依赖型的分子伴侣，在肿瘤细胞中大量表达，其主要功能是帮助细胞里蛋白质的折叠,保持蛋白有正确的空间结构而发挥正常的生理活性,需要Hsp90维持功能的蛋白分子通常被称为Hsp90的Clientprotein(或称分子伴侣底物)；一旦Hsp90不能发挥正常的分子伴侣功能,这些分子伴侣底物的稳定性将被破坏并很快通过蛋白酶体途径被降解。

研究显示，肿瘤中被诱导的Hsp90对维持肿瘤相关蛋白结构及活性是不可或缺的，如肿瘤蛋白激酶、核内激素转录因子的组装和拆分等；含Hsp90的分子伴侣复合物，经过多步骤的ATP结合、水解循环，Hsp90α在ATP和ADP之间实现空间转换，完成hsp90与分子伴侣底物的结合与分离，最终导致分子伴侣底物以高活性状态存在；ATP结合部位在Hsp90的N-端疏水区域，ATP和N-端的结合引起Hsp90空间结构的变化，影响Hsp90和辅助伴侣分子如p23和p50p50cdc37(如果底物是信号蛋白激酶的话)形成伴侣机器(chaperone machine)，直接影响与肿瘤转移相关信号分子的活性和稳定性；Hsp90本身具有ATPase的功能，ATP与Hsp90结合的复合物在这种ATPase作用下，水解成ADP结合的Hsp90复合物，该种复合物没有分子伴侣的功能，底物分子在泛素化E3连结酶的帮助下被26S蛋白酶体降解，对肿瘤细胞而言，维持肿瘤细胞生存的重要蛋白及蛋白激酶多数需要Hsp90分子伴侣功能的帮助，所以，Hsp90对肿瘤细胞至关重要。

正因为Hsp90的N-端含有ATP的结合部位，影响ATP与Hsp90结合的小分子化合物可以抑制Hsp90的分子伴侣功能，ATP的结合部位是目前筛选Hsp90抑制剂的主要靶标；中间段是分子伴侣底物和Hsp90相互作用的部位，许多肿瘤相关蛋白激酶,如AKT、c-Raf、c-Src等都和Hsp90的中端部位作用；C-端的末尾含有一个MEEVD片段，这一片段对Hsp90和含有TPR结构的蛋白相互作用至关重要，除去这一片段会抑制Hsp90的ATPase活性；研究显示，Hsp90结构的任何变化都可能影响Hsp90的功能，更可能干扰Hsp90和分子伴侣底物的结合，最终引起分子伴侣底物的降解。在肿瘤细胞中,越来越多的蛋白被发现是Hsp90的分子伴侣底物，尤其是与肿瘤转移相关的信号分子，如c-Raf、AKT、ZAP-70、IKKα；ER(endoplasmicreticulum)的转膜激酶，如IRE1(inositol requiring enzyme 1)和PERK(double-stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase)；cell cycle调控蛋白，如cdk4、cyclin D、p21、chk1及wee1等。这些肿瘤相关蛋白都是Hsp90的分子伴侣底物,它们和许多肿瘤的发生、转移有直接的关系，因此，肿瘤中Hsp90和许多肿瘤相关蛋白形成复合物，主导它们的功能，已成为抗肿瘤研究的热门靶标分子。此外，有研究报道，正常生理条件下的肿瘤细胞Hsp90表达水平高达总蛋白的4％,明显地比正常细胞的1-2％高得多,这种表达水平的差异使Hsp90成为一个很好的抗肿瘤药物的筛选靶標。

已知格尔德霉素(Geldanamycin，GAA)是一种天然的Hsp90抑制剂，特异性地干扰糖皮质激素受体(GR)/HSP复合物的形成，GAA的衍生物17-AAG和17-DMAG与hsp90有很强的亲和力，它们和hsp90的ATP/ADP结合部位结合，从而阻止hsp90和底物相结合，使底物被蛋白酶体降解，Hsp90的ATP结合部位理所当然地成为筛选Hsp90抑制剂的模型；

以Hsp90的ATP结合部位为筛选模型,Novartis、Merck等制药公司已筛选到一些Hsp90抑制剂,如17-AAG、17-DMAG和AUY922都促使肿瘤蛋白迅速被蛋白酶体途径降解,达到杀死肿瘤细胞的目的，其中有些已进入临床试验，但目前的Hsp90抑制剂中尚无成为临床用药者。

‘蛋白乙酰化’是一种蛋白转录后修饰，一般是指蛋白质链上的Lys(K)的氨基接上一个乙酰基基团，而不是指蛋白链末端其他氨基；组蛋白乙酰化转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是分别控制组蛋白N-端Lys乙酰化和去乙酰化的、功能相反的两类酶；乙酰化修饰是由HDAC和HAT调控的可逆过程,受环境、营养、药物等多种因素影响，乙酰化直接导致蛋白质功能的差异；一般而言，乙酰化促进转录因子的转录活性，如p53、E2F1、FATA1、RelA、YY1、Bcl-6等；有关蛋白乙酰化的研究显示，首先在组蛋白中发现乙酰化修饰，后来在非组蛋白中同样发现乙酰化修饰，乙酰化对非组蛋白P53和FoxO1的功能影响研究使蛋白乙酰化成为研究的热点之一；在细胞中，蛋白质是主要的信息调控和传递的分子，任何修饰都会对蛋白的功能产生或正或负面的影响，合理利用这些负面影响对肿瘤细胞可能是致命的；HDAC分为HDAC-I、II、III三类，到目前为止发现有18个不同的HDAC蛋白，有研究已发现多个可以抑制HDAC-I/II/III的抑制剂，但仅HDAC-I/II抑制剂在肿瘤防治方面有潜在价值；另有研究表明，HDAC抑制剂如SAHA(vorinostat)、LAQ824、LBH 589均增加p21、p27的表达，也诱导促凋亡蛋白如Bax、Bak和Bim的表达，同时影响抗凋亡蛋白如Bcl-xl、XIAP、AKT、c-Raf和survivin的水平；组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有抑制肿瘤细胞增殖、细胞周期阻滞、诱导细胞分化及促进细胞凋亡的作用，其中SAHA和LBH589已上市，此外MS-275、Trichostatin(TSA)、FK228及西达苯胺等多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂进入临床研究；然而，实践显示HDAC抑制剂缺少专一性，对肿瘤细胞的杀伤无专一性。

有研究公开了肿瘤病人和小鼠肿瘤样品，其中显示肿瘤细胞而非正常细胞中的Hsp90是以乙酰化修饰形式存在，hsp90的乙酰化和肿瘤大小相对应，与肿瘤恶化程度相对应；目前，Hsp90抑制剂的筛选多数是基于大肠杆菌表达的Hsp90的ATP结合片段为模型筛选，该筛选模型缺乏对Hsp90的乙酰化修饰问题的考虑，造成筛选到的小分子化合物对肿瘤Hsp90抑制效果有限，以及缺乏肿瘤细胞选择性。

本申请前期研究表明，不同部位的乙酰化对hsp90的功能影响不同，不一定导致肿瘤细胞的死亡；hsp90中7个位点可以被HDAC抑制剂诱导产生乙酰化，分别是K69、K100、K292、K327、K478、K546和K558，经过乙酰化模拟突变K/Q分析发现，在C-端的乙酰化都是破坏hsp90的功能，但在中间段乙酰化则有不同，K292位于hsp90中端起始部位的链接(hinge)区域，该链接区域在各种物种中是高度保守的，但K292乙酰化极大地增强了hsp90与ATP、激酶伴侣分子p50cdc37及泛素化E3连结酶CHIP的结合，这意味着hsp90如果在K292位点上单乙酰化的话，将使失活的蛋白激酶更快地降解，hsp90发挥分子伴侣功能时对ATP的浓度要求降低，其分子伴侣功能更强大，这将大大增强肿瘤细胞的抗药性和蛋白激酶的信号，更有利于肿瘤细胞的生长，促使肿瘤细胞的转移扩散；另一个事实是，hsp90的K292乙酰化和肿瘤大小及肿瘤的恶化程度有着紧密的相关性，如果肿瘤中乙酰化破坏hsp90的分子伴侣功能，肿瘤细胞死亡；基于此，提出“乙酰化Hsp90是肿瘤症治疗的新靶标”的概念,进而建立乙酰化Hsp90抑制剂的筛选模型，发现乙酰化hsp90抑制剂对肿瘤的防治具有重要意义。

基于上述研究发现，本发明拟提供一种含有含有辛伐他汀与组蛋白去乙酰化酶抑制剂的的药物组合物，以及在制备治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的研究基础，提供一种含有辛伐他汀与组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药物组合物，及其在制备治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。更具体涉及一种含有辛伐他汀作为乙酰化hsp90抑制剂和去乙酰化酶抑制剂LBH589的药物组合物，及其在制备治疗三阴性乳腺癌药物中的应用

本发明中还提供了一种筛选乙酰化hsp90抑制剂的方法。

本发明基于现有技术的研究基础，用K292Q突变模拟K292位点乙酰化的hsp90，建立稳定表达Flag-hsp90-K292Q及HA-p50CDC37的细胞株，然后用细胞株的裂解液经AlphaTechnology技术比较荧光信号强弱，筛选乙酰化hsp90抑制剂；荧光信号越弱，说明小分子化合物抑制乙酰化hsp90-p50cdc37结合的能力越高，由此提出了辛伐他汀强烈抑制乙酰化hsp90的分子伴侣功能；

鉴于辛伐他汀是他汀类羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，抑制内源性胆固醇的合成，原为血脂调节剂，研究发现他汀类药物还能抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化，和诱导肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞侵袭及转移能力，而对正常细胞无明显的毒副作用；本发明经研究显示，辛伐他汀抑制hsp90-p50cdc37复合物的形成，同样抑制乙酰化hsp90与p50cdc37复合物形成的功能，从而使hsp90失去对肿瘤中蛋白激酶的分子伴侣功能；同时经研究显示，去乙酰化酶抑制剂LBH589可以诱导细胞中hsp90在K292位的乙酰化而增强其与cdc37复合物的形成，本发明中采用含有辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的组合物，使其中的辛伐他汀和去乙酰化酶抑制剂LBH589联用，具有破坏hsp90和p50cdc37复合物的形成的作用。

本发明的含有辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的组合物中，所述辛伐他汀可以为辛伐他汀及其衍生物及其结构类似物。

本发明药物组合物中的辛伐他汀的结构式如式I所示：

本发明的药物组合物中，所述辛伐他汀组分包括但不限于辛伐他汀药物本身，还可以是其可药用的盐、水合物、类似物或衍生物等。

本发明中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以为任何结构类型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药物，如苯甲酰胺类、脂肪酸类等，具体可以是但不限于如：panobinostat(LBH589)、vorinostat(SAHA)、Trichostatin(TSA)。

本发明药物组合物中组蛋白去乙酰化酶抑制剂优选为LBH589，SAHA和TSA，其中，LBH589由Novartis公司研发，通用名为panobinostat，已通过FDA批准上市，商品名为Farydak^TM，其结构式如II所示：

其中SAHA是第一个批准上市的HDAC抑制剂，由默克公司开发，通用名为vorinostat，用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤，其结构式如III所示：

本发明药物组合物中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂组分包括但不限于上述药物本身，还可以是它们的可药用的盐、水合物、类似物或衍生物等；也可以是式I的羟基和式II或式III的羟肟酸基团形成羟肟酸酯的形式将两药偶联在一起。

本发明的含有辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药物组合物可以用于制备治疗各种肿瘤的药物，所述肿瘤包括但不限于三阴性乳腺肿瘤。

本发明药物组合物在制备治疗三阴性乳腺肿瘤药物中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589与辛伐他汀的摩尔比为1:1-20。

优选的，本发明药物组合物在制备治疗三阴性乳腺肿瘤药物中，所述SAHA和辛伐他汀的摩尔比为1:1-15。

本发明中，含有辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂组合物在用于治疗三阴性乳腺肿瘤的应用中，将本发明组合物制成同时给药的药剂方案中，辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以在同一种制剂如片剂或胶囊中，也可以将辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂分别做成制剂，如分别做成片剂或胶囊，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，使用者按照药品说明书的指示同时服用；

本发明中，在将本发明组合物制成先后给药的药剂方案中，可以将辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂分别做成不同的制剂，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，使用者然后按照药品说明书指示的先后顺序进行服用，或将上述组合物中的两种成分制成一种控释的制剂，先释放组合物中的一种成分、然后再释放组合物中的另一种成分，使用者只需要服用该控释组合物制剂；

本发明中，在将本发明组合物制备成交叉给药的药剂方案中，可以将辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂分别做成不同的制剂，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，使用者然后按照药品说明书指示的交叉顺序服用，或者将该药物组合物制备成辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂交叉释放的控释制剂。

本发明的辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂组合物在制备治疗三阴性乳腺肿瘤药物的应用中，所述组合物中的辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以同时使用或以任何先后的顺序使用，如可以将辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂同时给患者服用；也可以先将辛伐他汀药物给患者服用、然后服用组蛋白去乙酰化酶抑制剂，或先服用组蛋白去乙酰化酶抑制剂、然后服用辛伐他汀药物，对于两者服用的时间间隔没有特别要求，但优选服用两种药物的时间间隔不超过一天；或者两种药物交替给药。

本发明中，可将辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂采用本领域常规的方法制备成适于胃肠道给药或非胃肠道给药的药物制剂，本发明优选将辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂制成胃肠道给药的药物制剂，其制剂形式可以为常规片剂或胶囊，控释或缓释制剂。在本发明辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂组合物的药物制剂中，根据不同的制剂形式和制剂规格，所述组合物在制剂中的含量可以质量计为1％-99％，优选为10％-90％；制剂使用的辅料可采用本领域常规的辅料，以不和本发明组合物发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提；所述制剂的制备方法可采用本领域常规的制备方法进行制备。

本发明中，所述的组合物的制备方法没有限制，辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂两者可以进行直接混合然后做成制剂，也可以分别和/或相应的辅料混合分别做成制剂，然后再按照本领域常规的方式包装在一起，或分别和相应的辅料混合然后再混合做成制剂。

本发明中的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在人体内能够达到有效的血药浓度为前提。

本发明分别进行了辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂组合抑制(杀死)MDA-MB-231(乳腺肿瘤细胞株)、MDA-MB-468(乳腺肿瘤细胞株)、BT-483(乳腺肿瘤细胞株)、BT474(乳腺肿瘤细胞株)、MDA-MB-453(乳腺肿瘤细胞株)、MCF-7(乳腺肿瘤细胞株)、MCF-10A(乳腺纤维囊性病上皮细胞株)和A549(肺肿瘤细胞株)的试验，结果显示，本发明得辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂组合在治疗三阴性乳腺肿瘤和肺肿瘤的应用中具有显著的协同效应；小鼠实验结果表明，去乙酰化酶抑制剂与辛伐他汀相互增强对方的抗肿瘤药效，降低用药剂量，减少副作用的发生。

附图说明

图1.辛伐他汀对hsp90-cdc37结合的影响。

图2.辛伐他汀与LBH589对细胞凋亡因子的影响。

图3.辛伐他汀及LBH589对hsp90共伴侣结合的影响。

图4.辛伐他汀及LBH589对hsp90伴侣分子的影响。

图5.辛伐他汀及LBH589对hsp90伴侣分子磷酸化的影响。

图6.辛伐他汀及LBH589对小鼠中三阴性乳腺肿瘤生长的影响。

图7.辛伐他汀及LBH589对小鼠中三阴性乳腺肿瘤重量的影响。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明并不受限于此。

实施例1：

为了验证辛伐他汀(Simvastatin)是乙酰化hsp90的抑制剂，将Flag-hs90及Flag-hsp90-K292Q突变体分别转入HEK293T细胞中，用16μM浓度的辛伐他汀处理24小时后，检测Flag-hsp90和蛋白激酶伴侣分子cdc37的结合能力，结果显示，辛伐他汀不但可以抑制hsp90与cdc37的结合，也可以抑制hsp90乙酰化模拟分子K292Q与cdc37结合的能力，但是K292Q模拟乙酰化使Flag-hsp90与cdc37的结合能力提高约3倍；由于肿瘤组织中hsp90的K292位点处于乙酰化状态而优先和肿瘤组织、而非正常组织中的cdc37形成复合物，因此辛伐他汀显然具有抑制肿瘤组织中hsp90与cdc37结合的能力；

图1显示了，在HEK293细胞中，K292Q具有比hsp90强得多的与cdc37结合的能力，辛伐他汀不但抑制hsp90和cdc37复合物的形成，也抑制乙酰化hsp90与cdc37复合物的形成。

实施例2：辛伐他汀与LBH589联用的联合指数测定

细胞：MDA-MB-231(乳腺肿瘤细胞株)、MDA-MB-468(乳腺肿瘤细胞株)、BT483(乳腺肿瘤细胞株)、BT474(乳腺肿瘤细胞株)、MDA-MB-453(乳腺肿瘤细胞株)、MCF-7(乳腺肿瘤细胞株)、MCF-10A(乳腺纤维囊性病上皮细胞株)和A549(肺肿瘤细胞株)均来源于AmericanType Culture Collection(ATCC)，Rockville，MD，USA；

药品：辛伐他汀购自Sigma；组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589和Trichostatin(TSA)均购自Selleck Chemicals；

方法：准确称量药物组合物相应组分，分别溶于二甲基亚矾配成30mM的贮存液，保存在-20℃冰箱，使用时用新鲜的培养基稀释到合适的浓度，然后分别取1微升混合备用。所有的试验中，二甲基亚矾的最终浓度均低于1‰(V/V)；

将所有的细胞于含10％小牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基中，37℃，5％CO₂的湿度条件下培养，在加药的前一天，在96孔板上进行细胞接种2X10⁴/孔，然后向细胞中加入按上述方法制备的药物组合物溶液，使各组分达到其工作浓度，然后用两种不同方法测定联合指数，结果如表1和表2所示；

本实施例中，作如下的技术说明：

A.单层细胞生长抑制试验

使用两种细胞生长抑制试验方法，它们是：1)CCK-8检测和2)CellTiter-Blue细胞活力检测，使用孵育特定小时后抑制25％、50％、75％或90％细胞的化合物浓度即IC₂₅、IC₅₀、IC₇₅和IC₉₀来作为抗增殖效力的度量；

CCK-8细胞计数检测是测定细胞增殖速率的比色试验，2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，通过酶联免疫检测仪定量测定450nm波长处的光吸收值，可间接反映活细胞数量；

CellTiter-Blue细胞活力检测是通过利用溶解于缓冲溶液中高纯度的刃天青检测活性细胞的数目，细胞可将深蓝色的氧化型染料(刃天青)转化为红色的还原型染料(试卤灵)，因为无活性的细胞很快丧失了代谢能力而不能还原刃天青，也就不能产生荧光信号，所以，该系统特异性检测活性细胞，试验产生的荧光和比色信号与样品中活细胞的数量成比例；

上述试验中，用8点或10点药物滴定在多孔组织培养板中进行试验，使外侧各列保持空置，将细胞以不少于10⁴细胞/mL的密度悬浮于完全培养基中，并加入每孔中，然后加入适当培养基(200μL)，24小时后，将20μL的CellTiter-Blue或CCK-8溶液加入一个板中以测定加入化合物时(T₀)的活性，将该板在37℃孵育适宜的时间，并经Tecan infiniteM200Pro使用仪器配套程序i-control在450nm(CCK-8检测)及560nm激发光激发下在590nm(CellTiter-Blue)测量光密度，T₀板作为在实验开始阶段的初始活性参考，接种完24小时后，开始加入化合物，该时间与T₀测定的时间相同，在96孔板中加入各个化合物的一系列浓度稀释物，最高浓度位于板边缘，一式三份地加入稀释物中的每一种，并将完全培养基加入没有细胞的空的外侧的各列中，化合物单独加入或与组蛋白去乙酰化酶抑制剂组合加入，接种后将该板在37℃孵育72小时，加入CellTiter-Blue或CCK-8溶液(同T₀板)并在适宜的时间后读取，为分析数据，从各实验孔中减去单独溶媒(背景)的平均值，并计算化合物各个稀释物的三个值的平均值，使用以下公式计算生长百分比；

B.联合指数(CI)

为测定组蛋白去乙酰化酶抑制剂与其它化合物一起是否具有加合作用、协同作用或拮抗作用，测定用于各组合所产生的杭增殖活性的、被称为联合指数的参数。CI通过等效线图解法方程CI＝(D)₁/(D_x)₁+(D)₂/(D_x)₂来测定，组合中的药物1(D)₁和药物2(D)₂抑制X％且(D_x)₁和(D_x)₂是也抑制X％的药物1和药物2单独的剂量，对于每种化合物，在各剂量使用在CellTiter-Blue细胞活力检测和CCK-8细胞计数检测试验中所测定的％生长值，CI值小于1表明了协同作用，等于1表明了加合作用，且大于1表明了拮抗作用，CI可在IC₂₅、IC₅₀、IC₇₅和IC₉₀测定。

表1.辛伐他汀与LBH589联用的联合指数，使用CCK-8细胞计数检测。

表2.辛伐他汀与LBH589组合的联合指数，使用CellTiter-Blue细胞活力检测。

实施例3：辛伐他汀以及与LBH589联用对MDA-MB-231细胞凋亡及坏死的影响

将乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231用不同浓度辛伐他汀(Simva.)在有/或无LBH589存在下分别处理24小时，随后，用Annexin V细胞凋亡试剂盒处理，并通过流式细胞仪检测细胞凋亡状态，数值代表细胞处于凋亡及坏死状态比例的平均值+S.E.M.，结果显示，辛伐他汀与LBH589联用，主要引起细胞的凋亡，结果如表3所示。

表3.

本实施例中，检测了辛伐他汀及其与LBH589联用引起的凋亡蛋白caspase3的活化及其底物Parp1酶切状态，结果显示，辛伐他汀与LBH589联用可以增强辛伐他汀诱导的细胞凋亡。

实施例4

辛伐他汀以及与LBH589联用只影响hsp90与共伴侣的结合，而不影响hsp90共伴侣分子及调节分子的表达，将乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231用不同浓度辛伐他汀(Simva.)在/或无LBH589存在下分别处理24小时，检测热休克蛋白hsp40、hsp70、hsp90及共伴侣分子cdc37、HOP、hsp90激活分子AHA1的表达水平，结果显示，有无LBH589的存在，辛伐他汀对这些蛋白的表达均无显著影响，尤其是没有诱导hsp70等热休克蛋白的表达，减少了产生抗药性的一种可能性，也是有别于其他hsp90抑制剂所在，因而比一般的hsp90抑制剂更有优势；

但是，对hsp90的伴侣底物分子的稳定性，尤其是对磷酸化底物分子的稳定性有显著影响，同时，Hsf1及磷酸化的Hsf1(活性Hsf1)的稳定性减弱，所以Hsp70等热休克蛋白的表达不能被诱导；

辛伐他汀及其与LBH589的联用侧重破坏hsp90伴侣底物分子磷酸化的特性表明，辛伐他汀及其与LBH589的联用优先破坏蛋白激酶的稳定性，结果证实辛伐他汀及其与LBH589的联用降低了蛋白激酶Raf1和CDK4的稳定性，但有些激酶的稳定性并不受影响，如CDK1。

实施例5

辛伐他汀及其与LBH589的联用抑制三阴性乳腺肿瘤生长。Balb/c裸鼠接种2x10⁶个MDA-MB-231细胞，接种肿瘤细胞两周后(肿瘤约长至120mm³)开始口服给药，每周两次，测量肿瘤体积、体重和最后肿瘤重量，结果显示，辛伐他汀与LBH589的联用显著抑制肿瘤的生长，抑制效果明显比辛伐他汀及LBH589单独给药对肿瘤的生长抑制强许多：

同样，辛伐他汀、LBH589及辛伐他汀与LBH589的联用对肿瘤重量的影响，也和对肿瘤肿瘤体积的影响有相似的效果，而对小鼠体重没有显著影响。

Claims (5)

1.一种治疗三阴性乳腺癌的药物组合物，其特征在于，以有效剂量的他汀类药物与组蛋白去乙酰化酶抑制剂为活性成分，以及药剂学上必要的辅料组成；

所述的他汀类药物为具有抑制hsp90功能的他汀药物辛伐他汀；组蛋白去乙酰化酶抑制剂为LBH589；

所述的辛伐他汀与组蛋白去乙酰化酶抑制剂的摩尔比为0.06-30.0:0.0002-0.1。

2.权利要求1所述的药物组合物在制备治疗三阴性乳腺肿瘤药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤药物中，所述辛伐他汀和LBH589的摩尔比为0.06-30.0:0.0002-0.1。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物组合物中的辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂同时使用，或任何先后的顺序使用。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物组合物中的辛伐他汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂是两者通过任何方式的偶联物。