CN106265611A - 异甘草素的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及异甘草素的新用途，具体涉及异甘草素在制备改善或治疗银屑病的药物中的应用；以及在制备改善或治疗银屑病引起的皮肤角化不全与过度现象、棘层变厚、炎性细胞浸润的药物中的应用；以及在制备抑制NF-κB、p-NF-κB表达水平的药物中的应用；以及甘草素在制备改善或治疗自身免疫疾病的药物中的应用。

Description

异甘草素的新用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及异甘草素的新用途。

背景技术

甘草，拉丁学名Glycyrrhiza uralensis Fisch，别名甜草根、红甘草等，为豆科多年生草本植物，在中国、俄罗斯、埃及、希腊等国的干旱与半干旱地域具有广泛分布。甘草根可入药，具有多种有效化学成分，是一种古老的，具有4000年应用历史的药用植物。对甘草提取物的分析，最早的报道可见Trubek M于1900年发表在杂志Journel of the american chemical society上的论文，Trubek在文中指出了甘草提取物的大概组成。甘草主要成分为甘草甜素、甘草次酸与甘草苷，对其药理学作用进行研究后发现，三种化合物均具有较强的抗炎、抗病毒与激素样作用，对治疗病毒性肝炎、HIV感染，SARS等疾病具有一定的疗效。随后，科学家分别对甘草提取物中的固体粉末进行了研究，从中分离出了黄酮类、异黄酮类化合物。

异甘草素，Isoliquiritigenin，简称ISL，化学名为2,4,4-三羟基查耳酮，英文名为2′,4′,4-trihydroxychalcone，是一种从甘草中提取出的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等多种药理学活性。

银屑病(Psoriasis)，俗称牛皮癣，是一种最为常见的皮肤自身免疫疾病。不同于其俗称，银屑病并非由于细菌或真菌感染而引起，而是由于局部皮肤组织中免疫系统失调，免疫细胞与炎症因子过度激活所导致，病理学表现为皮肤局部凸起的红色丘疹、皮屑伴有瘙痒感，病变部位可见过度增生的角质细胞、角质层增厚、棘层增厚、局部血管增生与炎性细胞大量浸润，血清学分析可见异常升高的IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-27与IL-23等细胞因子。银屑病发病率因人种与地域的不同而不一，总发病率占世界人口的2％左右。在西方白种人群中，银屑病发病率最高可到3％，在亚洲人群中发病率较低，为0.2-0.5％。在我国，银屑病的发病率呈逐年上升的趋势。1984年我国银屑病发病率约1.23‰，而2010年流行病学调查发现，银屑病在我国发病率已上升至5.9‰，每年新增患病人群10万人左右，增速迅猛，并且还有增长的趋势。

银屑病病因复杂，其病因和发病机制尚不明确。目前普遍研究认为银屑病是多基因遗传因素与环境因素共同作用所导致的自身免疫性疾病。银屑病与细胞免疫，尤其与T细胞功能异常密切相关。异常的T细胞功能导致继发性的表皮角质形成细胞(KC细胞)过度增生，病变部位局部血管增生、通透性增加。同时，分子病理学研究表明，银屑病皮损处细胞因子如IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IL-23等特异性募集，细胞黏附因子如ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1等增高，KC细胞中信号通路分子如STAT3、STAT5等磷酸化程度增加。上述一系列分子病理变化，最终导致银屑病病程进展。银屑病易复发，难治愈。传统治疗药物如甲氨蝶呤、环孢菌素A和激素类药物属于免疫抑制剂，毒副作用大；新型单抗类药物如英利昔单抗、阿发西普、依法利珠单抗等虽然毒副作用小，但需静脉给药且价格昂贵。由于多数银屑病患者需要长期给药，因此现有的治疗药物不仅存在免疫系统抑制的巨大副作用，并且由于价格较贵，给患者带来了较大的经济负担。因此，寻找开发低毒性、给药途径便利且廉价的 治疗药物具有重要的意义。

尚未见将异甘草素应用于治疗或改善银屑病及其相关症状的报道。

发明内容

本发明所解决的第一个技术问题是提供异甘草素新的药用用途。

具体的，本发明提供异甘草素在制备改善或治疗银屑病的药物中的应用。

发明人采用了两种国际公认的银屑病小鼠模型作为实验对象：K14/VEGF转基因小鼠与咪喹莫特软膏涂抹法银屑病Babl/c小鼠模型，使用腹腔注射与耳朵涂抹给药两种给药途径，给予小鼠不同剂量的异甘草素，发现采用异甘草素可使得皮肤角化不全与过度现象降低、棘层变薄、炎性细胞浸润降低。qPCR、WB与ELISA检测结果发现，异甘草素能够降低两种银屑病样细胞中NF-κB与p-NF-κB表达。使用银屑病体外细胞模型HaCaT与NHEK测试异甘草素对细胞的生长抑制试验中发现，异甘草素抑制上述两种细胞具有时间与浓度依赖性。双荧光素酶报告基因系统实验结果表明，异甘草素可能具有抑制NF-κB启动子的活性，从而起到抑制NF-κB表达的作用。

由上述发现，本发明提供的技术方案如下：

进一步的，异甘草素在制备改善或治疗银屑病引起的皮肤角化不全与过度现象、棘层变厚、炎性细胞浸润的药物中的应用。

进一步的，异甘草素在制备抑制NF-κB、p-NF-κB表达水平的药物中的应用。

进一步的，异甘草素应用时可采用外用、口服或注射等用药途径，即相应的，可制成外用制剂，口服制剂或注射制剂使用。

本发明所解决的第二个技术问题是，利用上述发现提供了如下两种改善或治疗银屑病的药物组合物，分别是；

1)以有效量的异甘草素为主要活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

2)以有效量的异甘草素和可治疗银屑病的药物为主要活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

其中，所述可治疗银屑病的药物为甲氨蝶呤、环磷酰胺、糖皮质激素等。

应用时，所述的制剂是外用制剂、注射剂或口服制剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备；采用的可接受的辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

本发明所解决的第三个技术问题是提供异甘草素在制备改善或治疗自身免疫疾病的药物中的应用。

自身免疫疾病(autoimmune diseases)，是指机体对自身抗原发生免疫反应，从而导致机体自身组织损伤而引起的一类疾病。利用异甘草素可以抑制核转录因子κB(NF-kB)的特性，可以将异甘草素应用于已知与NF-κB有关的免疫疾病的治疗或改善，包括类风湿关节炎、动脉硬化、多发性硬化症、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经炎、哮喘、感染性骨炎、系统性炎症反应综合征。

本发明发现异甘草素对于两种银屑病动物模型具有良好的治疗效果，且能够降低动物血清中多种白细胞介素的水平；不同给药途径对于治疗银屑病都具有良好的治疗效果。细胞实 验中，异甘草素不仅能够显著抑制两种银屑病体外模型的生长，并且通过抑制细胞中NF-κB信号通路，发挥抑制IL-6与IL-8表达的作用。而且，异甘草素对正常角质细胞与动物分泌IL-6与IL-8的能力没有抑制作用，这说明异甘草素是一种较低毒性的NF-κB抑制剂，为临床应用异甘草素改善或治疗自身免疫疾病，尤其是银屑病提供了一种全新的选择。

附图说明

图1A使用不同浓度的异甘草素腹腔注射给药，治疗K14/VEGF转基因小鼠银屑病模型。

图1B小鼠耳朵组织石蜡包埋切片，使用HE染色观察耳朵皮肤角质层、表皮层、棘层以及真皮层细胞增生变化。

图1C不同给药方式给予K14/VEGF模型ISL治疗，评价疗效。

图1D使用HE染色观察耳朵皮肤角质层、表皮层、棘层以及真皮层细胞增生变化。

图1E ISL治疗K14/VEGF疗效具有时间依赖性。

图2A使用异甘草素治疗咪喹莫特小鼠银屑病模型治疗效果观察。

图2B小鼠皮肤组织石蜡包埋切片，使用HE染色观察皮肤角质层、表皮层、棘层以及真皮层细胞增生变化。

图3A使用Baker评分系统分别对两种银屑病小鼠模型耳部HE切片进行病理学评分。

图3B使用ELISA法，分别检测两种银屑病小鼠模型给予不同剂量异甘草素后，各组血清中白细胞介素6及白细胞介素8含量变化。

图3C免疫组化法检测小鼠皮肤中CD4与CD8分子表达变化。

图3D免疫组化法检测小鼠皮肤中CD11b、F480与VEGF分子表达变化。

图3E免疫组化法检测小鼠皮肤中NF-κB表达变化(统计学分析，***，P＜0.001)。

图4使用异甘草素治疗K14/VEGF小鼠后，血清中IL-2、IL-6、IL-8与IL-12表达变化(统计学分析，***，P＜0.001)。

图5A免疫组化法检测小鼠皮肤中CD4与CD8分子表达变化。

图5B免疫组化法检测小鼠皮肤中CD11b、F480与VEGF分子表达变化。

图5C使用Baker评分系统分别对两种银屑病小鼠模型耳部HE切片进行病理学评分。

图5D使用ELISA法，分别检测两种银屑病小鼠模型给予不同剂量异甘草素后，各组血清中白细胞介素6及白细胞介素8含量变化。

图5E免疫组化法检测小鼠皮肤中NF-κB表达变化(统计学分析，***，P＜0.001)。

图6a使用ISL治疗咪喹莫特小鼠模型后，耳朵疗效观察。

图6b小鼠耳朵组织石蜡包埋切片，使用HE染色观察耳朵皮肤角质层、表皮层、棘层以及真皮层细胞增生变化。

图6c免疫组化法检测小鼠耳朵中CD4、CD11b、F480与CD8分子表达变化。

图6d免疫组化法检测小鼠耳朵中VEGF与NF-κB分子表达变化。

图6e使用ELISA法检测咪喹莫特银屑病小鼠模型各组血清中白细胞介素4及白细胞介素23含量变化。

图7a Western Blotting法检测不同浓度异甘草素治疗K14/VEGF小鼠银屑病模型后，小鼠耳部组织中NF-κB信号通路表达变化，柱状图为WB条带灰度分析结果。

图7b Western Blotting法检测不同浓度异甘草素治疗咪喹莫特涂抹建模小鼠银屑病模型后，小鼠皮肤组织中NF-κB信号通路表达变化，柱状图为WB条带灰度分析结果。

图8Western Blotting法检测咪喹莫特银屑病动物模型耳部组织中NF-κB信号通路在不同浓度异甘草素治疗后的表达变化情况。

图9AHPLC检测异甘草素峰图，纯度为99.8％。

图9B使用已知浓度异甘草素标准品，HPLC检测不同浓度异甘草素峰面积，绘制标准曲线。

图10异甘草素对HaCaT及NHEK两种人角质上皮细胞体外银屑病模型的生长抑制作用测定。

图11不同浓度异甘草素作用HaCaT及NHEK两种人角质上皮细胞体外银屑病模型24小时后，细胞生长情况变化。

图12A使用ELISA法测定M5因子诱导HaCaT及NHEK两种人角质上皮细胞前后，细胞白细胞介素6与8分泌情况变化与细胞中NF-κB表达变化情况。

图12B不同浓度异甘草素对HaCaT及NHEK两种人角质上皮细胞体外银屑病模型分泌白细胞介素6与8具有抑制作用，对正常HaCaT及NHEK细胞分泌白细胞介素6与8未见明显影响。

图13A使用ELISA法测定不同浓度异甘草素对HaCaT分泌白细胞介素6与8具有抑制作用，对正常HaCaT细胞分泌白细胞介素6与8未见明显影响。

图13B使用ELISA法测定不同浓度异甘草素对NHEK细胞体外银屑病模型分泌白细胞介素6与8具有抑制作用，对正常NHEK细胞分泌白细胞介素6与8未见明显影响。

图14AReal-Time PCR分析中NF-κB信号蛋白转录活性。

图14B Western Blotting法检测HaCaT及NHEK细胞中，NF-κB信号通路活性变化。

图14C柱状图为对14B图中Western Blotting条带灰度分析结果。

图15A使用ELISA法检测过表达与抑制NF-κB后，HaCaT细胞系分泌白细胞介素6与8变化。

图15B Western Blotting法检测过表达与抑制NF-κB后，HaCaT细胞系中NF-κB信号通路活性变化，B图中柱状图为对B图中Western Blotting条带灰度分析结果。

图16A使用ELISA法检测异甘草素对不同因子诱导后的HaCaT细胞系分泌白细胞介素6与8能力的影响。

图16B使用Western Blotting法检测不同因子诱导后，HaCaT细胞系中NF-κB信号通路表达变化。

图17使用双荧光素酶报告基因系统，检测不同浓度异甘草素对NF-κB启动子区活性的影响。

图18ELISA标准品稀释比例示意图。

图19皮肤透过率测试渗透池示意图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说 明但不限制本发明。

1异甘草素能够有效缓解银屑病动物模型疾病进程

1.1异甘草素对两种银屑病动物模型具有治疗作用

1)动物模型的建立：

K14/VEGF转基因小鼠：K14/VEGF转基因小鼠是使用人角蛋白14的启动子序列作为控制序列，在小鼠表皮基底层细胞中特异性表达小鼠VEGF-A164蛋白，从而使小鼠耳部及背部皮肤发生银屑病样变。本实验所用K14/VEGF小鼠均购自美国杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)，并饲养于四川大学生物治疗国家重点实验室动物中心恒温、恒湿与空气全循环过滤环境中，饲养方法参照四川大学华西医院动物伦理管理委员会要求进行。

正常Babl/c品系小鼠咪喹莫特涂抹建模银屑病模型：6-8周Babl/c小鼠购自北京华阜康公司，并饲养于四川大学生物治疗国家重点实验室动物中心恒温、恒湿与空气全循环过滤环境中，饲养方法参照四川大学华西医院动物伦理管理委员会要求进行。将小鼠背部毛剪去并刮净，暴露出背部皮肤，按照3.25mg咪喹莫特(软膏量为65mg)每只小鼠的用量，将其均匀涂抹在小鼠裸露皮肤上，每天一次，共涂抹6天。期间密切观察小鼠皮肤发病情况。

2)K14/VEGF小鼠模型腹腔与透皮给药(TDD)：

腹腔给药：K14/VEGF小鼠饲养至12-16周龄，待耳根及颈部皮肤出现红肿、丘疹、毛发脱落时，将小鼠随机分为4组，每组6只，分别为空白对照组、500μg/kg组、1mg/kg组与2mg/kg组。给药组每日经腹腔注射100μl不同浓度的异甘草素注射剂，连续给药35天，空白对照组经腹腔注射100μl生理盐水。

透皮给药(TDD)：K14/VEGF小鼠饲养至12-16周龄，待耳根及颈部皮肤出现红肿、丘疹、毛发脱落时，将小鼠随机分为4组，每组6只，分别为空白对照组、vehicle组、TDD组与2mg/kg组。空白对照组经腹腔注射生理盐水100μl，vehicle组在患处皮肤涂抹不含异甘草素的透皮剂，TDD组在患处皮肤涂抹前述含有异甘草素的透皮剂，2mg/kg组经腹腔注射100μl异甘草素注射剂，上述各组均每天给药，共持续35天。

阴性对照(健康小鼠)：阴性对照选择正常Babl/c小鼠，随机分为4组，每组6只，分别为生理盐水组、500μg/kg组、1mg/kg组与2mg/kg组。给药组每日经腹腔注射100μl不同浓度的异甘草素注射剂，连续给药35天，生理盐水组经腹腔注射100μl生理盐水。

3)咪喹莫特涂抹建模银屑病小鼠模型腹腔给药：

小鼠模型建立成功后，随机分成3组，每组6只，分别为空白对照组、500μg/kg组与1mg/kg组，各组小鼠经腹腔注射100μl不同浓度异甘草素注射剂，每日给药。给药7日后，结束给药。

4)组织切片制作与H&E染色：

组织切片制作：摘眼球法取血并处死各组小鼠，对各组小鼠耳朵拍照后剪下，然后用梯度酒精脱水。将组织浸入二甲苯，共两次，每次15-40min(据具体情况而定，透明过度易碎)，将透明后组织浸入融化后的蜡中，分三次浸入，浸入的顺序按照蜡溶液的干净程度从脏到干净，共2h。(注：浸蜡时间过久或者温度过高可能会煮熟组织)，取专用包埋盒，灌满新鲜液态蜡，将包埋盒置于冷台上，将浸蜡完毕的组织浸入包埋盒中，置包埋盒于冷台冷却。 包埋好蜡块可4℃或者室温保存(室温亦可长期储存)。将包埋好的组织蜡块置于超薄病理切片机(Leica公司)，进行超薄切片。通常切4μm厚度，脾脏因细胞核较多，可切2μm厚度便于较好染色。切好蜡片置于45℃温水中，待蜡片完全展开后，将蜡片捞至载玻片上(载玻片表面使用多聚赖氨酸处理)。将捞好的载玻片放置于72℃烤片机中烘烤2h左右，或者55℃烤过夜。然后采用H&E染色标准对玻片进行染色。

根据结果显示，给药35天后，观察可见K14/VEGF银屑病小鼠耳朵组织红肿出血现象较对照组明显减退，银屑病样丘疹明显减少，耳朵厚度变薄，如图1A所示。随后，我们评价了不同给药途径给予异甘草素后，K14/VEGF小鼠耳朵发病情况变化，并记录了随治疗时间推移，小鼠耳朵银屑病样变改变情况。如图1C所示，与腹腔注射给药方式相比，透皮给药途径(Transdermal Drug Delivery，TDD)给予异甘草素同样展现出了对K14/VEGF小鼠耳朵病变的治疗作用。另外，如图1E所示，我们隔5天记录了不同实验组动物的耳部病变情况，发现随着时间推移，各给药组动物耳部发病情况随着治疗时间的推移而缓解。组织切片HE染色显示，给予异甘草素治疗组的小鼠耳朵组织较对照组相比，角质层变薄，棘层厚度降低，皮下小脓肿减少，皮肤组织中炎性细胞浸润减少，如图1B、D所示。

咪喹莫特涂抹法建模的银屑病模型，属于诱导型动物模型，其特点是建模时间短、实验操作方便等特点，但同时也存在建模不具有永久性、一旦撤除诱导药物，动物即可自愈。为排除咪喹莫特动物模型自愈的因素，我们缩短了给药治疗时间。经过7天给药后，观察咪喹莫特涂抹法建模银屑病小鼠的治疗情况可见，相比对照组，各给药组小鼠背部皮肤皮屑减少甚至消退，皮肤颜色趋于正常，如图2A所示，并且治疗效果随异甘草素浓度的增加而增加。对耳朵进行观察可见，如图6a所示，与对照组小鼠耳朵相比，皮屑减少或消退，银屑病样丘疹明显减少或消失，耳朵厚度变薄趋于正常。组织切片HE染色观察发现，与对照组相比，不同给药组小鼠皮肤与耳朵组织角质层变薄，棘层厚度降低，皮下小脓肿减少，皮肤组织中炎性细胞浸润减少，如图2B与图6b所示。

上述结果提示我们，异甘草素均能缓解两种银屑病动物模型中皮肤银屑病样变进程，并且能够改善皮肤组织病理学变化，其治疗效果呈剂量与时间依赖性。

1.2异甘草素能有效降低银屑病动物模型中多种白细胞介素的水平

ELISA测定动物血清中白细胞介素水平：

各组小鼠全血置于室温放置30min后，13000rpm离心10min，取血清。将试剂盒拿出平衡至室温待用。用标准品&标本通用稀释液将复溶后的标准品母液进行倍比稀释以配制不同浓度的标准品，具体稀释方法见附图18。空白孔加标准品通用稀释液，其余相应孔中加小鼠血清标本，100μl/孔，所有的样品或标准品均做3个复孔，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90min。自动洗板机洗板5次。空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液，100μl/孔。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60min。自动洗板机洗板5次。空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30min。自动洗板机洗板5次。加入显色底物(TMB)100μl/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15min。加入终止液100μl/孔,混匀后即刻测量OD 450值(3min内)。绘制标准曲线，计算标本中白细胞介素的含量。本文中所测定的IL-2、IL-6、IL-8、 IL-12等白细胞介素所采用试剂盒均购自北京达科为公司，实验步骤相同。

使用ELISA试剂盒分别检测两种银屑病动物模型不同给药剂量组小鼠与空白对照组血清中IL-2、6、8、12、17的表达水平变化，结果如图3B、图4与图5D所示，给予不同剂量异甘草素后，各组小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-8与IL-12含量分别见表1：

表1

结果显示，在K14/VEGF小鼠中，给予ISL治疗后，血清中IL-2、IL-6、IL-8与IL-12被有效的降低了，而在咪喹莫特涂抹法建模动物模型中，我们同样观察到了IL-6与IL-8水平的降低，而IL-2与IL-12由于含量低于试剂盒最低检测限，没有被检测到。另外，在咪喹莫特动物模型中，我们还检测了与银屑病发生发展密切相关的另外两种介素：IL-4与IL-23，同样，给予ISL治疗后的小鼠血清中上述两种白细胞介素水平较对照组明显下调(图6e)。而在两种动物模型中，IL-17含量由于低于试剂盒最低检测限，均未被检出。

综合两种动物模型中得到的数据，我们认为，可以确定的是，异甘草素能够明显、有效的同时降低银屑病小鼠模型血清中的IL-6与IL-8水平，该实验结果与我们在前期对异甘草素的研究得出的结论相符，并且，令人意外的是，虽然异甘草素调控IL-8的作用已见外文报道，但在银屑病中，异甘草素能够同时调控上述两种白细胞介素尚属首次发现。由于IL-6与IL-8在银屑病病程进展中具有重要的作用，因此，该结果不仅再次证实了异甘草素调控IL-6的作用，同时也提示我们异甘草素可能是一种很有潜力的银屑病治疗候选药物。

1.3异甘草素能有效抑制银屑病动物模型皮肤与耳朵组织中炎症因子活性

银屑病分子病理特点之一为皮肤表皮层、棘层中可见大量炎性细胞浸润，包括T细胞、巨噬细胞、肥大细胞等。为验证ISL是否具有调控炎性细胞的能力，我们选择了CD4、CD8、CD11b、F4/80等四种炎性细胞表面marker，使用免疫组化法分别检测两种银屑病模型皮肤与耳朵组织中上述分子的表达变化。

石蜡-免疫组织化学染色：

石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗2次，每次5分钟，过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，使用3％H₂O₂，室温避光10分钟。蒸馏水洗2次，每次5分钟。微波修复抗原，用塑料切片架，置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档，5分钟；取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档，5分钟。PBS洗2次，每次5分钟。从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分(保持组织呈湿润状态)，滴加与二抗同源动物血清(1：20，PBS配制)处理，37℃，15min。滴加一抗体：用滤纸吸 去血清，直接滴加一抗，4℃孵育过夜。PBS洗2次，每次5分钟。滴加生物素化的二抗，37℃，40min。PBS洗2次，每次5分钟。滴加三抗，37℃，40min。PBS洗2次，每次5分钟。DAB显色，镜下观察，适时终止显色，然后用自来水充分冲洗。苏木素复染，室温，30s，自来水冲洗。自来水冲洗返蓝，15min。然后梯度酒精脱水，二甲苯透明10min。最后用中性树胶封片。

结果显示，如图3C、D，图5A、B与图6c、d所示，随着ISL浓度的升高，CD4、CD8、CD11b与F4/80四种分子表达量明显下调。另外，与银屑病丘疹和皮损密切相关的血管内皮生长因子(VEGF)的表达量也随着ISL治疗浓度的升高而下调，如图3D、图5B与图6d所示。

1.4异甘草素能有效抑制银屑病动物模型皮肤组织中NF-κB活性

Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells(NF-κB)，中文名B细胞核内转录因子κ轻链基因增强子，是一种常见的胞内信号蛋白家族，在机体防御、免疫反应、细胞增殖与肿瘤发生等生理病理过程中发挥重要调控作用。NF-κB与免疫调控密切相关，在参与银屑病病程进展的过程中发挥了重要的作用。在急性期免疫反应中，NF-κB可以迅速上调IL-6的表达水平，从而参与到炎症中来。另有文献报道，NF-κB可以调控IL-8表达水平，且使用干扰素可以通过降低NF-κB通路活性抑制IL-8在感染疾病中的表达。因此，在本实验中，结合前述实验现象，我们对两种动物模型小鼠耳部与皮肤组织中的NF-κB通路活性进行了WB检测，以探索ISL同时调控IL-6与IL-8的原因。

1)组织总蛋白的提取：

取小鼠耳朵或皮肤，剪为1cm×1cm大小见方，置于研钵中。向研钵中加入适量液氮，待组织完全冻透后，研磨组织至粉末状，研磨过程中始终保持低温。收集组织粉末，置于进口干净的EP管中，预冷的PBS或者生理盐水洗2遍，加入1ml配制好的含Benzonase核酸酶和蛋白酶抑制剂的裂解液(Qproteome Mammalian Protein Prep Kit，Qiagen)，涡旋30s，4℃，14,000×g离心10min，小心吸取上清。使用仪器为Nanno Drop 2000/2000c分光光度计超微量全波长扫描(Thermo)测定提取蛋白的浓度，之后，蛋白样品与4×loading buffer(含DTT)按3:1混和后于沸水中煮沸3-5min，分装后存放于-80℃，避免反复冻融。

2)Western Blot检测信号通路：

SDS-PAGE胶配制：分离胶分别为10％(≤130kDa)和8％(≥130kDa)。玻璃板、样品梳、电泳槽等用自来水冲洗3遍，晾干，安装好电泳装置。用吸液器将配置好的分离胶匀速灌入玻璃板间，然后在分离胶表面注入一层异丙醇，隔绝空气，聚合30min，分离胶与异丙醇的界面清晰可见。倒掉上层异丙醇，用滤纸吸干水分。统一配置上层胶，将配置好的浓缩胶溶液灌注在分离胶上，浓缩胶中插入样品梳，凝胶完全聚合，30min。拔出样品梳，电泳槽内注入电泳缓冲液。

蛋白上样与电泳：冰上解冻制备好的蛋白样品，混匀，取10-20μl(≤30μg)左右的蛋白上样进行SDS-PAGE电泳。待所有蛋白样品上样后，吸取蛋白预染Marker 3μl点样参照。接通电源，电压80V，30min，后转为120V，待溴酚蓝达分离胶底部，关闭电源，终止电泳。

转膜(湿法)：电泳结束前20min，裁取1张与凝胶大小相同的PVDF膜和6张滤纸， PVDF膜使用前甲醇浸泡，活化90s。电泳结束后将玻璃板撬开，取出凝胶，轻轻去除浓缩胶。浸泡过甲醇PVDF膜、滤纸和凝胶转入转移缓冲液中平衡1min。按照三明治形式在转膜夹子上依次放置为3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸，每层间必须除去气泡。放置好转膜夹子及降温冰袋，加入转移缓冲液，恒压120V，电流约300mA转移3h(280kDa)。

BSA封闭与抗体孵育：转膜结束后，将PVDF膜由电转槽中取出，置于配置好的5％BSA15ml中，4℃，封闭过夜。取出封闭过的PVDF膜，TBST漂洗膜3次，10min/次。PVDF膜加入用一抗稀释液稀释的一抗工作液中(按照说明书推荐进行稀释)，4℃孵育过夜。TBST漂洗PVDF膜3次，10min/次。PVDF膜再移入TBST稀释的HRP标记羊抗鼠/兔二抗工作液中(通常为1:10000-1:20000)，37℃孵育2h。

化学发光法显色：A、B两种发光液按1:1比例等体积混合。混合显色液覆盖整张PVDF膜表面，摇晃均匀，1min。滤纸沥干发光液，保鲜膜完全包裹PVDF膜，放入暗盒中固定。暗室中将X光片置于膜上面，曝光30s～1min，然后显影及定影。室温晾干胶片上的定影液，记录数据。自动凝胶图像系统扫描拍照，以β-actin为内参对照，测定内参蛋白条带及待测蛋白条带的光密度值,获得待测样品蛋白的相对表达量。

使用National Institutes of Health开发图像软件Image J对得到WB条带进行灰度分析，分析三次取均值+SD，使用GraphPad Prism6.0软件包进行统计学分析并作图，差异分析采用Students’t检验进行，P<0.05为具有统计学意义。

根据结果图7与图8所示，在两种动物模型中，我们发现，随着异甘草素给药浓度的升高，NF-κB与磷酸化NF-κB蛋白水平均出现了明显的下调，尤其是在K14/VEGF动物模型中，2mg/kg给药组的NF-κB与磷酸化NF-κB蛋白几乎检测不到。同时，免疫组化实验结果显示，两种动物模型皮肤与耳朵中的NF-κB分子随着ISL给药浓度的升高而明显下调，如图3E、图5E与图6d所示。

结合前人研究结果与本实验上述结果，我们认为ISL可能是通过抑制NF-κB信号通路活性而发挥对IL-6与IL-8的双重调控作用，并且，我们推测，ISL可能是一种特异性的NF-κB抑制剂，其抗炎的分子机制可能是通过下调NF-κB信号通路活性而实现的。

1.5透皮给药途径中异甘草素渗透率测定

为进一步完善动物实验数据，我们决定考察在TDD给药途径中，有多少ISL能够有效进入动物模型体内，发挥治疗作用。因此，我们选择了经典的透皮给药实验，测定在TDD给药中，ISL通过皮肤屏障的比例。

1)高效液相色谱(HPLC)检测异甘草素及其浓度标准曲线的建立：

使用HPLC检测异甘草素，检测条件如下：

精确称量1mg异甘草素置于EP管中，加入1ml色谱级甲醇，配制成1mg/ml母液。将母 液稀释为0.0125mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml等7个浓度，使用上述HPLC检测条件，分别检测不同浓度下异甘草素在HPLC中的峰面积。将不同的浓度与对应的峰面积做散点图，并进行一元回归，得到浓度与峰面积的一元回归方程。

2)异甘草素透皮渗透率测定：

搭建透皮测定装置，如附图19所示。取Babl/c小鼠一只，处死后迅速剥离皮肤，置于干净PBS中洗去血迹，小心剥离皮下脂肪后，将鼠皮固定于内筒下端，外筒放置灭菌PBS，将内筒下缘浸入外筒，使外筒中PBS浸没鼠皮。向内筒中加入异甘草素透皮剂(见实验方法2.2.1.1)后，整套装置置于37℃水浴锅中，不同时间点抽取外筒中PBS 100μl，使用HPLC测定其中异甘草素含量。透皮率使用以下公式计算：透皮率＝外筒ISL含量/总ISL含量×100％。

根据文献报道，我们摸索了使用waters反向碳18柱检测异甘草素的条件，如图9A所示，在甲醇比0.5％冰乙酸为50比50的条件下，异甘草素检测波长为376.5nm，出峰时间为12min。随后，我们配制7个不同浓度的异甘草素溶液(0.0125mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml)，使用HPLC分别测定其峰并对峰面积积分(表2)。以峰面积为Y轴，异甘草素浓度为X轴作图(图9B)，并回归得到一元方程，方程为：Y＝78110845.57X+1215250.38，相关系数R＝0.99。

表2不同浓度ISL对应HPLC峰面积

平行进行三次单独的渗透率测定实验，使用公式计算平均透皮渗透率，最后得到结果为：在本论文所使用透皮促进剂配方的作用下，ISL透过小鼠皮肤屏障的效率是42.37％±4.52％。

2两种体外银屑病细胞模型的建立及异甘草素对体外细胞模型的生长抑制

2.1两种体外银屑病细胞模型的建立

Guilloteau,K等筛选了36种炎症细胞因子，并于2010年在杂志Journal of Immunology上撰文报道了使用IL-1α、IL-17、IL-22、TNFα与oncostatin M(OSM)五种细胞因子(M5)联合作用于体外培养角质形成细胞，可以诱导细胞表现出银屑病样分子改变，包括上调趋化因子8(CXCL8，IL-8)、SA100A7蛋白与β-防御素2(BD2)。在本研究中，我们使用M5因子体外诱导HaCaT与NHEK两种角质形成细胞24h，并使用WB与ELISA测定了细胞诱导后IL-6与IL-8表达变化及NF-κB表达变化。

1)体外银屑病模型建立：

取对数生长期HaCaT细胞系与NHEK细胞，胰酶消化3min，中止消化并1000rpm离心 3min，弃上清，细胞重悬。取无菌6孔板两块，分别将重悬后细胞铺入六孔板中，置六孔板于37℃、5％CO2孵箱中培养。待细胞贴壁后，弃原来培养基，换用含有重组人IL-1α、IL-17、IL-22、TNFα与OSM五种细胞因子(M5)的无血清培养基，重组因子浓度均为10ng/ml。M5因子培养基刺激诱导24h后，取细胞上清做ELISA分析，提取细胞总蛋白做WB分析，体外银屑病模型建立完成。

2)ELISA分析和Western Blot分析：

按“1.2异甘草素能有效降低银屑病动物模型中多种白细胞介素的水平”和“1.4异甘草素能有效抑制银屑病动物模型皮肤组织中NF-κB活性”中所述的内容进行实验分析。

根据结果如图12A所示，接受了M5诱导后的细胞相比诱导前，两种细胞分泌IL-6与IL-8能力明显增加，NF-κB信号通路明显被激活，两种细胞分泌IL-6与IL-8分别为如表3所示：

表3M5因子诱导HaCaT与NHEK细胞前后IL-6与IL-8表达变化

2.2异甘草素对两种银屑病细胞模型增殖具有增殖抑制作用

在建立了两种体外银屑病细胞模型后，如图10所示，我们使用异甘草素分别检测了其对正常HaCaT与NHEK细胞和银屑病HaCaT与NHEK细胞的在24h、48h与72h的杀伤作用，并分别计算了其对上述细胞的杀伤作用。

1)加药方案：

取建立成功的银屑病样HaCaT细胞系与NHEK细胞，胰酶消化，中止并1000rpm离心3min，弃上清，沉淀重悬。取96孔板，分别向96孔板中铺入重悬后HaCaT细胞系与NHEK细胞，每孔3×103个，置96孔板于37℃、5％CO2孵箱中培养。待细胞贴壁后，加入不同浓度的异甘草素(0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)，作用24h、48h与72h，每个时间点各加药浓度细胞使用CCK-8细胞增殖试剂盒进行细胞增殖测定。

取对数生长期的正常HaCaT细胞系与NHEK细胞，胰酶消化，中止并1000rpm离心3min，弃上清，沉淀重悬。取96孔板，分别向96孔板中铺入重悬后HaCaT细胞系与NHEK细胞，每孔3×103个，置96孔板于37℃、5％CO2孵箱中培养。待细胞贴壁后，加入不同浓度的异甘草素(0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)，作用24h、48h与72h，每个时间点各加药浓度细胞使用CCK-8细胞增殖试剂盒进行细胞增殖测定。

2)CCK-8法测定细胞增殖：

向96孔板中加入CCK-8试剂(Dojindo公司)，每孔加入10μl，37℃避光孵育2.5-3.5h(若药物具有还原性，则会与CCK-8反应加重显色，此时需要换液以去除药物影响再加入CCK-8进行检测)。孵育结束后，使用酶标仪在波长450nm处检测96孔板中各孔OD值，绘制曲线并计算IC50。

3)Hoechst染色：

取无菌的盖玻片放入6孔板中，取对数生长期细胞以2×105--5×105/孔铺入6孔板中，之后加入不同浓度的异甘草素(10mg/ml母液)，浓度梯度为0μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml，37℃培养48h后，弃上清，用PBS清洗2次，加入1/10体积的Hoechst33258(38μM)轻轻混匀，37℃孵育10-20。min，弃上清，立即在正置荧光显微镜346nm波长激发光的下观察细胞凋亡情况。结果见表4：

表4不同时间点异甘草素对HaCaT与NHEK细胞的IC₅₀

光镜观察两种细胞系生长变化，如图11所示，随着给药浓度的升高，HaCaT细胞系与NHEK细胞生长密度降低，细胞变粗、轮廓模糊。使用HoeChst33258染料分别对两种细胞系染色发现，随着ISL浓度升高，细胞核着色数量升高，说明死亡细胞数量上升。

3异甘草素下调两种银屑病体外模型分泌白细胞介素及细胞NF-κB信号通路活性

3.1异甘草素抑制银屑病体外模型分泌IL-6与IL-8

部分的实验结果显示，在M5因子诱导后，HaCaT与NHEK细胞中NF-κB信号通路被明显激活，其分泌IL-6与IL-8的能力显著上调。为验证ISL是否在体外细胞系模型中也具有上述作用，我们分别使用ELISA、qPCR与WB实验，检测了异甘草素作用后细胞分泌IL-6与IL-8水平变化与细胞中NF-κB信号通路活性变化。

1)ELISA和Western Blot检测信号通路变化：

按“1.2异甘草素能有效降低银屑病动物模型中多种白细胞介素的水平”和“1.4异甘草素能有效抑制银屑病动物模型皮肤组织中NF-κB活性”中所述的内容进行实验分析，并将方法中的血清样本换为细胞或细胞裂解物样本即可。

2)qPCR法检测细胞信号通路变化：

细胞处理：取无菌6孔板四块，分别铺入银屑病样HaCaT细胞系与NHEK细胞与正常HaCaT细胞系与NHEK细胞于六孔板中，置六孔板于37℃、5％CO2孵箱中培养。待细胞贴壁后，加入不同浓度的异甘草素(0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)，作用48h。

细胞总RNA提取：离心收集加药48h后的细胞，加1ml Trizol试剂于1.5ml的EP管中，吹打至液体变清凉，置于冰上。加入氯仿溶液200μl(200μl/1mlTrizol)，上下颠倒振摇10～20s，冰上放置10-15min，可见明显分层。13000rpm/min，4℃离心20min，将上层水相转移至新的1.5ml EP管中，大约500μl。加入500μl的异丙醇(500μl/1mlTrizol)，冰上沉淀10min，13000rpm/min 4℃离心10min；去上清，沉淀中加入1ml 75％乙醇溶液(用DEPC水稀释)，轻轻吹打混匀后，10000rpm/min、4℃离心5min；去上清，室温下空气挥发残存的乙醇液(约10min)；加入15-20μl DEPC处理的水，37℃水浴10min以完全溶解RNA，用枪 尖轻轻吹匀，进行分装后－70℃保存；另取2μl RNA做凝胶电泳。另取1μl RNA稀释100倍后在分光光度计上测定RNA的浓度和纯度。RNA的纯度：1.8＜A260/A280＜2.0。RNA提取过程中所用的试剂和耗材等均需除去RNAase。

RT(反转录反应)：采用TaKaRa试剂盒的PrimeScript试剂进行反转录反应(货号：DRR037A)，参照说明书进行操作。

Real time PCR扩增：采用Bio Rad的SsoAdvanced SYBR Green Supermix试剂盒(货号：#172-5260)，参照说明书进行操作。

数据处理：使用BioRad公司荧光定量PCR仪自带软件包BioRadFX96进行初步数据处理，初始数据导入GraphPad Prism6.0软件包进行统计学分析并作图，差异分析采用Students’t检验进行，P<0.05为具有统计学意义。

ELISA结果如图12B与图13所示，在加入2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml与16μg/ml异甘草素后，银屑病样HaCaT与NHEK细胞分泌IL-6与IL-8的水平显著降低，如表5：

表5不同浓度异甘草素作用HaCaT与NHEK细胞后各实验组细胞分泌IL-6表达量

3.2异甘草素抑制银屑病体外模型中NF-κB活性

随后，我们使用qPCR与WB从转录水平与蛋白水平分别检测了不同给药处理组细胞中NF-κB信号通路的表达变化。

1)荧光定量PCR检测qPCR：

RT(反转录反应)：采用TaKaRa试剂盒的PrimeScript试剂进行反转录反应(货号：

DRR037A)，参照说明书进行操作。

Random 6mers和Oligo dT Primer同时使用，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。

使用单引物进行反转录时，使用量分别如下：

Random 6mers(100μM)0.5μl(50pmol)

Oligo dT Primer(50μM)0.5μl(25pmol)

反应体系可按需求相应放大，10μl反应体系可最大使用500ng的Total RNA。

注意：将得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10(V/V)量。

Real time PCR扩增：采用Bio Rad的SsoAdvanced SYBR Green Supermix试剂盒(货号：#172-5260)，参照说明书进行操作。

荧光定量专用引物设计：用于荧光定量PCR的引物与普通RT-PCR有一定差异，主要在于专用引物扩增的片段较短(以100-150bp为宜)，跨CTS编码区等要求。按照要求设计小鼠NF-κB p65和β-actin荧光定量专用引物，如下：Mouse NF-κB(124bp)引物：(预实验摸索的最优退火温度为60.8℃)

Mouse-p65-F(SEQ ID No.1):5'ACCTGGAGCAAGCCATTAGCC 3'21bp

Mouse-p65-R(SEQ ID No.2):5'CGCACTGTCACCTGGAAGCA3'20bp

Mouseβ-actin(147bp)引物：(预实验摸索的退火温度为59℃--61.3℃均较好)

Mouse-β-F(SEQ ID No.3):：5`AGATTACTGCTCTGGCTCCTAGC 3`23bp

Mouse-β-R(SEQ ID No.4):：5`ACTCATCGTACTCCTGCTTGCT 3`22bp

上述两对引物交由瑞信公司合成。

数据处理及统计学分析：使用BioRad公司荧光定量PCR仪自带软件包BioRadFX96进行初步数据处理，初始数据导入GraphPad Prism6.0软件包进行统计学分析并作图，差异分析采用Students’t检验进行，P<0.05为具有统计学意义。

2)Western Blot检测细胞中NF-κB信号通路的表达变化：

按“1.4异甘草素能有效抑制银屑病动物模型皮肤组织中NF-κB活性”中所述的内容进行实验分析，并将方法中的血清样本换为细胞裂解物样本即可。

结果如图10所示。在转录水平，异甘草素能够有效下调M5诱导后HaCaT细胞系与NHEK细胞中NF-κB的转录，如图14A所示。在WB检测中，我们发现，NF-κB与p-NF-κB蛋白表达水平均随着异甘草素给药浓度的升高而降低，尤其是在最高给药剂量(16μg/ml)异甘草素的作用下，几乎检测不到NF-κB与p-NF-κB蛋白的表达，如图14B所示该实验结果与动物实验相一致，再次证明了我们之前对于异甘草素能够下调NF-κB的推测。在NF-κB信号通路激活的过程中，NF-κB的磷酸化是整条通路激活的关键事件，通常情况下，总NF-κB蛋白水平不会出现较大的变动。而在本实验中，异甘草素不仅抑制了p-NF-κB磷酸化水平，并且同时下调了NF-κB水平，我们在转录水平与蛋白水平均观察到了此实验现象，似乎提示我们，异甘草素并非是一种抑制NF-κB的磷酸化的化合物，而是一种直接下调NF-κB总蛋白的化合物。

有趣的是，在体外实验中，我们同样发现，在正常的HaCaT细胞系与NHEK细胞中，无论是转录水平还是蛋白水平，NF-κB都未见受到异甘草素明显的下调，p-NF-κB水平变化同NF-κB，而在经过M5诱导后，两种细胞中的NF-κB又能够受到异甘草素的调控。因此，我们推测，是否在M5诱导后，细胞中某个促NF-κB转录的蛋白被激活，而该蛋白能够被ISL特异性的抑制，从而表现出强烈的下调NF-κB转录与翻译的现象。换言之，ISL不是通过直接抑制，而是通过间接抑制某种信号蛋白从而下调NF-κB活性。

4异甘草素通过抑制NF-κB下调两种白细胞介素

4.1过表达与抑制NF-κB信号通路能够有效抑制IL-6与IL-8表达

前述实验结果显示，在体内与体外银屑病模型中，异甘草素能够同时下调IL-6与IL-8水平，并且下调NF-κB活性。但是否异甘草素是通过下调NF-κB活性从而发挥同时下调IL-6与IL-8的作用还有待实验证实。为验证上述观点，我们分别使用重组人NF-κB因子与NF-κB特异抑制剂Bay11-7082，在HaCaT细胞中过表达与抑制NF-κB信号通路，并使用ELISA与WB检测IL-6与IL-8水平变化。

1)过表达与抑制NF-κB对细胞信号通路变化的影响：

取无菌6孔板两块，分别铺入银屑病样HaCaT细胞系与NHEK细胞于六孔板中，置六孔板于37℃、5％CO2孵箱中培养。待细胞贴壁后，分别加入异甘草素、重组人NF-κB因子与Bay11-7082抑制剂，加药方案见下：

药物作用24h后，分别提取各组细胞上清做ELISA检测，提取各组细胞全蛋白进行WB检测信号通路。

2)ELISA和Western Blot检测IL-6与IL-8水平变化：

按“1.2异甘草素能有效降低银屑病动物模型中多种白细胞介素的水平”和“1.4异甘草素能有效抑制银屑病动物模型皮肤组织中NF-κB活性”中所述的内容进行实验分析，并将方法中的血清样本换为细胞或细胞裂解物样本即可。

根据结果如图15所示，在未加M5因子诱导的正常HaCaT细胞中过表达NF-κB，细胞分泌IL-6与IL-8水平同时被上调，而这种上调能够被ISL或者Bay11-7082逆转。信号通路分析结果与ELISA结果相一致。该实验结果证实，异甘草素发挥对IL-6与IL-8的下调作用是通过抑制NF-κB而实现的。上述实验结论尚属首次发现，进一步完善了异甘草素的药理学分子机制，具有一定的意义，并为异甘草素的应用开发奠定了理论依据。

4.2异甘草素在IL-1α与IL-17存在的情况下发挥其抑制白细胞介素的作用

在部分实验结果中，我们推测是否在M5诱导后，细胞中某个促NF-κB转录的蛋白被激活，而该蛋白能够被ISL特异性的抑制，从而表现出强烈的下调NF-κB转录与翻译的现象。为进一步证实我们的推测，我们使用M5中的因子IL-1α、IL-17、IL-22、TNFα与OSM，分别单独诱导HaCaT细胞24h，然后加入10μg/ml剂量(IC50附近)异甘草素作用细胞24h，使用ELISA与WB分别测试单独诱导后的细胞是否受到异甘草素的抑制作用。

1)单加因子处理细胞后异甘草素对细胞信号通路变化的影响：

取无菌6孔板两块，分别铺入正常HaCaT细胞系与NHEK细胞于六孔板中，置六孔板于37℃、5％CO2孵箱中培养。待细胞贴壁后，换新鲜培养基并分别加入重组人IL-1α、IL-17、IL-22、TNFα与OSM五种细胞因子，同时向各实验细胞组中加入10μg/ml异甘草素，作用24h。分别提取各组细胞上清做ELISA检测，提取各组细胞全蛋白进行WB检测信号通路。

2)ELISA和Western Blot检测IL-6与IL-8水平变化：

按“1.2异甘草素能有效降低银屑病动物模型中多种白细胞介素的水平”和“1.4异甘草素能有效抑制银屑病动物模型皮肤组织中NF-κB活性”中所述的内容进行实验分析，并将方法中的血清样本换为细胞或细胞裂解物样本即可。

根据结果如图16所示，ELISA分析显示，在IL-1α与IL-17诱导后组，细胞分泌IL-6与 IL-8的能力能够被异甘草素抑制，而在其他因子单独诱导组则未见统计学差异的变化，如图16A所示。WB分析结果显示，同样，在IL-1α与IL-17诱导后，细胞中总NF-κB蛋白水平被ISL明显下调，而在其他因子单独诱导组则未见统计学差异的变化，如图16B所示。该实验结果提示，在IL-1α与IL-17存在的情况下，ISL能够发挥其下调NF-κB的作用，而在其他因子存在的情况下，ISL则不发挥作用。由于在生理状态下，IL-1α与IL-17表达水平较低，在银屑病病人中，上述两种细胞因子表达量极高，因此，该结果从一个侧面提示我们，ISL对正常皮肤细胞增殖分化的影响较小，而对银屑病病变皮肤细胞增殖则有较强烈的抑制作用，提示我们异甘草素可能是一种较为理想的、低毒性的银屑病治疗候选药物。

5异甘草素能够影响NF-κB启动子活性

最后，我们考察了异甘草素是否具有影响NF-κB基因启动子活性的能力。在本实验中，我们选择了双荧光素酶报告基因系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)作为实验工具。该系统被广泛应用于基因-基因、基因-蛋白、基因-小分子等相互作用研究领域。

1)荧光素酶质粒构建：

双荧光素酶报告基因系统专用质粒pGL3-Basic，为一不含启动子的萤火虫荧光素蛋白真核表达质粒，本实验选用该质粒，将NF-κB启动子区插入萤火虫荧光素蛋白基因序列上游，构建pGL3-NFκB-promoter质粒。

引物设计：查阅NCBI基因数据库与相关文献，得到NF-κB启动子区基因序列，如下(SEQ ID No.5)：

ACCACCCGGCCTCTGCGGAGCAGAAGGCCCGGTCGGGCTTTTCCCTGCGCGGGGCGGGCGCCGCAGCCCAGTAGCCCTGGCTTTGCTCCAGACCCGGCCCAGAGTGACATCACCAAACTCCGCCGATCGGCGGGAGGGGGCCCTGAAATCCCCTAAAAACAAAGTGAGTAATCGGCGGACCCACCCTCCAGGCGGGGCGGGACCCGGGAGCTAGCCGAGCCACCGGGCACGCCAGCCTCTCGTCCTCGGCGAGGCGCGCACTTGGCCCCGACCCCCGGCAGCGGCTGTGCGTGCAGCCTCTTCGTCCTCCGCCCGGCGTGCACTTGCTCCCCGCCCCTGCGCCGGGCGGCGGCGGGGCAGCGCGCAGGCGCGGCCGATTCCGGGCAGTGACGCGACGGCGGGCCGCGCGGCGCATTTCCGCCTCTGGCGAATGGCTCGTCTGTAGTGCACCGCGCGGGCCCAGCTGCGACCCCGGCCCCGCCCCCGGGACCCCGCCATG。

根据上述序列，设计相应引物并加入酶切位点NheI和XhoI(下划线碱基)，如下：

Sense(SEQ ID No.6)：5`-CTAGCTAGCGCCCAGTAGCCCTGGCTTTG-3`

Antisense(SEQ ID No.7)：5’-CCGCTCGAGCAGACGAGCCATTCGCCAGA-3

扩增、双酶切与连接：PCR，将目标条带从HaCaT细胞基因组中扩增出来，PCR结束后，电泳、切胶回收目标条带。pGL3-Basic与PCR产物使用限制性内切酶NheI与XhoI双酶切，37℃，酶切2h,1％琼脂糖凝胶电泳验证双酶切结果。使用T4DNA Ligase连接质粒与碱基片段，16℃，连接过夜。

转化：配制LB固体培养基：Tryptone(胰蛋白胨)5g，Yeast Extract(酵母提取物)2.5g，NaCl(氯化钠)5g，5g Agar(琼脂糖)，再加入ddH2O到500ul，高压灭菌20min。LB培养基： Tryptone(胰蛋白胨)5g，Yeast Extract(酵母提取物)2.5g，NaCl(氯化钠)5g,再加入ddH2O到500ul，高压灭菌20min。事先将恒温水浴的温度调到42℃。取100μl冰浴上融化的感受态细胞，加入50μl连接产物，轻轻混匀，在冰浴上放置30分钟。迅速置于42℃水浴中热激90s，然后快速置于冰上2min，该过程不摇动离心管。将转化后的感受态细胞加入700μl灭菌LB培养液(不含抗生素)，混匀后将培养管置于37℃恒温生化培养箱，220rpm/min摇动培养1h，使细菌复苏。将培养后的菌液取100μl滴加到LB固体培养基平皿中(含100μg氨苄青霉素)，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀，倒置平皿置于37℃培养箱培养过夜。37℃培养过夜的平板，枪尖挑取单一菌落，接种于10μl无菌水中，进行下一步的菌落PCR验证。

菌落PCR验证阳性克隆：

反应体系如下：

反应结束后，将反应产物行琼脂糖凝胶电泳，挑取出正确扩增目标条带的克隆。

2)质粒提取：

6ml培养过夜的菌液，于室温下4000rpm离心5min以沉淀菌种，弃去培养基。倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250μlSolutionⅠ/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。细胞沉淀的完全重悬对于获得高的产量是十分重要的。往重悬混和液中加入250μlSolutionⅡ，轻轻颠倒混匀7-10次。如有必要，可把裂解液置于室温静置2min，避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。裂解反应不要超过5min。

往上述混和液中加入350ul Solutionш，并温和地上下颠倒离心管数次立即混匀，直至形成白色絮狀沉淀。室温下，13000x g离心10min。将离心后的上清液加到组装在一个2ml收集管的清洁HiBind Miniprep Column I确保沉淀未到柱子上)于室温下10,000x g离心1min，使裂解液完全流过柱子。丢弃上清液，重新使用2ml收集管。加入500ul的Buffer HB洗HiBind ep Column I，于室温下10,000x g离心1min，让液体完全流过HiBind Miniprep Column I。丢弃上清液，重新使用2ml收集管。加入700ul的DNA washing buffer洗HiBind Miniprep Column I。(DNA washing buffer需要用无水乙醇稀释，DNA washing buffer如果是冷冻的，必须在使用前拿到室温)于室温下10,000x g离心1min，完全使DNA washing buffer流过HiBind Miniprep Column I，丢弃上清液。重复上一步，加入另外的700ul的DNA washing buffer洗HiBind Miniprep Column I，丢弃上清液。13000xg离心空柱子2min，干燥柱子。(此步不能省略，对于好的DNA产物是非常关键的)将柱子放到1.5ml的离心管中，加入50ul的无菌去离子水，在室温下放置1-2分钟(目的是为了使液体渗透到柱子中间)。13000xg离心1min，洗脱DNA。紫外分光光度计测质粒OD值和浓度。

3)质粒转染293细胞：

取无菌6孔板1块，铺入293T细胞，每孔3×106个，置六孔板于37℃、5％CO2孵箱中培养，待细胞贴壁后，换用无血清1640培养基饥饿6h。转染试剂使用lipofectamine 2000。取无菌EP管2个，每管中加入无血清1640培养基各100μl，向其中一管中加入5μl lipofectamine2000，另一管中加入pGL3-NFκB-promoter质粒200μg，混匀后将两管液体合为一管，静置10min，制成转染工作液。六孔板弃无血清培养基，将转染工作液均匀滴加入孔中细胞表面，补充1640培养基至500μl，置六孔板于37℃、5％CO2孵箱中培养，12h后补充1640培养基500μl，37℃、5％CO2孵箱中继续培养。

4)转染细胞加药：

将上步中转染了质粒的293T细胞分为两组，一组加入M5因子诱导，另一组不加因子，同时，培养基中加入不同浓度异甘草素(0、2、4、8、12、16μg/ml)，置细胞于37℃、5％CO2孵箱中培养24h后，进行双荧光素酶活性检测。

5)双荧光素酶报告基因检测：

检测使用试剂盒为Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测试剂盒(Dual-Luciferase Reporter(DLR^TM)Assay System,Promega公司)。将1倍体积的5×Passive Lysis Buffer(PLB)加到4倍体积的蒸馏水中。混合均匀。储存在4℃(≤1个月)。用Luciferase Assay BufferⅡ(目录号E1910和E1960中的是10ml；E1980中的是105ml)溶解冻干粉Luciferase Assay Substrate。存于-20℃(≤1个月)或-70℃(≤1年)取2.1ml 50×Stop&Substrate加到105ml的Buffer。在提供的棕色Stop&Glo Reagent瓶中，振摇10秒。在-20℃存15天。除去培养细胞中的培养基，用1×PBS清洗培养细胞，去掉清洗液，将500μl 1×PLB加入到培养孔中，室温轻缓晃动培养板15分钟，把裂解液转移到检测试管中。向检测管中加入100μl LARⅡ，使用Synergy 2多功能微孔板检测仪(BioTek公司)读板，再向检测管中加入100μl Stop&Reagent试剂，读板。使用Gen5^TM软件包进行数据处理。

6)数据处理：

荧光定量PCR数据处理使用BioRad FX96软件包，WB灰度分析使用National Institutes of Health开发图像软件Image J将图像转换为数字，统计学分析使用GraphPad Prism6.0软件，差异分析采用Students’t检验进行，P<0.05为具有统计学意义，折线图与柱状图均使用GraphPad Prism6.0软件分析制作，文中所用所有结果图均使用Adobe Photoshop CS5软件包排版。

实验结果如图17所示，随着给药浓度的升高，NF-κB启动子的活性明显被抑制。并且，同之前的实验结果，在M5未诱导的情况下，异甘草素并未见明显的抑制NF-κB启动子的活性，而在M5诱导后，异甘草素表现出了较强的抑制活性。

综上，发明人首先选择了两种国际公认的银屑病小鼠模型作为实验对象：K14/VEGF转基因小鼠与咪喹莫特软膏涂抹法银屑病Babl/c小鼠模型，使用腹腔注射与耳朵涂抹给药两种给药途径，给予小鼠不同剂量的异甘草素(500μg/kg、1mg/kg与2mg/kg)，观察给药组小鼠耳部发病情况，分别给药35天与7天。给药结束后，提取各组小鼠耳朵与血清，分别使用 Western Blotting(WB)、免疫组织化学(IHC-P)与酶联免疫吸附(ELISA)法检测小鼠耳部NF-κB信号通路蛋白表达变化与小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-8、IL-12等白细胞介素表达水平变化，病理切片HE染色观察小鼠耳部病理学变化。同时，我们使用药物皮肤渗透装置测定了涂抹法中进入小鼠体内的异甘草素药量。阴性对照的设置上，我们选择了一组正常Babl/c小鼠，腹腔注射给予不同剂量(500μg/kg、1mg/kg与2mg/kg)的异甘草素。

其次，发明人选择永生化人角质细胞HaCaT与原代人角质形成细胞NHEK两种正常细胞，使用IL-1α、IL-17、IL-22、TNFα与OSM五种重组人细胞因子(M5)体外刺激诱导24h，建立了两种银屑病体外模型。使用不同浓度异甘草素(0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)作用上述两株正常细胞与银屑病模型细胞24h、48h与72h后，使用细胞增殖试剂盒(CCK8)检测异甘草素对上述细胞的增殖抑制并计算IC50，使用核染色试剂Hoechst33258检测细胞凋亡情况，并分别使用qPCR、WB与ELISA检测48h组中细胞NF-κB信号通路活性与细胞分泌IL-2、IL-6、IL-8、IL-12等白细胞介素的变化。

机制研究中，发明人选择使用重组NF-κB因子与抑制剂Bay11-7082两种试剂，在M5诱导后的银屑病样HaCaT细胞株中分别过表达与抑制NF-κB信号通路，ELISA与WB分别检测过表达与抑制了NF-κB信号通路后，HaCaT分泌IL-6与IL-8的能力变化。随后，我们向HaCaT细胞株中单独加入IL-1α、IL-17、IL-22、TNFα与OSM诱导24h，然后加入10μg/ml异甘草素作用24h，ELISA与WB法分别检测不同因子诱导后加入异甘草素的细胞上清中IL-6与IL-8浓度变化与细胞中NF-κB信号通路变化。

最后，发明人我们构建了含有NF-κB启动子的荧光素酶报告质粒pGL3-NF-κB-promoter，并将该质粒转染293T细胞系。转染后质粒加入不同浓度异甘草素(2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml)作用24h，使用Promega公司双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Dual-Luciferase Reporter Assay System)检测不同实验组细胞中荧光强度变化。

上述实验的主要结果如下：

1、腹腔注射给予不同剂量治疗的K14/VEGF转基因小鼠与咪喹莫特软膏涂抹法银屑病Babl/c小鼠模型，其发病情况随着治疗剂量加大而缓解，且随着治疗天数的推移逐步缓解。皮肤涂抹给予不同剂量治疗的K14/VEGF转基因小鼠，其发病情况随着治疗天数推移逐步缓解。小鼠耳朵病理切片HE染色结果显示，与对照组相比，给药组小鼠耳部皮肤角化不全与过度现象降低、棘层变薄、炎性细胞浸润降低，病理组织评分(Baker Score)分别为：34.2±1.3,23.4±1.8,16.3±1.4与11.6±1.4(K14/VEGF模型)；31.6±1.3,18.7±1.3,10.5±1.1(咪喹莫特模型)。

2、使用药物皮肤渗透装置测定皮肤涂抹给药方式中异甘草素的皮肤透过率，结果为43.6％，说明皮肤涂抹法能够将异甘草素有效送入病变部位。

3、ELISA检测银屑病小鼠模型各剂量给药组与阴性对照小鼠组，发现，银屑病小鼠模型血清中IL-2、IL-6、IL-8、IL-12含量均呈现下调，而在阴性对照组中，接受了异甘草素注射的小鼠，各剂量组小鼠血清中上述白细胞介素未见明显差异变化。

4、WB检测各实验组小鼠耳朵组织中NF-κB信号通路表达变化，发现NF-κB与p-NF-κB随着给药浓度的提高而逐渐降低，IκB未见明显变化。IHC-P检测结果相同。

5、使用银屑病体外细胞模型HaCaT与NHEK测试异甘草素对细胞的生长抑制试验中发 现，异甘草素抑制上述两种细胞具有时间与浓度依赖性。IC₅₀分别为：13.25±0.31,5.61±0.41与4.64±0.28μg/ml(24h、48h与72h，HaCaT，M5-)；12.05±0.22,9.64±0.28与8.97±0.35μg/ml(24h、48h与72h，HaCaT，M5+)；31.55±0.32,28.41±0.28与16.77±0.22μg/ml(24h、48h与72h，NHEK，M5-)；15.35±0.24,6.74±0.21与5.89±0.31μg/ml(24h、48h与72h，NHEK，M5+)。

6、Hoechst33258染色观察，发现随着异甘草素给药浓度升高，细胞凋亡逐渐增多。

7、qPCR、WB与ELISA检测结果发现，异甘草素能够降低两种银屑病样细胞中NF-κB与p-NF-κB表达，尤其是在最高剂量，细胞中几乎无法检测到上述两种分子，而IκB未见明显变化，并且，异甘草素能同时抑制两种细胞分泌IL-6与IL-8。有趣的是，我们发现异甘草素对正常HaCaT与NHEK细胞的NF-κB信号通路没有抑制作用，也不会下调其细胞分泌IL-6与IL-8的水平。

8、过表达与抑制实验中，我们发现，给予细胞重组人NF-κB因子的HaCaT细胞，其表达IL-6与IL-8水平明显上调；而给予了细胞NF-κB抑制剂Bay11-7082后，HaCaT细胞分泌IL-6与IL-8的水平被明显抑制，这与给予异甘草素后表现出的现象一致。同时给予Bay11-7082/ISL与重组人NF-κB因子，细胞分泌IL-6与IL-8能力依然受到严重抑制，结果说明，ISL通过抑制NF-κB的活性从而发挥同时抑制IL-6与IL-8的作用。WB结果与ELISA结果相一致。

9、单加因子刺激后的HaCaT细胞加入异甘草素作用24h后，ELISA检测发现，在IL-1α与IL-17存在的情况下，异甘草素能够发挥抑制HaCaT细胞分泌IL-6与IL-8的作用，而在别的因子存在的情况下，异甘草素似乎并不能发挥其抑制作用。上述实验提示我们，可能异甘草素发挥作用需要IL-1α与IL-17协同，同时也提示我们，异甘草素可能是一种毒性较小的NF-κB抑制剂。

10、双荧光素酶报告基因系统实验结果表明，随着给药剂量的增加，NF-κB启动子区启动转录活性下降，从而提示我们，异甘草素可能具有抑制NF-κB启动子的活性，从而起到抑制NF-κB表达的作用。

上述实验的结论如下：

异甘草素对于两种银屑病动物模型具有良好的治疗效果，且能够降低动物血清中多种白细胞介素的水平。不同给药途径对于治疗银屑病都具有良好的治疗效果。细胞实验中，异甘草素不仅能够显著抑制两种银屑病体外模型的生长，并且通过抑制细胞中NF-κB信号通路，发挥抑制IL-6与IL-8表达的作用。而且，异甘草素对正常角质细胞与动物分泌IL-6与IL-8的能力没有抑制作用，表示异甘草素是一种较低毒性的NF-κB抑制剂，对于临床安全有效应用提供了依据。

Claims (10)

1.异甘草素在制备改善或治疗银屑病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：异甘草素在制备改善或治疗银屑病引起的皮肤角化不全与过度现象、棘层变厚、炎性细胞浸润的药物中的应用。

3.异甘草素在制备抑制NF-κB、p-NF-κB表达水平的药物中的应用。

4.异甘草素在制备改善或治疗自身免疫疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述自身免疫疾病包括类风湿关节炎、动脉硬化、多发性硬化症、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经炎、哮喘、感染性骨炎或系统性炎症反应综合征。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于：所述药物为外用制剂，口服制剂或注射制剂。

7.改善或治疗银屑病的药物组合物，其特征在于：它是以有效量的异甘草素为主要活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

8.改善或治疗银屑病的药物组合物，其特征在于：它是以有效量的异甘草素和可治疗银屑病的药物为主要活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

9.根据权利要求8所述的改善或治疗银屑病的药物组合物，其特征在于：所述可治疗银屑病的药物为甲氨蝶呤、环磷酰胺或糖皮质激素。

10.根据权利要求7-9任一项所述的改善或治疗银屑病的药物组合物，其特征在于：所述制剂为外用制剂、注射剂或口服制剂。