CN106258085A - 一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，将铁皮石斛种子粉末收集到锥形瓶中，加吐温溶液，静置4h。随后，过滤收集种子，并冲洗，再置入升汞溶液中浸泡消毒15min。最后，过滤收集种子，并冲洗后，播种到培养基上。本发明采用浸泡消毒的方式处理铁皮石斛种子，杀菌率和萌发率均在90%以上，有利于提高铁皮石斛野生资源的保护和利用效率，用于稳定工厂化生产的植株性状和品质。

Description

一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，属于铁皮石斛种子无菌播种技术领域。

背景技术

铁皮石斛（Dendrobium officinate Kimura et Migo） 是兰科石斛属多年生附生型草本植物，生于海拔2100~2500m的林中树上或林缘岩石上。铁皮石斛具有滋阴清热、养胃生津、润肺止咳等功效，具有较高的药用价值。近年来，铁皮石斛野生资源遭到大量采挖、破坏，并逐年减少，现已处于濒危状态，被国家列为重点保护的野生药材品种。

野生状态下，铁皮石斛生长缓慢，从开花授粉至果实成熟约需6个月。且由于其花型结构特殊，导致授粉困难，自然条件下所结蒴果极少。铁皮石斛每粒蒴果内有数以万计的种子，但种子细小、没有胚乳，因而无法靠自身储存的养分生长。在野外，蒴果成熟时容易裂开， 种子随风飘散，自然繁殖率极低。

目前，运用组织培养技术已实现铁皮石斛的工厂化生产。由于铁皮石斛种子数量庞大，可直接获得大量种苗，而无菌播种是实现种苗高效萌发的基础。现有技术方案，将成熟的蒴果收集保存于冷藏室中，需要播种时取出。用手术刀片把花蒂一端削平，依次使用酒精和升汞溶液进行浸泡消毒，随后使用无菌水冲洗后，将蒴果剖开取出种子，均匀地散布于萌发培养基上。但是，由于蒴果在冷存、取用、操作过程中难免发生破损，且成熟的铁皮石斛蒴果极易开裂，上述消毒方法并不适用于细小且数量庞大的铁皮石斛种子消毒。鉴于铁皮石斛野生资源濒危现状，应采取有效措施最大程度地利用现有资源，才能保证铁皮石斛拥有足够丰富的种质资源用于植株复壮，以避免长期工厂化育苗导致的种苗性状衰退和药效降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，能够消毒铁皮石斛的种子并进行无菌播种，其种子杀菌率和萌发率均在90%以上，本发明提高了铁皮石斛野生资源的保护和利用效率，有利于稳定工厂化生产的植株性状和品质。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，其特征在于包括以下步骤：

a）将铁皮石斛种子粉末收集到锥形瓶中，加吐温溶液，搅拌制得种子悬浊液，静置4h；

b）过滤，收集种子，并使用清水冲洗3~5次；

c）将步骤b）收集到的种子，投入装有升汞溶液的锥形瓶中浸泡15min，进行消毒；

d）过滤，得到消毒后的种子，并使用无菌水冲洗3~5次；

e）将步骤d）收集到的种子，拨到铁皮石斛种子萌发培养基上进行培养。

作为本发明优选方案，步骤a）和步骤c）采用的锥形瓶容量为50ml。

作为本发明优选方案，步骤c）所述升汞溶液浓度为1mg/ml，体积为45ml。

作为本发明优选方案，步骤b）和步骤d）采用150目铜网进行过滤。

进一步地，步骤d）所述铜网采用高温高压灭菌。

作为本发明优选方案，步骤c）~步骤e）均在超净工作台中进行。

作为本发明优选方案，步骤c）所述锥形瓶采用高温高压灭菌。

作为本发明优选方案，步骤c）在浸泡到7min时，进行搅动。

进一步地，步骤c）使用高温高压灭菌后的滴管进行所述搅动。

本发明的有益效果是：

1. 本发明采用浸泡消毒的方式处理铁皮石斛种子，杀菌效率高；且升汞溶液对种子的毒害作用较小，不影响其正常萌发。

2. 本发明能够单独处理铁皮石斛数量庞大且细小的种子，显著提高了种质资源的有效利用率。一方面有利于降低工厂化生产成本，另一方面有利于保护野生种质资源，便于维护植株性状和品质。

具体实施方式

结合实施例详细阐述本发明的具体实施方式如下。

实施例

（1）种子预处理

取一粒开裂的铁皮石斛蒴果，将其种子粉末收集到一个50ml锥形瓶内，加入40ml质量体积比浓度为0.5%的吐温20溶液，搅拌至形成种子悬浊液。静置4h后，用150目铜网做的漏斗进行过滤。过滤得到的种子，使用清水冲洗5次，每次冲洗时间不少于30s。

（2）器具消毒

将50ml锥形瓶、150目铜网漏斗、胶头滴管、镊子、种子萌发培养基等器具放入高压灭菌锅中，121℃灭菌15min。取出后，放入超净工作台中待用。

（3）种子消毒

超净工作台中，在灭菌后的锥形瓶内加入45ml浓度为1mg/ml的升汞溶液作为种子消毒剂。将步骤（1）处理后的种子拨入消毒剂中，使用灭菌后的胶头滴管吹打、混匀，静止7min后，重复一次吹打、混匀过程，再静止7min。

（4）无菌播种

使用灭菌后的铜网漏斗过滤步骤（3）的消毒剂，使用无菌水冲洗铜网漏斗中的种子5次，每次冲洗时间不少于1min。取灭菌后的种子萌发培养基，使用灭菌后的镊子夹取冲洗后的种子，在培养基表面上布匀，完成无菌播种。

对上述方案进一步说明如下：

采用吐温溶液对铁皮石斛细小的种子进行包裹，有利于降低种子地表面张力，一方面便于这些种子分散开，并能够悬浮在溶液中，而不是漂浮在溶液表面；另一方面，吐温溶液能够促进后续消毒液的展布速度和在种子表面的渗透速度，有利于提高种子杀菌效率。

升汞溶液作为消毒剂，处理时间短，杀菌效果好，因而被广泛应用于组培外植体前处理。本发明采用升汞溶液浸泡处理铁皮石斛种子，在消毒过程中途采用滴管吹打的方式进行搅拌，混匀方式柔和，有利于避免损伤种子。

由于吐温和升汞对种子均具有一定的杀伤性，因而操作时间必须准确。

种子消毒以及播种的全过程均在超净工作台中进行，实现无菌播种，保证种子萌发率。

选用铜网作为过滤装置，其原因在于：升汞溶液具有一定的腐蚀性，而铜具备一定的抗腐蚀能力，且铜网易于清理和消毒，流阻小。150目的滤网筛选的最小粒度为100微米左右，与铁皮石斛种子粒度相匹配。

一粒铁皮石斛蒴果的种子，使用30~40ml溶液能够达到充分分散效果。过大的容器易于导致种子损耗，因而采用50ml锥形瓶。

采用上述方案进行无菌播种的铁皮石斛种子，平均杀菌率90.6%，22℃培养20天，种子萌发率93.2%。

Claims (9)

1.一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，其特征在于包括以下步骤：

a）将铁皮石斛种子粉末收集到锥形瓶中，加吐温溶液，搅拌制得种子悬浊液，静置4h；

b）过滤，收集种子，并使用清水冲洗3~5次；

c）将步骤b）收集到的种子，投入装有升汞溶液的锥形瓶中浸泡15min，进行消毒；

d）过滤，得到消毒后的种子，并使用无菌水冲洗3~5次；

e）将步骤d）收集到的种子，拨到铁皮石斛种子萌发培养基上进行培养。

2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，其特征在于，步骤a）和步骤c）采用的锥形瓶容量为50ml。

3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，其特征在于，步骤c）所述升汞溶液浓度为1mg/ml，体积为45ml。

4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，其特征在于，步骤b）和步骤d）采用150目铜网进行过滤。

5.根据权利要求4所述的一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，其特征在于，步骤d）所述铜网采用高温高压灭菌。

6.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，其特征在于，步骤c）~步骤e）均在超净工作台中进行。

7.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，其特征在于，步骤c）所述锥形瓶采用高温高压灭菌。

8.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，其特征在于，步骤c）在浸泡到7min时，进行搅动。

9.根据权利要求7所述的一种铁皮石斛蒴果开裂后种子的无菌播种方法，其特征在于，使用高温高压灭菌后的滴管进行所述搅动。