CN106282092A

CN106282092A - 一种角膜内皮分离和扩增培养液

Info

Publication number: CN106282092A
Application number: CN201610808869.8A
Authority: CN
Inventors: 狄国虎; 周庆军; 段豪云; 赵晓雯; 祁霞; 曲明俐
Original assignee: SPECIALTY OF OPHTHALMOLOGY RESEARCH INSTITUTE SHANDONG PROV
Current assignee: SPECIALTY OF OPHTHALMOLOGY RESEARCH INSTITUTE SHANDONG PROV
Priority date: 2016-09-07
Filing date: 2016-09-07
Publication date: 2017-01-04

Abstract

本发明公开了一种兔角膜内皮细胞分离、扩增培养液及其制备方法和用途。该角膜内皮培养液为含有胎牛血清，L‑谷氨酰胺，庆大霉素，两性霉素B，bFGF，Y‑27632和A‑83‑01的低糖DMEM培养基，其中各组分的浓度如下：胎牛血清5％～10％，L‑谷氨酰胺0.35～0.40mg/L,庆大霉素40～60mg/L,两性霉素B1～1.5mg/L,bFGF 2～5ng/L，Y‑27632 8～15μmol/L,A‑83‑01 0.8～1.2μmol/L。本发明的角膜内皮培养基能促进体外培养的兔角膜内皮细胞大量分离、扩增、维持角膜内皮细胞的形态特征、抑制内皮细胞分化和凋亡。该培养液的制备方法简单，便于实施，具有广阔的应用开发前景。

Description

一种角膜内皮分离和扩增培养液

技术领域

本发明属于兔角膜内皮制备技术领域，具体涉及一种角膜内皮分离和扩增培养液。

背景技术

角膜内皮细胞是位于角膜内侧的单层细胞，可不断排出角膜基质中的水分，对于维持角膜透明和正常生理功能起着重要作用。然而，角膜内皮细胞缺乏增殖能力，人角膜内皮细胞的数量随着年龄的增长而不断减少。当经过外伤,白内障手术或者急性闭角型青光眼大发作等创伤或Fuch角膜内皮营养不良后，角膜内皮细胞功能发生障碍，因为角膜内皮细胞缺乏增殖能力,当内皮受损到一定程度时就会导致大泡性角膜病变。穿透性角膜移植一直以来都是角膜内皮细胞失代偿最主要的治疗手段。据统计，在接受全层角膜移植的病人中超过一半的病人是由于角膜内皮的原因而进行的手术。角膜移植需要新鲜的角膜供体,但世界范围内面临着供体紧缺，极大的制约了角膜移植手术的开展，且这一问题在我国尤为显著。

随着细胞生物学和角膜内皮细胞组织培养方面的进展,以体外培养的角膜内皮细胞的组织工程移植研究已经成为解决这些困境的新的途径。与人角膜内皮不同，兔角膜内皮在体外具有一定的增殖能力。因此，兔角膜内皮成为理想的种子细胞，用于验证角膜内皮植片支架的生物材料以及相关药物检测。然而，以往研究证实兔角膜内皮培养液在长期培养角膜内皮细胞后，极易发生使培养的角膜内皮细胞发生内皮-间质转化，且在其维持角膜内皮细胞形态、抑制衰老凋亡方面未见有明显成效。因此，探索兔角膜内皮细胞的体外培养体系，寻找能促进其大量分离、扩增、维持正常形态功能、抑制衰老凋亡的培养体系迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足之处，提供了一种角膜内皮分离和扩增培养液，可以大量分离、扩增兔角膜内皮细胞，维持内皮细胞规则形态，避免因长期体外培养而导致的内皮-间质转化及细胞衰老凋亡。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

本发明的角膜内皮细胞分离和扩增培养液为含有胎牛血清，L-谷氨酰胺，庆大霉素，两性霉素B，碱性成纤维细胞生长因子bFGF，Y-27632和A-83-01的低糖DMEM细胞培养基。

作为优选，其中各组分的浓度如下：胎牛血清5％～10％，L-谷氨酰胺0.35～0.50mg/L,庆大霉素40～60mg/L,两性霉素B1～1.5mg/L,bFGF 1～4ng/L，Y-27632 8～15μmol/L,A-83-01 0.8～1.2μmol/L。

作为一种实施例的优选，各组分的浓度如下：胎牛血清5％，L-谷氨酰胺0.35mg/L,庆大霉素40mg/L,两性霉素B1mg/L,bFGF 1ng/L，Y-27632 8μmol/L,A-83-01 0.8μmol/L。

作为另一种实施例的优选，各组分的浓度如下：胎牛血清8％，L-谷氨酰胺0.40mg/L,庆大霉素50mg/L,两性霉素B1.25mg/L,bFGF 2ng/L，Y-27632 10μmol/L,A-83-01 1.0μmol/L。

作为再一种实施例的优选，各组分的浓度如下：胎牛血清10％，L-谷氨酰胺0.50mg/L,庆大霉素60mg/L,两性霉素B1.5mg/L,bFGF 4ng/L，Y-27632 15μmol/L,A-83-011.2μmol/L。

上述的培养液的制备方法如下：

1)配制低糖DMEM培养基：

取低糖DMEM培养基粉末加入注射用水溶解后，用Hepes调整PH值至7.2～7.4；过滤灭菌，配制得到低糖DMEM培养基；

2)在步骤1)的低糖DMEM培养基中加入胎牛血清，庆大霉素，两性霉素B，Y-27632和A-83-01；终浓度分别为5％～10％，40～60mg/L，1～1.5mg/L，8～15μmol/L，0.8～1.2μmol/L；

3)使用前，在步骤2)的培养基中加入L-谷氨酰胺和bFGF，并使L-谷氨酰胺和bFGF的终浓度分别为0.35～0.50mg/L和1～4ng/L。

本发明的兔角膜内皮细胞培养液用于兔角膜内皮细胞的分离培养。利用本发明的兔角膜内皮细胞培养液，可以实现兔角膜内皮细胞的高效分离以及大量扩增。此外，本发明的兔角膜内皮细胞培养液可以使得兔角膜内皮细胞在经过多次传代培养后，仍能够保持角膜内皮细胞的规则形态，表达角膜内皮细胞的标志物，避免因长期体外培养而导致的内皮-间质转化。

附图说明

图1：兔角膜内皮分离、扩增培养液对兔角膜内皮细胞形态影响图。

图2：兔角膜内皮分离、扩增培养液对兔角膜内皮细胞增殖能力的影响图。

图3：兔角膜内皮分离、扩增培养液对兔角膜内皮细胞标记物ZO-1表达的影响图。

图4：兔角膜内皮分离、扩增培养液对兔角膜内皮细胞标记物Na+/K+ATPase表达的影响图。

图5：兔角膜内皮分离、扩增培养液对兔角膜内皮细胞标记物N-cadherin表达的影响图。

具体实施方式

申请人针对兔角膜内皮细胞的体外培养中存在的问题，从培养兔角膜内皮细胞的增殖和活力检测角度对组分和配比进行筛选，从而促成了本发明。

下面通过实施例来具体说明本发明的内容：

实施例1

一种兔角膜内皮分离、扩增培养液，该角膜内皮分离、扩增培养液为含有胎牛血清，L-谷氨酰胺，庆大霉素，两性霉素B，bFGF，Y-27632二盐酸盐单水合物和A-83-01的低糖DMEM细胞培养基，其中各组分的浓度如下：胎牛血清5％，L-谷氨酰胺0.35mg/L,庆大霉素40mg/L,两性霉素B1mg/L,bFGF 1ng/L，Y-27632 8μmol/L,A-83-01 0.8μmol/L。

上述角膜内皮分离、扩增培养液的制备方法包括：

1)配制低糖DMEM培养基，按照低糖DMEM培养基的说明书，取低糖DMEM培养基粉末9.4g加入注射用水500ml,溶解后用Hepes调整PH值至7.2～7.4.过滤灭菌，配制得到低糖DMEM培养基。

2)向1)步骤所得低糖DMEM培养基中加入胎牛血清，L-谷氨酰胺，庆大霉素，两性霉素B，bFGF，Y-27632和A-83-01，使其终浓度分别为5％，40mg/L，1mg/L，8μmol/L，0.8μmol/L。即得所述之角膜内皮分离、扩增培养液。

实施例2

本实施例之中，所述角膜内皮分离、扩增培养液各组分的浓度如下：胎牛血清8％，L-谷氨酰胺0.40mg/L,庆大霉素50mg/L,两性霉素B1.25mg/L,bFGF 2ng/L，Y-27632 10μmol/L,A-83-01 1.0μmol/L。其余同实施例1。

实施例3

本实施例之中：所述角膜内皮分离、扩增培养液各组分的浓度如下：胎牛血清10％，L-谷氨酰胺0.50mg/L,庆大霉素60mg/L,两性霉素B1.5mg/L,bFGF 4ng/L，Y-27632 15μmol/L,A-83-01 1.2μmol/L。其余同实施例1。

上述实施例制备的培养液的应用效果描述如下：

步骤一：在无菌条件下，利用角膜内皮镊将兔角膜内皮及后弹力层轻轻撕下，利用维纳斯剪将角膜内皮层剪成4mm×4mm大小的小块，将上述小块置于预先包被IV型胶原的六孔板中，角膜内皮面朝下。按照500ul/孔体积，加入本发明实施例1制备的角膜内皮分离、扩增培养液，于5％CO₂，37摄氏度培养，如图1所示，培养72小时后，有大量的原代角膜内皮细胞从组织块中爬出。

步骤二，待原代角膜内皮细胞长满，利用含有EDTA的0.25％胰酶消化，按照1:8的比例进行传代。原代及第4代兔角膜内皮细胞生长状况见图1。如图1所示，经本发明优化的角膜内皮培养液培养的兔角膜内皮细胞在第4代仍保持规则六边形，排列紧密，符合典型的兔角膜内皮形态，而未经优化的对照培养液培养的角膜内皮细胞在传代1次后即表现出明显的内皮-间质分化现象。如图2所示，经本发明优化的角膜内皮培养液培养的兔角膜内皮细胞在第4代仍然可以保持良好的扩增效率，在接种后96小时后，细胞数量较对照培养的兔角膜内皮细胞数量增加了2-2.5倍(*P<0.01)。由此，证明了本发明的兔角膜内皮培养液可以促进兔角膜内皮细胞大量增殖。

步骤三，将第4代兔角膜内皮细胞按照3000/cm²细胞密度接种在猪的脱细胞角膜后弹力层上，加入本发明的角膜内皮分离、扩增培养液培养7天后，通过免疫荧光方法检测角膜内皮标记(ZO-1，N-cadherin，Na+/K+ATPase)，如图2-5所示，利用本发明的角膜内皮分离、扩增培养液培养的兔角膜内皮细胞可以在脱细胞角膜后弹力层上生长，细胞间形成紧密连接，表达兔角膜内皮细胞的标志物ZO-1，N-cadherin，Na+/K+ATPase，由此，证明了利用本发明的培养液扩增的兔角膜内皮细胞符合典型的角膜内皮细胞特征。

实施例2和实施例3制备的培养液的效果与培养液类似，证明本发明的培养液能有效的对兔角膜内皮进行分离和扩增培养。而且，实验结果表面，其它组分和配比的效果明显差于本发明制备的培养液。

Claims

1.一种培养液，其特征在于，所述的培养液为含有胎牛血清，L-谷氨酰胺，庆大霉素，两性霉素B，碱性成纤维细胞生长因子bFGF，Y-27632和A-83-01的低糖DMEM细胞培养基。

2.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述的培养液中各组分的浓度如下：胎牛血清5％～10％，L-谷氨酰胺0.35～0.50mg/L,庆大霉素40～60mg/L,两性霉素B1～1.5mg/L,bFGF 1～4ng/L，Y-27632 8～15μmol/L,A-83-01 0.8～1.2μmol/L。

3.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述的培养液中各组分的浓度如下：胎牛血清5％，L-谷氨酰胺0.35mg/L,庆大霉素40mg/L,两性霉素B1mg/L,bFGF 1ng/L，Y-27632 8μmol/L,A-83-01 0.8μmol/L。

4.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述的培养液中各组分的浓度如下：胎牛血清8％，L-谷氨酰胺0.40mg/L,庆大霉素50mg/L,两性霉素B1.25mg/L,bFGF 2ng/L，Y-27632 10μmol/L,A-83-01 1.0μmol/L。

5.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述的培养液中各组分的浓度如下：胎牛血清10％，L-谷氨酰胺0.50mg/L,庆大霉素60mg/L,两性霉素B1.5mg/L,bFGF 4ng/L，Y-27632 15μmol/L,A-83-01 1.2μmol/L。

6.权利要求1-5任一项所述培养液在兔角膜内皮细胞分离和扩增中的应用。

7.权利要求1所述的培养液的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包含如下的步骤：

1)配制低糖DMEM培养基：