CN106258972A - 一种油樟组织培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于木本植物无性繁殖技术领域，具体而言，涉及油樟无性繁殖的方法，尤其是油樟组织培养的方法，包括诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗，在诱导培养、增殖培养、生根培养的培养基中针对油樟所设计的有改良的MS培养基，可以有效提升油樟组织培养的成功率，可在短期内生产出大量油樟油含量一致，规格统一、种性稳定的油樟苗木，为油樟快速、高质量造林提供了方法。

Description

一种油樟组织培养的方法
技术领域
本发明涉及木本植物无性繁殖技术领域，具体而言，涉及油樟无性繁殖的方法。
背景技术
油樟系樟科樟属的珍贵树种，且油樟可用于提取樟油，具有广阔的市场前景。现今油樟的繁殖方法大多采用种子繁殖、扦插或压条繁殖。但是由于油樟种子含大量的油脂，容易丧失发芽能力，导致种子繁殖的成功率很低，同时如果采用实生苗造林，由于油樟子代产生性状分离，实生苗性状良莠不齐，从而导致油樟油的产量和质量都不高，影响造林后的经济效益。而采用扦插或压条的方法进行繁殖时，由于油樟是难生根植物，成功率也不高，而且采用扦插或压条繁殖的油樟苗生长缓慢、树形差且樟油产量较低。并且油樟优树的枝条数量有限，从而影响了扦插苗的产量，只有通过先生产出组培苗然后再用组培苗建立采穗圃，才可以进行大规模的扦插苗生产。因此油樟的繁殖一直是油樟大规模种植的急需解决的问题。
现今，虽然很多植物都采用组织培养的方法进行繁殖，但是油樟采用组织培养进行繁殖成功的还未见报告，油樟组织培养难以成功的原因主要为：
1.油樟枝叶含有的桉叶油素、香穗烯、樟脑、松香醇等油樟油含量是香樟枝叶含油率的1～2倍，导致其外植体在组培过程中极易褐化而死亡，从而造成组培失败的原因之一；
2.没有合适的油樟组培培养基，常规的MS、MT、White等培养基真对油樟诱导成功率较低，尤其是MS培养基并不适合启动培养；
3.樟类植物在组培过程中除了要有合适的培养基外，对光照强度和温度的要求极为严格，过高或过低都会造成继代材料生长缓慢或不生长严重的还会褐变死亡；
4.由于油樟是难生根植物，所以诱导油樟芽苗生根也存在一定的难度。
发明内容
针对上述问题，本发明提出了一种油樟组织培养的方法，可以有效实现油樟无性繁殖。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为，一种油樟组织培养的方法，包括诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗四个步骤，所述的诱导培养步骤所使用的启动培养基、增殖培养步骤所使用的继代培养基与生根培养步骤所使用的生根培养基中均含有改良MS培养基；所述的改良MS培养基在原MS培养基大量元素中加入1430mg/L的NaH2PO4，并更改KNO3浓度为1600mg/L、NH4NO3浓度为720mg/L，其余物质不变；所述的改良MS培养基在原MS培养基有机物质中加入泛酸钙1.2mg/L，并更改盐酸吡哆醇浓度为2.0mg/L、盐酸硫胺素浓度为3mg/L、烟酸浓度为10mg/L，其余物质不变。
进一步，所述的诱导培养、继代培养与生根培养步骤进行时，温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h，培养周期为30d～40d。
所述的启动培养基、继代培养基与生根培养基的pH值均为5.8～6.0。
进一步，所述的启动培养基为改良MS培养基+6BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+核黄素3mg/L+抗坏血酸1.5mg/L+白糖30g/L+卡拉胶5.4g/L，所述的启动培养基pH值为5.8～6.0。
进一步，所述的继代培养基为改良MS培养基+6BA1.5～1.8mg/L+NAA0.3～0.5mg/L+IBA0.3～0.5mg/L+核黄素3mg/L+L-半胱氨酸6mg/L+生物素0.2mg/L+抗坏血酸1.5mg/L+糖30g/L+卡拉胶5.4g/L，所述的继代培养基pH值为5.8～6.0。
进一步，所述的生根培养基为改良MS培养基+IBA0.5～0.9mg/L+NAA0.02～0.05mg/L+活性炭0.1～0.2g/L+白糖30g/L+卡拉胶5.4g/L，所述的生根培养基pH值为5.8～6.0。
作为优选，所述的诱导培养步骤为将表面灭菌处理后的油樟外植体，用手术刀和镊子将其切割成长0.8～1.2cm的茎段，每个茎段带一个腋芽，斜插接种到启动培养基上，培养室的温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h，培养时间为30d～40d。
作为优选，所述的的外植体为健康油樟的基部萌芽条上选取的当年生幼嫩枝条。
作为优选，所述的继代培养步骤为将继代苗切割成芽丛或带腋芽茎段接种到继代培养基上，每瓶接种芽丛或茎段不少于5个，每个芽丛芽数不少3个，每隔30d～40d将继代苗转接至新继代培养基，继代培养代数控制在30代内，培养室的温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h。
作为优选，所述的生根培养步骤为选择增殖培养30d后，高3.0cm以上，叶片正常展开的芽苗，通过无菌操作切取2.5cm左右的顶芽，接种到生根培养基上；每瓶接种单芽15个，培养室的温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h，培养时间为15d～25d。
作为优选，所述的炼苗步骤为当组培苗高度达到3.0cm以上,根长达1.0～1.5cm时,将组培苗从培养室移至炼苗温室或大棚进行炼苗，时间为10～15d，采用自然散射光，光照强度控制在5000～10000Lx，环境温度为20～32℃，避免强光直射和高温灼伤组培苗。
炼苗结束后即可进行移栽。
移栽过程指将炼苗所得生根苗长至3~5cm左右即可进行移栽至营养袋中。 移栽初期宜保持环境湿度80%~95%（如可覆盖薄膜进行保温保湿）；移栽初期须控制光照强度小于5000Lx，并逐渐加强光照，每天打开薄膜通风5min，以防病害，保持相对湿度90％以上，15d（冬季可适当延长至25d）后可逐渐揭开薄膜。同时注意遮荫，最终到全自然光照强度下培育苗木至出圃；移栽21d后，每7d喷施或淋施0.1%的复合肥溶液1次；移栽7d后,一个月内每7d轮流喷施多菌灵1000倍液或百菌清1000倍液，一个月后每30d轮流喷施。
本发明针对油樟组织培养过程中易褐化、难生根等情况，设定了一种改良MS培养基，可以有效促进油樟组织培养，符合油樟组织培养所需，且改良后的MS培养基克服了其本身不适合作为启动培养基的缺陷。本发明还针对不同培养时期所需添加不同的物质，且各阶段培养基pH值设定为5.8～6.0，可以有效提升有樟组织培养各步骤成功率；同时针对油樟培养设定了严格的温度与光照范围，可以有效提升油樟组织培养成功率。
L-半胱氨酸和抗坏血酸是抗氧化物，主要作用是防止植物组织在继代培养过程中褐变死亡。植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，渗出细胞外就造成自身中毒，使培养材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。在木本尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。常用的抗酚类氧化剂有半胱氨酸和抗坏血酸。 褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。
生物素和核黄素是维生素，在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育，在各种代谢过程中起着催化剂的作用。当植物细胞和组织离体生长时，也能合成一些必需的维生素，但不能达到植物生长的最佳需要量。因此，必须在培养基中添加必需的维生素和氨基酸，使植物组织健壮生长。比较常用的维生素是盐酸硫胺素（VB1）、盐酸吡哆醇（VB6）、烟酸（VB3）、肌醇等，盐酸硫胺素是所有细胞和组织必需的基本维生素。烟酸和盐酸吡哆醇常添加到培养基中，但对许多植物的细胞可能不是必需的。其他维生素如生物素（VH）、叶酸、抗坏血酸（VC）、泛酸钙、维生素E（生育酚）、核黄素和对氨基苯甲酸也常被使用。氨基酸类物质不仅为培养物提供有机氮源，同时也对外植体的生长以及不定芽、不定胚的分化起促进作用。
活性炭（AC）是一种吸附性较强的无机吸附剂，培养基中添加活性炭的主要作用是利用其吸附能力，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质等，防止酚类物质引起组织褐变死亡，从而有利于培养物的生长。在使用过程中应注意，尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响。其次是活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根；活性炭还可降低玻璃化苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。
以健康油樟的基部萌芽条上选取的当年生幼嫩枝条为外植体，活性强、生长速率快，从而保障了培养的油樟幼苗的含油量与生长速度。
通过本发明所述的方法可以对优选优良油樟单株进行组培快繁，在短期内可生产出大量油樟油含量一致，规格统一、种性稳定的油樟苗木，从而解决由于采用普通种子苗（实生苗）造林而产生的油樟油产量过低的问题；在香樟的组培苗和扦插苗及实生苗的生长量对比试验中，无论就组培苗的生长量和树型都远远优于普通实生苗和扦插苗，保障油樟造林的速度，且在造林过程中不影响原油樟的生长。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例1：一种油樟组织培养的方法，包括以下步骤：
1.诱导培养：将表面灭菌处理后的油樟外植体，用手术刀和镊子将其切割成长0.8～1.2cm的茎段，每个茎段带一个腋芽，斜插接种到启动培养基上，培养室的温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h，培养时间为30d～40d；所述的的外植体为健康油樟的基部萌芽条上选取的当年生幼嫩枝条；
2.继代培养：将继代苗切割成芽丛或带腋芽茎段接种到继代培养基上，每瓶接种芽丛或茎段不少于5个，每个芽丛芽数不少3个，每隔30d～40d将继代苗转接至新继代培养基，继代培养代数控制在30代内，培养室的温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h；
3.生根培养：选择增殖培养15d～25d后，高3.0cm以上，叶片正常展开的芽苗，通过无菌操作切取2.5cm左右的顶芽，接种到生根培养基上；每瓶接种单芽15个，培养室的温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h；
4.炼苗：当组培苗高度达到3.0cm以上,根长达1.0～1.5cm时,将组培苗从培养室移至炼苗温室或大棚进行炼苗，时间为10～15d，采用自然散射光，光照强度应控控制在5000～10000Lx，环境温度为20～32℃，避免强光直射和高温灼伤组培苗，炼苗结束之后即可对幼苗进行移植；
5.移栽：炼苗所得生根苗长至3~5cm左右即可进行移栽至营养袋中。 移栽初期宜保持环境湿度80%~95%（如可覆盖薄膜进行保温保湿）；移栽初期须控制光照强度小于5000Lx，并逐渐加强光照，每天打开薄膜通风5min，以防病害，保持相对湿度90％以上，15d（冬季可适当延长至25d）后可逐渐揭开薄膜。同时注意遮荫，最终到全自然光照强度下培育苗木至出圃；移栽21d后，每7d喷施或淋施0.1%的复合肥溶液1次；移栽7d后,一个月内每7d轮流喷施多菌灵1000倍液或百菌清1000倍液，一个月后每30d轮流喷施。
所述的启动培养基为改良MS培养基+6BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+核黄素3mg/L+抗坏血酸1.5mg/L+白糖30g/L+卡拉胶5.4g/L；所述的继代培养基为改良MS培养基+6BA1.5～1.8mg/L+NAA0.3～0.5mg/L+IBA0.3～0.5mg/L+核黄素3mg/L+L-半胱氨酸6mg/L+生物素0.2mg/L+抗坏血酸1.5mg/L+糖30g/L+卡拉胶5.4g/L；所述的生根培养基为改良MS培养基+IBA0.5～0.9mg/L+NAA0.02～0.05mg/L+活性炭0.1～0.2g/L+白糖30g/L+卡拉胶5.4g/L，所述的启动培养基、继代培养基与生根培养基的pH值均为5.8～6.0。
所述的改良MS培养基在原MS培养基大量元素中加入1430mg/L的NaH2PO4，并更改KNO3浓度为1600mg/L、NH4NO3浓度为720mg/L，其余物质不变；所述的改良MS培养基在原MS培养基有机物质中加入泛酸钙1.2mg/L，并更改盐酸吡哆醇浓度为2.0mg/L、盐酸硫胺素浓度为3mg/L、烟酸浓度为10mg/L，其余物质不变。
采用以上方法进行油樟组织培养成功率不低于95%。
实施例2：一种油樟组织培养的方法，包括诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗四个步骤，所述的诱导培养步骤所使用的启动培养基、增殖培养步骤所使用的继代培养基与生根培养步骤所使用的生根培养基中均含有改良MS培养基；所述的改良MS培养基在原MS培养基大量元素中加入1430mg/L的NaH2PO4，并更改KNO3浓度为1600mg/L、NH4NO3浓度为720mg/L，其余物质不变；所述的改良MS培养基在原MS培养基有机物质中加入泛酸钙1.2mg/L，并更改盐酸吡哆醇浓度为2.0mg/L、盐酸硫胺素浓度为3mg/L、烟酸浓度为10mg/L，其余物质不变，在炼苗结束后，即可进行移栽。
所述的诱导培养、继代培养与生根培养步骤进行时，温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h。
所述的启动培养基为改良MS培养基+6BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+核黄素3mg/L+抗坏血酸1.5mg/L+白糖30g/L+卡拉胶5.4g/L，所述的启动培养基pH值为5.8～6.0。
所述的继代培养基为改良MS培养基+6BA1.5～1.8mg/L+NAA0.3～0.5mg/L+IBA0.3～0.5mg/L+核黄素3mg/L+L-半胱氨酸6mg/L+生物素0.2mg/L+抗坏血酸1.5mg/L+糖30g/L+卡拉胶5.4g/L，所述的继代培养基pH值为5.8～6.0。
所述的生根培养基为改良MS培养基+IBA0.5～0.9mg/L+NAA0.02～0.05mg/L+活性炭0.1～0.2g/L+白糖30g/L+卡拉胶5.4g/L，所述的生根培养基pH值为5.8～6.0。
所述油樟组织培养方法所采用的外植体为健康油樟的基部萌芽条上选取的当年生幼嫩枝条。
实施例3：一种油樟组织培养的方法，包括诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗四个步骤，所述的诱导培养步骤所使用的启动培养基、增殖培养步骤所使用的继代培养基与生根培养步骤所使用的生根培养基中均含有改良MS培养基；所述的改良MS培养基在原MS培养基大量元素中加入1430mg/L的NaH2PO4，并更改KNO3浓度为1600mg/L、NH4NO3浓度为720mg/L，其余物质不变；所述的改良MS培养基在原MS培养基有机物质中加入泛酸钙1.2mg/L，并更改盐酸吡哆醇浓度为2.0mg/L、盐酸硫胺素浓度为3mg/L、烟酸浓度为10mg/L，其余物质不变。
所述的诱导培养、继代培养与生根培养步骤进行时，温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h。
所述的启动培养基、继代培养基与生根培养基的pH值均为5.8～6.0。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，在本发明的精神和原则内可以有各种更改和变化，这些等同的变型或替换等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种油樟组织培养的方法，包括诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗四个步骤，其特征在于：所述的诱导培养步骤使用启动培养基、增殖培养步骤使用继代培养基、生根培养步骤使用生根培养基，所述的启动培养基、继代培养基与生根培养基中均含有改良MS培养基；所述的改良MS培养基在原MS培养基大量元素中加入1430mg/L的NaH2PO4，并更改KNO3浓度为1600mg/L、NH4NO3浓度为720mg/L，其余物质不变；所述的改良MS培养基在原MS培养基有机物质中加入泛酸钙1.2mg/L，并更改盐酸吡哆醇浓度为2.0mg/L、盐酸硫胺素浓度为3mg/L、烟酸浓度为10mg/L，其余物质不变。
2.根据权利要求1所述的一种油樟组织培养的方法，其特征在于：所述的诱导培养、继代培养与生根培养步骤进行时，温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h，培养周期为30d～40d。
3.根据权利要求1所述的一种油樟组织培养的方法，其特征在于：所述的启动培养基为改良MS培养基+6BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+核黄素3mg/L+抗坏血酸1.5mg/L+白糖30g/L+卡拉胶5.4g/L，所述的启动培养基pH值为5.8～6.0。
4.根据权利要求1所述的一种油樟组织培养的方法，其特征在于：所述的继代培养基为改良MS培养基+6BA1.5～1.8mg/L+NAA0.3～0.5mg/L+IBA0.3～0.5mg/L+核黄素3mg/L+L-半胱氨酸6mg/L+生物素0.2mg/L+抗坏血酸1.5mg/L+糖30g/L+卡拉胶5.4g/L，所述的继代培养基pH值为5.8～6.0。
5.根据权利要求1所述的一种油樟组织培养的方法，其特征在于：所述的生根培养基为改良MS培养基+IBA0.5～0.9mg/L+NAA0.02～0.05mg/L+活性炭0.1～0.2g/L+白糖30g/L+卡拉胶5.4g/L，所述的生根培养基pH值为5.8～6.0。
6.根据权利要求1或2所述的一种油樟组织培养的方法，其特征在于：所述的诱导培养步骤为将表面灭菌处理后的油樟外植体，用手术刀和镊子将其切割成长0.8～1.2cm的茎段，每个茎段带一个腋芽，斜插接种到启动培养基上，培养室的温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h，培养周期为30d～40d。
7.根据权利要求6所述的一种油樟组织培养的方法，其特征在于：所述的外植体为健康油樟的基部萌芽条上选取的当年生幼嫩枝条。
8.根据权利要求1或2所述的一种油樟组织培养的方法，其特征在于：所述的继代培养步骤为将继代苗切割成芽丛或带腋芽茎段接种到继代培养基上，每瓶接种芽丛或茎段不少于5个，每个芽丛芽数不少3个，每隔30d～40d将继代苗转接至新继代培养基，继代培养代数控制在30代内，培养室的温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h。
9.根据权利要求1或2所述的一种油樟组织培养的方法，其特征在于：所述的生根培养步骤为选择增殖培养30d～40d后，高3.0cm以上，叶片正常展开的芽苗，通过无菌操作切取2.5cm左右的顶芽，接种到生根培养基上；每瓶接种单芽15个，培养室的温度控制在26℃±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为每天10～12h，培养时间为15d～25d。
10.根据权利要求1所述的一种油樟组织培养的方法，其特征在于：所述的炼苗步骤为当组培苗高度达到3.0cm以上,根长达1.0～1.5cm时,将组培苗从培养室移至炼苗温室或大棚进行炼苗，时间为10～15d，采用自然散射光，光照强度控制在5000～10000Lx，环境温度为20～32℃。
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