CN106308787B - 荧光可见的电生理微电极结构及其制作方法 - Google Patents

荧光可见的电生理微电极结构及其制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种荧光可见的电生理微电极结构及其制作方法。主要包括：绝缘毛细管体、绝缘微米针尖和荧光涂敷层；绝缘毛细管体为管状中空结构，一端与绝缘微米针尖相连，另外一端裸露在外；绝缘微米针尖为中空结构，与特定细胞进行吸附封接，与绝缘毛细管体共同形成毛细管内的电学通路；荧光涂敷层为薄膜结构，包裹在绝缘毛细管体和绝缘微米针尖上，荧光涂敷层具有荧光特性，形成电极的荧光标记。本发明利用了Parylene材料退火后良好的自发荧光特性，解决了电生理微电极的荧光观察问题，具有良好的化学稳定性，生物兼容性和荧光可见能力。通过微电子工艺加工的方式，其成本低廉，加工重复性好，形貌控制均匀，成品率高，可批量生产。

Description

荧光可见的电生理微电极结构及其制作方法
技术领域
本发明涉及细胞电生理技术领域，尤其涉及一种荧光可见的电生理微电极结构及其制作方法。
背景技术
细胞电生理技术，或膜片钳技术，是以微弱电流信号测量为基础的,使用微玻管电极接触细胞膜，吸附并封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域与其周围在电学上分隔，对此膜片上的离子通道的pA级离子电流进行监测记录的方法。此技术对生物科学尤其是神经科学具有重大意义，被称为研究离子通道的“金标准”，获得了1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。
随着神经电极，光遗传等科学研究和技术的发展，对于特定神经细胞和特定神经通路的电信号传导，以及活体的电生理研究引起了研究者的注意。然而，目前的技术面临的问题是：用于进行细胞内电生理记录和测量的玻璃微电极，本身是透光的，且不具有荧光特性。虽然可以通过细胞染色等方式对待测的特定细胞或神经通路进行精确标记，可微电极本身却很难在荧光显微镜下进行定位和引导。如何制作出可以在荧光下可见，可定向引导，且电学性能良好的微电极成为了关键问题。
近年来，国内外的科研工作者也在想方设法对微电极进行改进，现有技术中第一种对微电极进行改进的方案包括：通过量子点的方式在电极表面进行修饰，实现了荧光在多光子荧光显微镜下的可见，经过测试，加工出的电极在脑组织内部达到500微米的深度时，荧光依然可以被观测。后续进行的特定神经细胞体外和体内的电生理实验都证明了电极良好的荧光和电学性能。
上述现有技术中的第一种对微电极进行改进的方案的缺点为：采用了量子点的修饰，由于使用的是人工蘸取的加工方式，其工艺的重复性和效率，以及其生物兼容性都是值得探讨的问题。
现有技术中第二种对微电极进行改进的方案包括：使用了荧光修饰蛋白涂敷电极，使用商用荧光修饰白蛋白作为标记物，利用荧光的引导实现了脑切片内小于一微米尺度的轴突的接触记录。
上述现有技术中的第二种对微电极进行改进的方案的缺点为：同样存在加工重复性和效率的问题，同时以生物蛋白作为荧光标记的稳定性也有待提高。
发明内容
本发明的实施例提供了一种荧光可见的电生理微电极结构及其制作方法，以实现电生理微电极的荧光可见。
为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案。
根据本发明的一个方面，提供了一种荧光可见的电生理微电极结构，包括：绝缘毛细管体、绝缘微米针尖和荧光涂敷层；
所述绝缘毛细管体为管状中空结构，一端与所述绝缘微米针尖相连，另外一端裸露在外；
所述绝缘微米针尖为中空结构，与特定细胞进行吸附封接，与所述绝缘毛细管体共同形成毛细管内的电学通路；
所述荧光涂敷层为薄膜结构，包裹在所述绝缘毛细管体和所述绝缘微米针尖上，所述荧光涂敷层具有荧光特性，形成电极的荧光标记。
进一步地，所述绝缘毛细管体在进行电生理操作时灌注导电细胞内液，通过插入惰性Ag/AgCl电极与测量仪器连接。
进一步地，所述绝缘毛细管体和所述绝缘微米针尖的材料为玻璃，所述荧光涂敷层的材料为聚对二甲苯Parylene。
进一步地，所述绝缘毛细管体的长度为4cm至6cm，内径尺寸为毫米量级；所述绝缘微米针尖的开口范围为1μm至3μm；所述荧光涂敷层的厚度范围为200nm至1μm。
进一步地，所述荧光可见的电生理微电极与细胞进行吸附，形成吉欧封接，进行电生理测量记录。
根据本发明的另一个方面，提供了一种荧光可见的电生理微电极的制作方法，包括：
步骤1：用超声波清洗玻璃毛细管，去除所述玻璃毛细管的表面颗粒；
步骤2：对所述玻璃毛细管进行拉制，在所述玻璃毛细管上形成微米级电极针尖开口；
步骤3：对所述玻璃毛细管上的所述微米级电极针尖进行抛光，使得所述微米级电极针尖表面平整光滑；
步骤4：对抛光后的玻璃毛细管电极进行Parylene涂覆，通过化学气相淀积的方式在玻璃毛细管电极的表面均匀且保形地生长Parylene，形成一层Parylene薄膜，并保证所述微米级针尖开口仍处于保留状态；
步骤5：将带有Parylene薄层的毛细管电极进行退火，退火温度高于Parylene的玻璃化温度，使得所述Parylene薄膜重结晶，得到荧光可见的电生理微电极。
进一步地，所述方法还包括：
将加工后的电生理微电极置于荧光显微镜下，通过UV/blue，blue/green和green/red的通道，观察到所述电生理微电极的荧光发射，根据荧光的形貌判断出所述电生理微电极的轮廓和针尖的所在位置。
进一步地，所述步骤4中的Parylene的制作方法，包括以下步骤：
步骤1：取Parylene的二聚体原料，通过控制所述Parylene的二聚体原料的重量调整淀积厚度，所述Parylene的二聚体原料的重量与淀积厚度的对应关系为1.6g/μm；
步骤2：将所述Parylene的二聚体原料和待淀积玻璃毛细管电极放入化学气相淀积系统，抽真空至5mTorr以下；
步骤3：预热所述化学气相淀积系统的裂解炉管至690摄氏度；
步骤4：加热所述化学气相淀积系统的原料仓，使得Parylene的二聚体原料升华至气态，进入690摄氏度的裂解炉管被裂解，裂解的Parylene的二聚体原料进入置有待淀积玻璃毛细管电极的室温腔室，在玻璃毛细管电极的表面生长成为聚合物薄膜；直至所述原料仓的温度升至175摄氏度，所有Parylene的二聚体原料蒸发完毕；
步骤5：将所述化学气相淀积系统内各加热部件降至室温，放掉系统真空，打开腔室，取出带有Parylene薄层的玻璃毛细管微电极。
进一步地，所述步骤5中的将带有Parylene薄层的毛细管电极进行退火，退火温度高于Parylene的玻璃化温度，使得所述Parylene薄膜重结晶，得到荧光可见的电生理微电极，包括：
步骤1：将带有Parylene薄层的玻璃毛细管微电极置于退火炉内，炉管内通入氮气，氮气流量为4.5L/min，形成惰性环境；或者，对所述退火炉进行抽真空，形成惰性环境；
步骤2：设置退火程序，退火温度高于Parylene的玻璃化温度，从室温开始的升温时间为30min，退火时间为60min以上；
步骤3：运行退火程序，退火程序结束后，继续对所述退火炉维持氮气供给；或者，继续对所述退火炉进行抽真空，直至所述退火炉的温度降至室温后，再将所述玻璃毛细管微电极取出。
由上述本发明的实施例提供的技术方案可以看出，本发明实施例通过利用了Parylene材料退火后良好的自发荧光特性，解决了电生理微电极的荧光观察问题，相较于背景技术中提及到的其它改良方法，具有良好的化学稳定性，生物兼容性和荧光可见能力。通过微电子工艺加工的方式，其成本低廉，加工重复性好，形貌控制均匀，成品率高，可批量生产。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的一种荧光可见的电生理微电极的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的一种荧光可见的电生理微电极的加工流程示意图。
附图标示：1.绝缘毛细管体，2.绝缘微米针尖，3.荧光涂敷层；4.玻璃毛细管，5.玻璃毛细管电极，6.荧光可见的电生理微电极，7.荧光显微镜视野，8.目标细胞。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的任一单元和全部组合。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以几个具体实施例为例做进一步的解释说明，且各个实施例并不构成对本发明实施例的限定。
Parylene(聚对二甲苯)材料是一种微加工工艺兼容的有机物，可以通过化学气相淀积的形式形成百纳米至数十微米的保形性薄膜，同时还具有优异的物化特性和生物兼容性，尤其是其电学绝缘性，达到了8.8×1016Ω·cm，可以与玻璃相比拟。在生物兼容程度方面，Parylene材料可以进行人体植入，这一点也经过了美国食品药品管理局(FDA)的认证。由于Parylene材料其具有特殊的苯环和碳链结构，其荧光特性也由于干扰生物实验测量等原因逐渐被发现和报道。本发明正是利用了Parylene的材料特性，通过微加工的技术实现了Parylene的均匀涂敷，且通过热退火的方式Parylene材料重结晶，显著增强了荧光强度，使其达到了微尺度镜下可见的效果。
图1为本发明实施例提供的一种荧光可见的电生理微电极的结构图，包括：绝缘毛细管体1、绝缘微米针尖2和荧光涂敷层3。其中绝缘毛细管体1是微电极的主体结构，一端与拉制出的绝缘微米针尖2相连，另外一端裸露在外，用于在电生理操作时灌注导电细胞内液。在绝缘毛细管体1上插入惰性Ag/AgCl电极与测量仪器，形成电连接。
绝缘微米针尖2为中空结构，具有1至3微米量级的开口，用于与特定细胞进行吸附封接，与绝缘毛细管体1共同形成毛细管内的电学通路。
荧光涂敷层3为百纳米量级的薄膜结构，均匀包裹在绝缘毛细管体1和绝缘微米针尖2上，所述荧光涂敷层具有荧光特性，形成电极的荧光标记，在荧光显微镜的各通道下可见。荧光涂敷层3的材料为Parylene，生物兼容性和电学绝缘性都极佳，一方面便于与细胞接触，一方面作为电极外材料，抗干扰能力增强。
图2为本发明实施例提供的一种荧光可见的电生理微电极结构的加工流程，包括以下步骤：
步骤1、取外径1.5mm、内径0.86mm和长度10mm的硼硅酸盐玻璃毛细管4，用超声对硼硅酸盐玻璃毛细管4进行清洗，去除表面颗粒，以备进入超净工艺环境；
步骤2、对玻璃毛细管4进行拉制，采用两步法进行拉制，加热温度分别设置为660和530摄氏度，最终形成具有1μm至3μm针尖开口的玻璃毛细管微电极5；
步骤3、对拉制后的玻璃毛细管微电极5进行抛光，使得针尖表面平整光滑，为后续包覆工艺提供优质表面，便于与目的细胞形成电学封接；
步骤4、对抛光后的玻璃毛细管电极5进行Parylene涂覆，通过化学气相淀积的方式在玻璃毛细管微电极5的表面均匀且保形地生长Parylene，形成一层小于1微米的薄膜，并保证微米级针尖开口仍处于保留状态；
上述Parylene的涂覆制作方法为：
a)取Parylene的二聚体原料，重量约为0.8g，根据目标的淀积厚度，可通过控制原料重量调整淀积厚度，上述Parylene的二聚体原料的重量与厚度的对应关系为1.6g/μm；
b)将Parylene的二聚体原料和待淀积玻璃毛细管电极5放入化学气相淀积系统，抽真空至5mTorr以下，以保证薄膜的生长质量；
c)预热化学气相淀积系统的裂解炉管，至690摄氏度，即原料的裂解温度；
d)缓慢加热化学气相淀积系统的原料仓，使得Parylene的二聚体原料升华至气态，进入690摄氏度的炉管被裂解。之后，裂解的Parylene的二聚体原料进入置有待淀积玻璃毛细管电极的室温腔室，在玻璃毛细管电极的表面生长成为聚合物薄膜；在生长过程中，通过调节原料仓的加热温度，控制系统真空在21mTorr附近，保证Parylene淀积的速率和质量；直至原料仓温度升至175摄氏度，所有原料蒸发完毕；
e)将化学气相淀积系统内各加热部件降至室温，放掉系统真空，打开腔室，取出带有Parylene薄层的玻璃毛细管微电极。
以上各条件参数仅作为参考，实际加工过程中可以根据需要加工出的Parylene的厚度和特性进行适当调整改变。
步骤5、将带有Parylene薄层的玻璃毛细管微电极进行退火，退火温度高于Parylene的玻璃化温度，时间大于1小时，使得表面Parylene层重结晶，提升薄层的结晶度，从而增强表层Parylene的荧光。
上述玻璃毛细管微电极的退火过程包括：
a)将带有Parylene薄层的玻璃毛细管微电极置于退火炉内，炉管内通入氮气，氮气流量为4.5L/min，以形成惰性环境(也可以通过抽真空来实现)；
b)设置退火程序，退火温度为270摄氏度，从室温开始的升温时间为30min，退火时间为60min以上；
c)运行退火程序，退火程序结束后继续维持氮气供给(或真空)，直至炉内温度降至室温后，再将微电极取出，以防Parylene薄膜被氧化或老化；
步骤6、将加工出的荧光可见的电生理微电极6置于荧光显微镜视野7下，通过UV/blue，blue/green和green/red的通道，可观察到该荧光可见的电生理微电极6的荧光发射，根据荧光的形貌判断出微电极的轮廓和针尖的所在位置。利用荧光引导和定位，可与目标细胞8形成封接测量。
综上所述，本发明实施例通过利用了Parylene材料退火后良好的自发荧光特性，解决了玻璃电极的荧光观察问题，相较于背景技术中提及到的其它改良方法，具有良好的化学稳定性，生物兼容性和荧光可见能力。通过微电子工艺加工的方式，其成本低廉，加工重复性好，形貌控制均匀，成品率高，可批量生产。
本发明实施例的荧光可见的电生理微电极的加工采用了化学气相淀积的方式来进行涂覆。简化了荧光修饰的工艺过程和人工操作，最终得到的微电极针尖的开口可由淀积厚度来决定，工艺控制精确，适用范围广。
本领域普通技术人员可以理解：附图只是一个实施例的示意图，附图中的模块或流程并不一定是实施本发明所必须的。
本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于装置或系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述得比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。以上所描述的装置及系统实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的情况下，即可以理解并实施。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种荧光可见的电生理微电极结构，其特征在于，包括：绝缘毛细管体、绝缘微米针尖和荧光涂敷层；
所述绝缘毛细管体为管状中空结构，一端与所述绝缘微米针尖相连；另外一端裸露在外,用于与膜片钳微电极夹持器连接固定；
所述绝缘微米针尖为中空开口结构，用于与特定细胞的细胞膜进行吸附封接，与所述绝缘毛细管体共同形成毛细管内的电学通路；
所述荧光涂敷层为薄膜结构，保形包裹在所述绝缘毛细管体和所述绝缘微米针尖外部，并维持绝缘微米针尖的中空开口，所述荧光涂敷层在显微镜UV/blue，blue/green和green/red通道下均具有荧光特性，形成电极的荧光标记；
所述绝缘毛细管体和所述绝缘微米针尖的材料为玻璃，所述荧光涂敷层的材料为退火后的聚对二甲苯Parylene。
2.根据权利要求1所述的荧光可见的电生理微电极结构，其特征在于，所述绝缘微米针尖的开口范围为1μm至3μm；所述荧光涂敷层的厚度范围为200nm至1μm。
3.一种荧光可见的电生理微电极的制作方法，其特征在于，包括：
步骤1：用超声波清洗玻璃毛细管，去除所述玻璃毛细管的表面颗粒；
步骤2：对所述玻璃毛细管进行拉制，在所述玻璃毛细管上形成微米级电极针尖的开口；
步骤3：对所述玻璃毛细管上的所述微米级电极针尖进行抛光，使得所述微米级电极针尖表面平整光滑；
步骤4：对抛光后的玻璃毛细管电极进行Parylene涂覆，通过化学气相淀积的方式在玻璃毛细管电极的表面均匀且保形地生长Parylene，形成一层Parylene薄膜，并保证所述微米级电极针尖开口仍处于保留状态；
步骤5：将带有Parylene薄层的玻璃毛细管电极进行退火，退火温度高于Parylene的玻璃化温度，使得所述Parylene薄膜重结晶，得到荧光可见的电生理微电极。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
将加工后的电生理微电极置于荧光显微镜下，通过UV/blue，blue/green和green/red的通道，观察到所述电生理微电极的荧光发射，根据荧光的形貌判断出所述电生理微电极的轮廓和针尖的所在位置。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述步骤4中的Parylene薄膜的制作方法，包括以下步骤：
步骤1：取Parylene的二聚体原料，通过控制所述Parylene的二聚体原料的重量调整淀积厚度，所述Parylene的二聚体原料的重量与淀积厚度的对应关系为1.6g/μm；
步骤2：将所述Parylene的二聚体原料和待淀积玻璃毛细管电极放入化学气相淀积系统，抽真空至5mTorr以下；
步骤3：预热所述化学气相淀积系统的裂解炉管至690摄氏度；
步骤4：加热所述化学气相淀积系统的原料仓，使得Parylene的二聚体原料升华至气态，进入690摄氏度的裂解炉管被裂解，裂解的Parylene的二聚体原料进入置有待淀积玻璃毛细管电极的室温腔室，在玻璃毛细管电极的表面生长成为聚合物薄膜；直至所述原料仓的温度升至175摄氏度，所有Parylene的二聚体原料蒸发完毕；
步骤5：将所述化学气相淀积系统内各加热部件降至室温，放掉系统真空，打开腔室，取出带有Parylene薄层的玻璃毛细管电极。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤5中的将带有Parylene薄层的玻璃毛细管电极进行退火，退火温度高于Parylene的玻璃化温度，使得所述Parylene薄膜重结晶，得到荧光可见的电生理微电极，包括：
步骤1：将带有Parylene薄层的玻璃毛细管电极置于退火炉内，炉管内通入氮气，氮气流量为4.5 L/min，形成惰性环境；或者，对所述退火炉进行抽真空，形成惰性环境;
步骤2：设置退火程序，退火温度高于Parylene的玻璃化温度，从室温开始的升温时间为30min，退火时间为60min以上；
步骤3：运行退火程序，退火程序结束后，继续对所述退火炉维持氮气供给；或者，继续对所述退火炉进行抽真空，直至所述退火炉的温度降至室温后，再将所述玻璃毛细管电极取出。
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