CN106258988A - 用精胺诱导烟草愈伤组织的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，以精胺作诱导剂制备诱导培养基进行烟草叶片外植体的愈伤组织诱导。本发明以精胺作诱导剂制备的诱导培养基比传统的培养基出愈快、产量高、质量优，且该培养基还可直接用于愈伤组织的增殖扩繁，达到一基多用，能显著提高整体工作效率。

Description

用精胺诱导烟草愈伤组织的方法
技术领域
本发明涉及植物生物工程组织培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种用精胺诱导烟草愈伤组织的方法。
背景技术
烟草的愈伤组织(callus)不仅是获得再生植株，而且是获得遗传变异，进行农艺性状改良的重要材料。同时，烟草作为植物生物技术研究的模式植物，其愈伤组织还是细胞生物学、分子生物学和基因学，等基础研究的重要试验材料。所以，国内外涉及如何获得烟草愈伤组织的技术研究报告颇多。但是归纳起来，其基本培养基绝大多数是用MS(Murashige和Skoog,1962)，偶然有用H(Bourgin和Nitsch,1967)。诱导剂几乎全部局限于两类5种植物生长物质。即生长素类(auxin)中的3种：2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，NAA(萘乙酸)和IBA(吲哚丁酸)；细胞分裂素类(cytokinin)中的2种：BA(N6-苄基腺嘌呤)和KT(激动素)。而且往往是需要其中的2种，甚至3种复配使用才能达到诱导愈伤组织的效果。这些获得烟草愈伤组织的传统技术缺点有三：1、培养基的配制程序繁琐复杂费工；2、愈伤组织的产量不高；3、2,4-D，NAA和IBA均有明显的毒性和残留，特别是2,4-D原本就是除草剂，极易使刚获得的愈伤组织出现褐化和板结，导致质量下降，直接影响其后续的增殖和器官再分化的能力。但是，为显示各自技术的成功，相关报告往往只强调其“出愈率％”，即出愈外植体数/接种外植体数×100％，如何之高(根据不同报导，培养25d-30d可达75％-100％)，却少有人明确告知读者其愈伤组织的实际产量和质量。事实是，根据已查的报导，几无例外，从外植体获得少量愈伤组织后，都还必须及时转入另外某种不同的专用增殖培养基进行扩繁，操作繁琐，成本也相应增加。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，以精胺作诱导剂制备的诱导培养基比传统的培养基出愈快、产量高、质量优，且该培养基还可直接用于愈伤组织的增殖扩繁，达到一基多用，能显著提高整体工作效率。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，以精胺作诱导剂制备诱导培养基进行烟草叶片外植体的愈伤组织诱导。
优选的是，所述的用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，所述诱导培养基为配方为：MS+精胺0.5-3.0mg/L，pH为5.8～6.0。
优选的是，所述的用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，所述烟草叶片外植体的获取方法为：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下，切成方片作为外植体，备用。
优选的是，所述的用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，将自上至下的第3片叶在无菌条件下切除叶柄以上2mm和叶尖以下2mm的叶片部分，再沿其主脉两侧分切成5mm×5mm的方片作烟草叶片外植体。
优选的是，所述的用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，将烟草叶片外植体接种于灭菌后的诱导培养基中培养10-20天，获得烟草愈伤组织。
优选的是，所述的用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，所述诱导培养基中精胺的浓度为2.0-2.5mg/L。
本发明至少包括以下有益效果：
1)精胺(Spermine,Spm.)，属于生长物质多胺类(polyamine)中的一种，是广泛存在于高等植物界的纯天然植物活性物质，对培养物没有毒副作用，发明采用精胺添加于固体MS配制成单一的诱导培养基，大大简化培养基的配制程序，节省物力人力，降低了培养成本；
2)本发明的诱导培养基以精胺作为唯一的诱导剂成分，针对双子叶植物烟草的特殊生物学特性，在大量筛选试验的基础上，确定了精胺的适宜浓度，使得烟草叶片外植体在诱导培养基作用下进行脱分化，以高效优质地形成烟草愈伤组织，本发明的诱导培养基比传统的培养基诱导效果更好，出愈快、产量高、质量优，且该诱导培养基还可直接用于愈伤组织的增殖扩繁，达到一基多用，能显著提高整体工作效率。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
一种用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，包括以下步骤：
步骤一、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，在无菌条件下，将烟草叶片切成方片作为外植体，备用，方片可切成大小约为5mm×5mm；
步骤二、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，添加精胺0.5mg/L，调整培养基pH为5.8～6.0，灭菌后备用；
步骤三、诱导培养：将步骤一获得的烟草叶片外植体接入步骤二的诱导培养基中，培养10-20天。
实施例2：
步骤一、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下，切成方片作为外植体，备用，方片可切成大小约为5mm×5mm；
步骤二、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，添加精胺2mg/L，调整培养基pH为5.8～6.0，灭菌后备用；
步骤三、诱导培养：将步骤一获得的烟草叶片外植体接入步骤二的诱导培养基中，培养10-20天。
无菌烟草植株的叶片长至5、6片叶时，自上至下的第3叶为充分成熟健壮的功能叶，细胞代谢旺盛，生命力强，相比其他烟草叶片，作为外植体培养更易发生脱分化形成愈伤组织。
实施例3：
步骤一、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下，切除叶柄以上2mm和叶尖以下2mm的叶片部分，留叶片中间部分，再沿其主脉两侧分切成5mm×5mm的方片作为外植体，备用，需要说明的是，前述的沿主脉切片是指弃用了叶片左右两侧的边缘叶片部分，只要主脉两侧的叶片部分；
步骤二、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，添加精胺2.5mg/L，调整培养基pH为5.8～6.0，灭菌后备用；
步骤三、诱导培养：将步骤一获得的烟草叶片外植体接入步骤二的诱导培养基中，培养10-20天。
无菌烟草植株的叶片长至5、6片叶时，自上至下的第3叶为充分成熟健壮的功能叶，细胞代谢旺盛，生命力强，在切除叶片的上下两端以及在沿主脉两边切取5mm×5mm的方片的同时也切除了左右两侧边缘的叶片部分，这种操作更有利保证所用的烟草叶片外植体从外部形态到内在代谢水平都更为均匀一致，有效减少材料误差对实验结果的影响。
对比例1：
为了说明本发明的用精胺诱导烟草愈伤组织的方法的效果，本发明的发明人以实施例3的方法，将诱导培养基中的精胺浓度依次设定为：0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.0mg/L，并以传统诱导培养基(其配方为：MS+精胺0.0+2,4-D 0.1mg/L+NAA1.5mg/L+BA 0.2mg/L)为对照组，在上述每组试验中接种10瓶，每瓶接种5个方片，称量并计算每组试验中5个方片的平均鲜重FW1(g)，以便最后计算每瓶(5个方片)愈伤组织的平均产量。在常规条件下培养诱导烟草愈伤组织，并统计各组培养10天的出愈率和培养20天的出愈率、褐变率、板结率和愈伤组织净增鲜重，其中：
平均出愈率(％)＝出愈方片数/接种方片数×100％，不论方片污染与否及出愈多少；
褐变率(％)＝出愈方片褐变数/出愈方片数×100％；
褐变程度：以“+”多少表示；
板结率(％)＝愈伤组织紧实难以增殖分化的方片数/出愈方片数×100％；
愈伤组织净增鲜重：试验终止，当即每组随机取3瓶无污染者，去除培养基后，称量每瓶培养物(含外植体方片，及其愈伤组织和附生物)的总鲜重FW2(g)，计算每瓶愈伤组织的净增鲜重FW(g)＝FW2-FW1(FW1为培养前5个方片的平均鲜重)。
结果见表1。
表1.精胺诱导烟草叶片愈伤组织的实施案例及与传统技术的效果对比
从表1可见：用精胺为诱导剂配制成单一的诱导培养基，其诱导效果明显优于传统的诱导培养基，在基本培养基(MS)、外植体和培养条件都相同的情况下，采用精胺为诱导剂的培养案例中，10d出愈率达48％-98％，为传统诱导剂的1.5倍至3.0倍，20d出愈率普遍达100％，20天愈伤组织产量为传统诱导剂的2.2倍至3.8倍，出愈快、产量高、质量优，基本无褐化与板结现象。另外，从表1可以看出，精胺的适宜添加浓度为2.0-2.5mg/L，以2.0mg/L为最优添加浓度。
另外需要说明的是，本发明的诱导培养基还可直接用于愈伤组织的增殖扩繁，无需额外再另配专用增殖培养基，达到一基多用，显著提高整体工作效率。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (6)

1.一种用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，其特征在于，以精胺作诱导剂制备诱导培养基进行烟草叶片外植体的愈伤组织诱导。
2.如权利要求1所述的用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，其特征在于，所述诱导培养基为配方为：MS+精胺0.5-3.0mg/L，pH为5.8～6.0。
3.如权利要求2所述的用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，其特征在于，所述烟草叶片外植体的获取方法为：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下，切成方片作为外植体，备用。
4.如权利要求3所述的用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，其特征在于，将自上至下的第3片叶在无菌条件下切除叶柄以上2mm和叶尖以下2mm的叶片部分，留叶片中间部分，再沿其主脉两侧分切成5mm×5mm的方片作烟草叶片外植体。
5.如权利要求2所述的用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，其特征在于，将烟草叶片外植体接种于灭菌后的诱导培养基中培养10-20天，获得烟草愈伤组织。
6.如权利要求2所述的用精胺诱导烟草愈伤组织的方法，其特征在于，所述诱导培养基中精胺的浓度为2.0-2.5mg/L。
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