CN106267173A - 一种Cu/Zn SOD纳米颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种热加工方法生成的自组装Cu/Zn SOD纳米颗粒及其制备方法与应用。制备得到Cu/Zn SOD纳米颗粒平均粒径范围为30~300 nm，表面电荷范围在‑10~‑30 mV。Cu/Zn SOD纳米颗粒冻干品的复溶性好，易于稳定保存。本发明涉及的Cu/Zn SOD来源于食品原料，安全性高，抗氧化性优良。其纳米颗粒的制备方法不涉及任何交联剂，且用到的还原糖属于食品原料，为广大人群食用，安全性高。本发明涉及的Cu/Zn SOD纳米颗粒有望应用于清除自由基，防止氧化应激造成的各种疾病或者亚健康状态。
Description
技术领域
本发明涉及食品与医药技术领域中的蛋白质新剂型和制剂技术，具体涉及到一种具有体内抗氧化作用的Cu/Zn SOD自组装纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是专一清除体内自由基的酶，在人体抗氧化系统中发挥重要的作用。SOD可用于治疗由氧自由基异常增高引起的各种疾病，如类风湿性关节炎、自身免疫性疾病、心肌缺血和缺血再灌流综合症、心血管疾病、辐射病、癌症等，并已经取得了显著的疗效。然而我国药用SOD尚在临床试用中。SOD临床应用受到限制的原因有：体内半衰期短，具有免疫原性，产生致敏性，易酶解失活，贮存过程中不稳定等。为克服局限，研究学者对SOD分子的修饰、改造等方面的技术虽然已取得了无数的成果，但是由于天然SOD本身的理化性质所限，故改善SOD特性的新方法需要进一步的研究探索。
纳米技术在社会各界备受关注，同时，纳米材料的制备与应用也随着纳米科技的不断发展而发展。纳米颗粒是纳米材料之一，一般认为无机物和金属的粒径在1-100 nm范围内的颗粒称为纳米颗粒；有机物和聚合物的粒径在1000 nm以下的颗粒称为纳米颗粒。由于纳米颗粒粒径小，具有特定优势，如：比表面积大、反应活性增加、胃停留时间以及渗透率增加，易溶于水和有机相等，目前已经广泛应用于食品、医药、美容、化工等领域。
目前蛋白纳米材料的制备方法主要有三种：一是动态超高压均质法，如涂宗财等采用动态超高压均质法制备了大豆纳米蛋白，但该方法成本高且容易造成蛋白质机械损伤。二是反溶剂法，Gülseren, Y等人和Ji等使用乙醇作为反溶剂制备了乳清蛋白纳米颗粒；任晓鸣等采用超临界CO2反溶剂法制备大豆异黄酮-玉米醇溶蛋白复合纳米颗粒，但有机溶剂多数有毒，或在蛋白表面有残留。三是乳化法，杜青等以牛血清白蛋白(BSA)为模型药物，使用一种新型载药微球的水包油固体乳化法制备得到粒径约为30 nm的含药粒子，但是乳化剂易残留损害蛋白质品质。以上三种方法都需要采用多种试剂且操作都比较复杂。
目前还没有关于自组装而成的SOD纳米颗粒的制备与研究的相关报道，本发明选用Cu/Zn SOD、葡萄糖等还原糖为原料，采用热加工方式，制备Cu/Zn SOD纳米颗粒。纳米颗粒平均粒径范围为30-300 nm，特别是80-200nm；表面电荷呈负性，范围在-10 ~ -30mV。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Cu/Zn SOD纳米颗粒及其制备方法。考虑到应用的安全问题，本发明涉及的Cu/Zn SOD纳米颗粒的设计从两个“天然”体系出发：一是Cu/Zn SOD和葡萄糖等还原糖分别属于自然界普遍存在的蛋白质和糖类物质，二是该蛋白质的纳米化过程发生在热加工过程。本发明得到的Cu/Zn SOD纳米颗粒表面规则，粒径分布均匀，热稳定性及保存稳定性良好。
为实现上述目的，本发明可以采用如下技术方案：
一种Cu/Zn SOD纳米颗粒，所述的Cu/Zn SOD纳米颗粒原料组成为：还原糖与Cu/Zn SOD的摩尔比为0.1:1-6:1。
所述Cu/Zn SOD纳米颗粒平均粒径范围为30-300 nm，特别是80-200nm；表面电荷呈负性，范围在-10 ~ -30mV。
所述还原糖为葡萄糖。
Cu/Zn SOD纳米颗粒的制备方法，取Cu/Zn SOD粉剂于锥形瓶中，加入蒸馏水使之完全溶解；然后往锥形瓶中加入葡萄糖，使SOD与葡萄糖的摩尔比为0.1:1-6:1，溶解后于30-60℃下水浴保温0-120 min，再置于水浴锅中70-100 ℃水浴保温40-120 min，即得到Cu/Zn SOD纳米颗粒。
所述的Cu/Zn SOD纳米颗粒在去除自由基的药品或食品中的应用。
所述的Cu/Zn SOD纳米颗粒在降血糖的药品或者食品中的应用，其特征在于：作为辅助降血糖食品或者药品时，使用剂量范围为3万~100万酶活力单位/天；1~3天给药一次。
一种Cu/Zn SOD蛋白纳米颗粒，由牛血Cu/Zn SOD和葡萄糖经过热加工方式产生，该纳米颗粒其酶活力范围为1000 ~ 20000 U/mL，平均粒径为30~300 nm，表面电荷呈负性，范围在-10 ~ -30mV。
所述的Cu/Zn SOD纳米颗粒的制备方法（以葡萄糖和Cu/Zn SOD物质量之比1:1为例）包括：称取Cu/Zn SOD冻干粉32 mg于100mL锥形瓶中，加入32 mL蒸馏水使之完全溶解。然后往锥形瓶中加入葡萄糖 0.36 mg，使SOD与葡萄糖的摩尔比为1:1，溶解后于60℃下水浴保温60 min，再置于水浴锅中100 ℃水浴保温60 min，即可得到Cu/Zn SOD纳米颗粒。采用盐酸羟胺法、动态光散射技术、激光多普勒电泳和场发射电子扫描显微镜对Cu/Zn SOD纳米颗粒进行性质研究。实验制备得到的Cu/Zn SOD纳米颗粒其酶活力范围为1000 ~ 20000U/mL，平均粒径为30 ~ 300 nm，表面电荷呈负性，范围在-10 ~ -30mV。
本发明的优点在于：本发明涉及的Cu/Zn SOD和葡萄糖等还原糖来源于食品原料，安全性高。其纳米颗粒的制备方法不涉及任何交联剂，安全性高。本发明得到的Cu/Zn SOD纳米颗粒具有活性，表面规则，粒径分布均匀，稳定性好。涉及的Cu/Zn SOD纳米颗粒有望应用于清除自由基，防止氧化应激造成的各种疾病或者亚健康状态。
附图说明
图1 Cu/Zn SOD纳米颗粒的电镜观察图。
图2 Cu/Zn SOD纳米颗粒粒径分布图。
图3 Cu/Zn SOD纳米颗粒酶活变化图。
图4 Cu/Zn SOD纳米颗粒粒径分布变化图。
图5 Cu/Zn SOD纳米颗粒Zeta电位变化图。
图6 Cu/Zn SOD纳米颗粒对百草枯刺激的Hep-G2细胞存活率的影响。#为纳米SOD各组与天然SOD的配对t检验， #为显著性差异，p<0.05；##为极显著性差异，p<0.01，n=5。
图7 Hep-G2细胞形态学观察。
图8 Cu/Zn SOD纳米颗粒（G-SOD）干预30天后I型糖尿病模型大鼠血糖的变化情况图。
图9 Cu/Zn SOD纳米颗粒（G-SOD）干预30天、60天后Ⅱ型糖尿病模型大鼠血糖的变化图。
图10 Cu/Zn SOD纳米颗粒（G-SOD）干预60天Ⅱ型糖尿病大鼠口服糖耐量（OGTT）的变化曲线。
具体实施方式
实施例1 ：Cu/Zn SOD纳米颗粒的制备
称取Cu/Zn SOD冻干粉32 mg于100mL锥形瓶中，并加入32 mL蒸馏水使之完全溶解。然后往锥形瓶中加入葡萄糖 0.36 mg，使SOD与葡萄糖的摩尔比为1:1，溶解后于60℃下水浴保温60 min，再置于水浴锅中100 ℃水浴保温60 min，即可得到Cu/Zn SOD纳米颗粒。Cu/ZnSOD纳米颗粒电镜观察图见附图1。用激光粒度仪测定其粒径及表面电位，测得粒径为175.86±0.71nm，表面电位范围在-17.27±0.59mV。Cu/Zn SOD纳米颗粒粒度分布图见附图2。纳米颗粒其酶活力为1102.98±31.37U/mL。
自样品制备后，在一定期间内连续测定样品的酶活力、粒径、Zeta电位，通过样品酶活力保留情况、粒径变化和电位变化来表征纳米颗粒保存的稳定性。4℃冰箱保存过程中，Cu/Zn SOD纳米颗粒酶活变化见附图3，粒度变化见附图4，Zeta电位变化见附图5。
实施例2 ：制备方法及颗粒特征2
称取Cu/Zn SOD冻干粉64 mg于100mL锥形瓶中，并加入64mL蒸馏水使之完全溶解。然后往锥形瓶中加入葡萄糖 0.72 mg，使SOD与葡萄糖的摩尔比为1:1，溶解后于60℃下水浴保温60 min，再置于水浴锅中75 ℃水浴保温60 min，即可得到Cu/Zn SOD纳米颗粒。用激光粒度仪测定其粒径及表面电位，测得粒径为168.8±0.6 nm，表面电荷范围在-13.66±0.55mV，纳米颗粒其酶活力为22542.9±879.1 U/mL。
实施例3 ：制备方法及颗粒特征3
称取适量Cu/Zn SOD冻干粉与果糖，使二者的摩尔比为1:1，溶解后于60℃下水浴保温60 min，再置于水浴锅中75 ℃水浴保温60 min，即可得到Cu/Zn SOD纳米颗粒。用激光粒度仪测定其粒径及表面电位，测得粒径为94.78±0.91nm，表面电荷范围在-24.34±0.28 mV，纳米颗粒其酶活力为25332.67±736.51U/mL。
实施例4 ：应用于细胞的抗氧化情况
以Hep-G2细胞为模型，通过百草枯（PQ）刺激和两种SOD（Cu/Zn SOD纳米颗粒、天然SOD）的作用，测定肝癌细胞最终存活率，探究不同浓度的Cu/Zn SOD纳米颗粒（标注为G-SOD）、天然SOD（标注为SOD）对Hep-G2细胞氧化应激的影响，生化分析结果见附图6；倒置显微镜下观察对照组和各加药组细胞形态变化，结果见附图7。
结果显示在一定浓度范围内G-SOD即Cu/Zn SOD纳米颗粒对百草枯刺激的细胞的修复作用比天然SOD强，且生化分析结果与形态学观测结果一致。
实施例5 ：应用于I型糖尿病模型鼠的降血糖情况
采用尾尖静脉注射40mg/kg Alloxan诱导Ⅰ型糖尿病大鼠，随机挑选6只为正常对照组，其余造模成功的36只大鼠随机分为6组，每组6只，药物干预30天。阳性对照组灌胃10mg/kg盐酸二甲双胍；SOD纳米颗粒组（G-SOD组）分为G-SOD（高剂量）、G-SOD（中剂量）、G-SOD（低剂量）三组，其剂量分别30000 U/天Kg、10000 U/天Kg和3000U/天Kg。SOD组灌胃天然SOD溶液，剂量与G-SOD（中）相等；模型组和正常对照组灌胃等量生理盐水。药物干预30天前后血糖监测结果见附图8。
结果显示：各药物干预组在血糖控制方面均有一定的作用，且血糖值均显著低于模型组（P ＜0.01），G-SOD组在血糖控制方面呈剂量依赖性（P ＜0.01），同等剂量的G-SOD（中剂量）组血糖控制好于SOD组（P ＜0.05）。
实施例6 ：应用于Ⅱ型糖尿病模型鼠的降血糖情况
用于Ⅱ型糖尿病的实验大鼠随机挑选9只为正常对照组，用普通饲料喂养，其余54只用高糖高脂饲料喂养30天后，腹腔注射STZ溶液，将造模成功糖尿病大鼠随机分为6组，每组9只。给药情况同实施例5。药物干预30天、60天前后血糖监测结果见附图9，口服糖耐量（OGTT）结果见附图10。
结果显示：各药物干预组均一定程度降低了糖尿病大鼠血糖，且最终血糖值均极显著低于模型组。G-SOD（高剂量）、（中剂量）、（低剂量）组间均存在显著差异（P ＜0.05）。说明对于Ⅱ型糖尿病，G-SOD和SOD都发挥了良好的血糖控制作用，并且呈现剂量效应，但同等剂量的G-SOD（中剂量）组血糖控制好于SOD组（P ＜0.05）。
实施例7 ：制备方法及颗粒特征4
称取Cu/Zn SOD冻干粉64 mg于100mL锥形瓶中，并加入64mL蒸馏水使之完全溶解。于60℃下水浴保温60 min，再置于水浴锅中75 ℃水浴保温60 min，即可得到Cu/Zn SOD纳米颗粒。用激光粒度仪测定其粒径及表面电位，测得粒径为173.07±1.33 nm，表面电荷范围在-19.3±0.75 mV。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种Cu/Zn SOD纳米颗粒，其特征在于：所述的Cu/Zn SOD纳米颗粒是热加工方法生成的自组装纳米颗粒；在液体中的平均粒径范围为30—300 nm； 表面电荷呈负性，范围在-10 — -30mV。
2. 根据权利要求1所述的一种Cu/Zn SOD纳米颗粒，其特征在于：所述的Cu/Zn SOD纳米颗粒的生产原料中还加入还原糖组分。
3.根据权利要求2所述的一种Cu/Zn SOD纳米颗粒，其特征在于：还原糖组分与Cu/ZnSOD的物质的量之比为0.1:1—6:1。
4.根据权利要求2所述的一种Cu/Zn SOD纳米颗粒，其特征在于：所述还原糖为葡萄糖。
5.一种如权利要求1所述的Cu/Zn SOD纳米颗粒的制备方法，其特征在于：取Cu/Zn SOD粉剂于锥形瓶中，加入蒸馏水使之完全溶解；然后往锥形瓶中加入葡萄糖，使SOD与葡萄糖的摩尔比为0.1:1-6:1，溶解后于30-60℃下水浴保温0-120 min，再置于水浴锅中70-100℃水浴保温40-120 min，即得到Cu/Zn SOD纳米颗粒。
6.权利要求1所述的Cu/Zn SOD纳米颗粒在去除自由基的药品或食品中的应用。
7.权利要求1所述的Cu/Zn SOD纳米颗粒在降血糖的药品或者食品中的应用，其特征在于：作为辅助降血糖食品或者药品时，使用剂量范围为3万~100万酶活力单位/天；1~3天给药一次。
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