CN106267364B - 一种海藻酸/pedot导电多孔支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海藻酸/PEDOT导电多孔支架及其制备方法。该支架材料由共价交联的海藻酸为基质，同时在其基质中原位聚合形成聚3,4‑乙烯二氧噻吩颗粒，赋予其导电特质。本发明采用一步成型制备该导电多孔支架材料，具有制备方法简单，组分均一可控的特点。形成的支架材料具有良好的导电特性和可控的力学性能，PEDOT组分的引入明显是提高了其对蛋白的吸附能力。更为重要的是，本发明的制备的多孔支架材料具有良好的生物相容性，能够支持多种细胞的粘附与生长，可调节干细胞向心肌细胞分化的能力，在心肌组织工程治疗心肌梗死的临床转化中具有潜在的应用前景。

Description

一种海藻酸/PEDOT导电多孔支架及其制备方法
技术领域
本发明属于组织工程生物材料制备技术领域。具体涉及一种海藻酸/PEDOT导电多孔支架及其制备方法。
背景技术
心血管病是危害人类健康及生命的主要疾患之一，其中以心肌梗死最为常见，我国心肌梗死发病率明显上升且呈现年轻化趋势。近年来的研究表明，以生物材料、种子细胞和生长因子为基本要素的心肌组织工程可在一定程度上修复受损心肌、恢复心功能，已经成为一种潜在的治疗心肌梗死的新方法。其中生物材料其非常关键的作用，可为受损心肌的修复提供必要的力学支撑，并为移植和宿主细胞的存活和增殖提供适宜的微环境。目前用于心肌组织工程的水凝胶主要包括，明胶、海藻酸钠、纤维蛋白、Matrigel和胶原等。上述材料制备的支架材料均可与多种细胞(例如，心肌细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞等)联合构建具有心肌修复功能的工程化心肌组织，用于修复受损心肌。尽管如此，在设计这些支架材料时没有考虑心肌的电活性本质，使其与宿主心肌之间的整合受到一定程度的影响。导电多孔支架是解决该问题的主要途径之一。
近年来，电导活性支架材料作为智能水凝胶家族的一员受到了人们广泛的关注，在生物传感器、药物释放、电活性开关装置以及组织工程中具有潜在的应用前景。特别是基于导电高分子的水凝胶及支架材料由于其优良的导电性能和生物相容性，受到越来越多的关注。但是，由于导电聚合物的溶解性能较差(聚吡咯和聚噻吩均不溶于水和大部分有机溶剂)，致使其形成水凝胶的能力较差，生物降解性以及与心肌修复的匹配性还有待进一步提高，使其在心肌组织工程中应用的受到一定的限制。为了改善这些缺点，研究学者们采用两步法制备了双网络导电水凝胶，该类水凝胶具有优良的导电特性，但是其制备过程复杂，更为重要的是导电高分子在双网络水凝胶中的分布不均且含量不容易控制，可操作性差。为了研制一种具有良好生物相容性、优良力学性能、导电特性的水凝胶多孔支架材料对心肌组织工程策略修复受损心肌具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工程化心肌组织构建用多孔导电支架材料。
本发明的目的还在于提供上述导电多孔支架材料的制备方法。
一种海藻酸/PEDOT导电多孔支架，该支架材料是以共价交联的海藻酸网络为基材，以及在海藻酸网络中原位形成的PEDOT颗粒组合而成，该支架中的海藻酸网络和PEDOT颗粒质量比为1:(1-10)。
上述海藻酸/PEDOT导电多孔支架的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)将海藻酸钠溶解到N-吗啉代乙磺酸-氯化钠的水溶液中，配制质量浓度为3％、4％、5％、6％和7％的海藻酸钠溶液，备用；
(2)在步骤(1)制备的海藻酸钠溶液中加入3,4-乙烯二氧噻吩单体，使3,4-乙烯二氧噻吩单体与海藻酸钠的质量比为(1-10)：1，用涡旋仪充分混匀，得到3,4-乙烯二氧噻吩/海藻酸钠的乳状液，备用。
(3)根据海藻酸钠的羧基含量向步骤(2)制备的混合液中其中加入己二酸二酰肼，使ADH：COO-的物质的量比为0.5:1，充分溶解后，再在其中加入EDC、NHS和过硫酸铵，其中EDC：NHS：COO-的摩尔比为1:0.5:1，而过硫酸铵的加入量为EDOT单体质量的两倍，利用漩涡震荡充分混匀后，将混合溶液倒入到四氟乙烯模具中，室温放置1-3h后，形成海藻酸/PEDOT水凝胶；
(4)将步骤(3)制备的水凝胶浸泡在去离子水、乙醇及去离子水中依次浸泡4-5小时；
(5)将步骤(4)处理过的水凝胶置于-45℃冰箱中预冻12小时以上，然后将其置于冻干机中冷冻干燥48h，获得海藻酸/PEDOT导电多孔支架。
所述海藻酸/PEDOT导电多孔支架的电导率为1-6×10-2S·cm-1。
上述的海藻酸/PEDOT导电多孔支架的用途，所述海藻酸/PEDOT导电多孔支架支持细胞的粘附和生长，并能促进棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明制备的多孔导电支架材料通过同步原位聚合和化学交联的方式制备，该制备方法免除了有机溶剂的参与，具有一定的环境友好性，减少了由于合成过程而造成的支架生物相容性降低的缺点。PEDOT的引入明显增强了支架的导电特性，其疏水性本质使其蛋白吸附能力得到明显增强。制备的多孔支架具有合适的孔隙率，孔径在100-200μm之间。本发明的制备的导电多孔支架具有良好的生物相容性，能够支持多种细胞的粘附与生长。特别是可以促进棕色脂肪来源的间充质干细胞向心肌细胞分化，电刺激可促进这种促进效果。该方法制备的生物医用导电多孔支架材料在心肌组织工程中具有良好的应用前景。
附图说明
图1不同PEDOT/海藻酸比例的多孔支架的扫描电镜照片：PEDOT/海藻酸比例为(a)7:3,(b)4:6,(c)5:5,(d)6:4,(e)7:3and(f)0:10。
图2BADSCs在支架材料中的增殖行为PEDOT/Alg1,3,5分别为PEDOT/Alg比例为7:3,5:5和3:7，Alg为纯海藻酸支架。
图3BADSCs在支架材料中心肌特异性cTnT蛋白表达；(A)(D)为PEDOT/海藻酸比例为7:3，(B)(E)为PEDOT/海藻酸比例为5:5，(C)(F)为PEDOT/海藻酸比例为3:7。ES-：为不施加电刺激，ES+：施加电刺激。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施所用的主要原料为海藻酸钠、3,4-乙烯二氧噻吩、过硫酸铵、碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-吗啉代乙磺酸、己二酸二酰肼(ADH)等均为化学纯。
实施例1PEDOT/海藻酸比例为5:5的多孔支架制备
(1)称取50mg的海藻酸钠，溶于1ml N-吗啉代乙磺酸-氯化钠的水溶液中，充分溶解，备用。
(2)在步骤(1)制备的海藻酸钠溶液中加入50mg的3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)单体，用涡旋仪充分混匀，得到EDOT/海藻酸钠的乳状液，备用。
(3)根据海藻酸钠的羧基含量向步骤(2)制备的混合液中其中加入20.2mg的己二酸二酰肼(ADH)。充分溶解后，再在其中依次加入44.3mg EDC、11.3mg NHS和100mg过硫酸铵。利用漩涡震荡充分混匀后，将混合溶液倒入到四氟乙烯模具中，室温放置1后，形成海藻酸/PEDOT水凝胶。
(4)将步骤(3)制备的水凝胶浸泡在去离子水、乙醇及去离子水中依次浸泡4小时。
(5)将步骤(4)处理过的水凝胶置于低温冰箱中(-45℃)预冻12小时以上，然后将其置于冻干机中冷冻干燥48h，获得海藻酸/PEDOT质量比为5:5的导电多孔支架。
实施例2PEDOT/海藻酸比例为7:3的多孔支架制备
(1)称取30mg的海藻酸钠，溶于1ml N-吗啉代乙磺酸-氯化钠的水溶液中，充分溶解，备用。
(2)在步骤(1)制备的海藻酸钠溶液中加入70mg的3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)单体，用涡旋仪充分混匀，得到EDOT/海藻酸钠的乳状液，备用。
(3)根据海藻酸钠的羧基含量向步骤(2)制备的混合液中其中加入12.1mg的己二酸二酰肼(ADH)。充分溶解后，再在其中依次加入26.6mg EDC、7.98mg NHS和140mg过硫酸铵。利用漩涡震荡充分混匀后，将混合溶液倒入到四氟乙烯模具中，室温放置1后，形成海藻酸/PEDOT水凝胶。
(4)将步骤(3)制备的水凝胶浸泡在去离子水、乙醇及去离子水中依次浸泡4小时。
(5)将步骤(4)处理过的水凝胶置于低温冰箱中(-45℃)预冻12小时以上，然后将其置于冻干机中冷冻干燥48h，获得PEDOT/海藻酸质量比为7:3的导电多孔支架，该支架具有良好的空间结构(图1)。
实施例3导电多孔支架材料的生物相容性实验
(1)将支架裁剪成直径为10mm，厚度为2mm的薄片，Co60辐射灭菌，备用。
(2)将6×105棕色脂肪干细胞BADSCs种植多孔支架材料中，在37℃，5％CO2条件下培养，1，4，7和10天时，在其中加入含10％染液的无酚红培养基，孵育12h，设置空孔板加染液为对照组。将染液吸出用酶标仪检测其在570nm和610nm处的吸光度值。计算还原率表征细胞活力(如图2所示)。
实施例4导电多孔支架材料对BADSCs向心肌细胞分化的调控作用实验
(1)将支架裁剪成直径为10mm，厚度为2mm的薄片，Co60辐射灭菌，备用。
(2)将6×105棕色脂肪干细胞BADSCs种植多孔支架材料中，在37℃，5％CO2条件下培养，在施加和不施加电刺激的条件下。电刺激参数为电压1V，频率1Hz。
(3)培养10天时，切片且进行cTnT免疫荧光染色。结果发现该支架材料能够促进BADSCs向心肌细胞分化，电刺激可明显增强该效果(图3)。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (3)

1.海藻酸/PEDOT导电多孔支架的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)将海藻酸钠溶解到N-吗啉代乙磺酸-氯化钠的水溶液中，配制质量浓度为3％、4％、5％、6％和7％的海藻酸钠溶液，备用；
(2)在步骤(1)制备的海藻酸钠溶液中加入3,4-乙烯二氧噻吩单体，使3,4-乙烯二氧噻吩单体与海藻酸钠的质量比为(1-10)：1，用涡旋仪充分混匀，得到3,4-乙烯二氧噻吩/海藻酸钠的乳状液，备用；
(3)根据海藻酸钠的羧基含量向步骤(2)制备的混合液中加入己二酸二酰肼，使ADH：COO-的物质的量比为0.5:1，充分溶解后，再在其中加入EDC、NHS和过硫酸铵，其中EDC：NHS：COO-的摩尔比为1:0.5:1，而过硫酸铵的加入量为EDOT单体质量的两倍，利用漩涡震荡充分混匀后，将混合溶液倒入到四氟乙烯模具中，室温放置1-3h后，形成海藻酸/PEDOT水凝胶；
(4)将步骤(3)制备的水凝胶依次浸泡在去离子水、乙醇及去离子水中，每次浸泡4-5小时；
(5)将步骤(4)处理过的水凝胶置于-45℃冰箱中预冻12小时以上，然后将其置于冻干机中冷冻干燥48h，获得海藻酸/PEDOT导电多孔支架。
2.根据权利要求1所述海藻酸/PEDOT导电多孔支架的制备方法，其特征在于，所述海藻酸/PEDOT导电多孔支架的电导率为1-6×10-2S·cm-1。
3.权利要求1所述制备方法制得的海藻酸/PEDOT导电多孔支架的用途，其特征在于，所述海藻酸/PEDOT导电多孔支架支持细胞的粘附和生长，并能促进棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化。
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