CN1062566C - 核素标记免疫球蛋白m单抗片段 - Google Patents
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Abstract
一种核素标记IgM单抗片段,是由单克隆抗体LC-1IgM经胰蛋白酶酶解得单抗片段。该片段具有很强的免疫活性,通过SPS_PAGE分离,考马斯蓝染色,电泳后分出两条蛋白带,一条是重链78KD,另一条是轻链23KD。单抗片段用维生素C还原后与99mTc进行标记,标记率可达96%以上。核素标记IgM单抗片段注射入肺癌病人体内,观察到核素能浓聚于肺癌病灶上,显像十分清晰。是一种很有应用前景的用作为人体肿瘤免疫放射显像定位诊断试剂的医药制品。
Description
本发明涉及含有单克隆抗体的医药制品。进一步讲是关于单克隆抗体酶解成单抗片段,再进行还原与核素标记,以及用作为人体肿瘤免疫放射显像定位诊断试剂的医药制品。
具有免疫特异性的单克隆抗体LC-1(葛锡锐等,实验生物学报,22(3),359-365,1989)是一种大分子量的免疫球蛋白IgM。近年来用125I、131I等同位素标记LC-1 IgM进行体内外试验,证明该单抗对肺癌是相对特异的,在荷人肺腺癌裸鼠体内观察到核素浓聚于肺癌病灶区域(王升年等,细胞生物学杂志,16,145,1994)。但注射到肺癌患者体内未能观察到抗体聚集现象。按IgM结构来看,可能是分子量大,穿透组织能力弱之故。因此林斯骏等曾用二硫苏糖醇(DTT)降解LC-1 IgM,获得纯净的118KD片段,该片段与131I和99mTc均能标记,标记物在荷人肺腺癌裸鼠体内的肺癌病灶上能浓聚而显像(林斯骏等,中华核医学杂志,14,(4),227-229,1994)。但在肺癌患者体内仍未能观察到核素抗体聚素现象。新近,林斯骏等又采用胰蛋白酶酶解得LC-1 IgM片段,经维生素C还原,再用99mTc标记,标记物注入肺癌患者体内,24小时后,同位素扫描观察到核素抗体浓聚于人体肺癌病灶上(林斯骏等,上海医科大学学报,21(5),395,1994)。但该文仅是初步工作结果的通讯报道,无详细内容,有待进一步研究工作。
为此,本发明目的是在上述初步工作的基础上进一步详细提供,采用胰蛋白酶酶解单抗LC-1 IgM制得的单抗片段,经维生素C还原及用99mTc标记而得的一种核素标记IgM单抗片段,标记率可达96%以上。本发明另一目的是该核素标记IgM单抗片段是可用作为人体肺癌免疫放射显像定位诊断试剂的医药制品。
本发明核素标记IgM单抗片段,它是由单克隆抗体LC-1 IgM经胰蛋白酶酶解后,通过Sephadex(交联葡聚糖凝胶)柱分离获得LC-1 IgM片段,以ELISA(酶联免疫吸收测定)检测表明片段有免疫活性,并通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳)分离,电泳后分出两条蛋白带,一条是重链78KD,另一条是轻链23KD。片段用维生素C还原及99mTc进行标记,标记率可达96%以上。将本发明99mTc-LC-1 IgM注射入肺癌患者体内6-28小时后,用同位素扫描,显示出核素能浓聚于肺癌病灶上,显像十分清晰,表明本发明能用于人体肺癌的显像定位诊断。
本发明的技术方案详细叙述如下:
1、单克隆抗体LC-1 IgM的提取与纯化
首先将含LC-1 IgM的小鼠腹水用氯化钙溶液处理得LC-1 IgM粗制品,再通过Sephadex柱分离纯化得精制品,用紫外分光光度计,波长280nm测定,收集OD值大于0.2的LC-1 IgM作为酶解片段的原料。
2、单克隆抗体LC-1 IgM片段的制备
单克隆抗体LC-1 IgM经胰蛋白酶进行酶解反应,酶解时采用单克隆抗体与酶的重量比例为100∶1-10,酶解温度为20-28℃,酶解时间为30-80分钟,酶解反应在惰性气体保护下进行,惰性气体如氮气,氩气,氦气等,最佳是氮气。然后加入酶解抑制剂于20-28℃,继续温育15分钟,终止反应。此反应液上Sephadex柱,用PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)液洗脱,分离收集OD值大于0.2的LC-1 IgM片段。该片段经SDS-PAGE分离,考马斯蓝染色,电泳后分出两条蛋白带,一条是重链78KD,另一条是轻链23KD(见图1)。
对上述制得的单克隆抗体LC-1 IgM片段进行免疫活性鉴定。将上Sephadex柱分离得的LC-1 IgM片段,把该片段用维生素C还原,将还原前后的片段进行ELISA检测吸光度A,结果见表1。
表1表明单抗LC-1 IgM片段比正常小鼠IgM片段的免疫活性强,说明单抗LC-1 IgM片段对肺腺癌细胞抗原是特异反应。表1也表明单抗LC-1 IgM片段用维生素C处理后,片段上的二硫键还原为巯基,此还原片段仍保持未还原片段的免疫活性。
3、单克隆抗体IC-1 IgM片段无热原反应证明
单克隆抗体LC-1 IgM片段必须无热原,否则会引起病人发烧或休克。为此,必须控制LC-1 IgM片段的质量,一切操作均在无菌室进行,并经鲎试验和兔子试验证明无热原反应。热原的鲎试验按上海医工院的鲎试剂说明书进行,兔子试验按上海长征制药厂质监科办法进行。
4、单克隆抗体LC-1 IgM片段的还原及标记
单克隆抗体LC-1 IgM片段与99mTc的结合是通过片段上巯基直接结合而实现的,片段上的巯基数越多,与99mTc结合的机会也越多,标记率也就越高。为了增加片段上的巯基数目,LC-1 IgM片段用维生素C进行还原。在还原反应中片段与维生素C的重量比例为1∶0.4-1.2,温度是20-28℃,时间是50-80分钟。当维生素C还原反应进行到还剩30分钟时,另外开始用连二硫酸钠对99mTc进行还原处理,以IgM单抗片段体积及99mTc体积之和总体积的每毫升中加入0.5-1.5mg的连二硫酸钠进行还原反应。两步反应结束后合并一起,进行片段的标记。以上这些反应过程也都是在惰性气体保护下进行。用常规纸层析法测得标记率达96%以上。这表明IgM单抗片段与99mTc结合很牢固,不易水解。这样的核素标记IgM单核片段进入人体也不易水解,可以汇聚于肺癌病灶上而显像。
99mTc是目前国际上广泛应用的标记核素之一,由于它放射性半衰期短,为6小时,发射低能的γ射线,适合显像,对核医学应用很合适。它的辐射吸收量较低,可允许较大剂量,例如对一个肺癌患者注入20-40毫居量,没有不良反应,游离锝很快排出体外。
5、核素标记IgM单抗片段在裸鼠移植人肺癌中的显像。
裸鼠显像是人体试验前的必要阶段。在裸鼠皮下接种人肺腺癌细胞,待肿瘤生长到1-1.5cm时,可供试验使用。从荷人肺腺癌裸鼠尾静脉注入99mTc-LC-1 IgM片段18小时后,用同位素扫描观察到核素浓集于肺癌病灶处。见图2,图中箭头所指即为肺腺癌病灶处。
6、核素标记IgM单抗片段对人体肺癌的显像定位诊断。
对肺癌患者注射标记物前,先静脉注射地塞米松,后注射99mTc-LC-1 IgM片段,剂量是0.6-2.5mg片段/20-40毫居里,都能显像,没有不良反应,最佳注射剂量是1-1.5mg片段/20-40毫居里。下面以患者右肺上有肺癌病灶为例说明之。将99mTc-LC-1 IgM片段注入体内后,经6.18和28小时,分别以同位素扫描观察,6小时右肺阴影比左肺浓些,18小时游离核素基本消失,右肺肺癌病灶处的阴影增浓,病灶轮廓显露出原形,病灶显像清晰,28小时病灶轮廓仍然清晰,但稍欠于18小时的图像。图3所示注射后18小时同位素扫描显像的图片与X光片图像的比较。上面X光片图像显示出病人右上肺有一个较大肿块,纤维支气管镜检查为新生物,下面为注射后18小时同位素扫描显像,清楚表明病灶是一种癌块,显示出单抗LC-1 IgM片段的免疫特异性,证明了本发明核素标记IgM单抗片段99mTc-LC-1 IgM能浓聚于肺癌病灶处而显像,因此本发明是可以用作为人体肺癌免疫放射显像定位诊断试剂的医药制品。
本发明优点,核素标记免疫球蛋白M单抗片段含有重链78KD和轻链23KD的IgM单抗片段,它具有很强的免疫活性,对肺癌细胞抗原有免疫特异性,经维生素C还原及99mTc标记,标记率可达96%以上。将该核素标记IgM单抗片段注入肺癌患者体内18小时后,用同位素扫描观察,核素能浓聚于肺癌病灶上,显像十分清晰,放射显像定位诊断阳性率可达80%以上。因此本发明可用于肺癌患者的免疫放射显像定位诊断,是一种很有应用前景的用作为人体肺瘤免疫放射显像定位诊断试剂的医药制品。
附图说明:
图1单克隆抗体LC-1 IgM片段经SDS-PAGE分离,考马斯蓝染色的条带图。
图2在荷人肺腺癌裸鼠体内病灶的显像图,箭头所指即为肺腺癌病灶处。
图3肺癌患者注射99mTc-LC-1 IgM片段后18小时同位素扫描显像图(下面)与X光片图像(上面)比较。
本发明通过以下实施例作进一步阐述,但并不限止本发明的范围。
实施例1
单克隆抗体LC-1 IgM的提取与纯化
将含LC-1 IgM的小鼠腹水100ml加10ml 0.25M氯化钙溶液混合后离心,取上清液。马上清液装入透析袋,放入无热原水中透析,4℃环境中,三天后取出(每天换水两次),用离心机10,000转/分离心30分钟,取沉淀,用无热原的0.1M PBS溶解,(0.1M PBS配法是0.2M磷酸缓冲液250ml+4N NaCl 18.75ml+无热原水至500ml)经离心机2500转/分离心10分钟,取上清液,用紫外分光光度计,波长280nm,测定蛋白质含量,即得IgM粗制品,分装于小离心管中,每管1ml,存于-10℃冰箱中待用。
再取IgM粗制品30毫克,上交联葡聚糖凝胶G200(购自Sigma公司)柱,用0.1M PBS洗脱,以每10秒一滴的速度用部分收集器,每隔20分钟收一管,然后逐一用紫外分光光度计,波长280nm测定,收集OD值大于0.2的第一峰,计算好蛋白质含量后,分装于小离心管中,每管1ml,存于-10℃待用。
注:本实施例以及下面各实施例中的溶液配制所有用水都用无热原水,容器都用180℃消毒2小时后使用。
实施例2单克隆抗体LC-1 IgM片段的制备:
取上述含有纯化的1.5mg LC-1 IgM一管,用蒸馏水解冻后,吸入10ml的无热原指管中,加入IgM重量5%的胰蛋白酶(购自Sigma公司)75微克,迅速充进氮气后,管口用橡皮塞塞紧,并且用塑料膜封口,保证不漏气。(胰蛋白酶溶液配制法:1mg胰蛋白酶/1ml 0.05 M Tris,0.05MTris用0.5M Tris-HCl pH8.0稀释而成),将充好氮气的IgM指管夹于振荡器的夹头中放入24℃水浴槽中,振荡60分钟。取出振荡后的指管,开口。加入三倍于胰蛋白酶量的大豆抑制剂225微克,(以1mg大豆抑制剂/1ml 0.05MTris加入),再充入氮气封口,重新放入24℃水浴中振荡15分钟后取出。将上述处理后的LC-1 IgM上交联葡聚糖凝胶G50(或G25)(购自Sigma公司)柱,用0.1M PBS无热原洗脱液,以4秒一滴的流速,用部分收集器收集OD值大于0.2的片段第一峰共1.26mg/每管5ml。该片段经SDS样品处理液处理,经SDS-PAGE分离,考马斯蓝染色,电泳时采用12%凝胶浓度,电泳后分出两条蛋白带,一条是重链78KD,另一条是轻链23KD,见图1。
实施例3单克隆抗体LC-1 IgM片段的制备
酶解时加入IgM重量1%的胰蛋白酶15微克及放入20℃水浴槽中振荡80分钟,其余步骤同实施例1,最后用部分收集器收集OD值大于0.2的片段第一峰共0.8mg/每管5ml。
实施例4单克隆抗体LC-1 IgM片段的制备
酶解时加入IgM重量10%的胰蛋白酶150微克及放入28℃水浴槽中振荡30分钟,其余步骤同实施例1,最后用部分收集器收集OD值大于0.2的片段第一峰共1.3mg/每管5ml。
实施例5单克隆抗体LC-1 IgM片段的还原与标记
将上述实施例2所得的含1.26mg/5ml片段的指管中加入其重量的80%的维生素C 1008微克和维生素C钠盐1008微克(以维生素C 10mg/1m10.1M PBS,维生素C钠盐10mg/1m10.1M PBS加入),迅速充氮,封口。将该指管夹入振荡器夹头中,放入24℃水浴中振荡60分钟。
当维生素C还原反应进行还剩30分钟时,另外开始进行99mTc(购自北京原子核研究所)的还原,将99mTc 5ml+片段5ml共10ml加入含有连二硫酸钠10mg的溶液中(连二硫酸钠10mg/1m10.05M碳酸氢钠溶液)充入氮气后密封,放入24℃水浴中作用30分钟。
上述两步反应结束后,合并于同位素瓶中,充入氮气,迅速密封瓶口,在24℃水浴中作用3小时,每隔20分钟摇动一次,水浴是在铅玻璃保护下进行。三小时后,用毛细管吸取样品,点在新华一号滤纸条中,将纸条放入生理盐水中扩散,当扩散至离顶端1cm处停止,并剪成三段,测CPM(同位素计算量),结合点在原点处,测得标记率为98%。
实施例6单克隆抗体LC-1 IgM片段的还原与99mTc标记
将IgM片段加入其重量的40%的维生素C504微克和维生素C钠盐504微克,放入20℃水浴中共振荡80分钟,其余步骤同实施例5,测得标记率为96%。
实施例7单克隆抗体LC-1 IgM片段的还原与99mTc标记
将IgM片段加入其重量的120%的维生素C 1512微克和维生素C钠盐1512微克,放入28℃水浴中共振荡50分钟,其余步骤同实施例5,测得标记率为96.5%。
实施例8核素标记IgM单抗片段在荷人肺腺癌裸鼠体内的显像
把培养的人肺腺癌细胞株SPC-A-1(由中科院上海细胞生物学研究所细胞免疫组提供)接种于裸鼠皮下,得肿瘤块长到1-1.5cm时,供试验使用。从荷人肺腺癌裸鼠尾静脉注入剂量为0.3mg片段/4毫居里的99mTc-LC-1 IgM片段,经18小时,用同位素扫描,显示核素能浓集于肺癌病灶处,见图2。
实施例9核素标记IgM单抗片段在人体肺癌中的显像定位诊断
在上海医科大学中山医院及中国医学科学院协和医院中进行临床试验。对48个肺癌病人(均经手术或病理证实),注射剂量为1-1.5mg片段/20-40毫居里的99mTc-LC-1 IgM片段进行放射显像定位诊断,阳性率达80%以上。临床显像结果见下列表2。
一个典型的病例试验如下:
中山医院核医学科病人,病理报告是低分化肺腺癌,X光显示右肺上叶大片阴影。采用核素标记IgM单抗片段放射诊断试剂进行显像定位诊断,核素标记抗体显像呈阳性。注射的99mTc-LC-1 IgM剂量是1.5mg片段/40毫居里,将片段标记物经0.22-0.45μ无菌滤器过滤后,注入病人的静脉。在这之前先在病人静脉中注入2支(5mg/支)地塞米松。注射后18小时用SPECT扫描观察到核素浓聚病人的病灶处,病灶显像清晰,显示右肺上叶有肺腺癌病灶(见图3)。
Claims (9)
1、一种核素标记免疫球蛋白M(IgM)单抗片段,它是由单克隆抗体IgM经胰蛋白酶酶解得单抗片段,再经维生素C还原与核素99mTc结合标记而成,其特征在于所述酶解得的单抗片段经SDS-PAGE分离,考马斯蓝染色,电泳后分出两条蛋白带,一条是重链78KD,另一条是轻链23KD。
2、如权利要求1所述的核素标记IgM单抗片段,其特征在于所述单克隆抗体IgM经胰蛋白酶酶介得单抗片段时的酶解温度为20-28℃,酶解时间为30-80分钟,单克隆抗体与酶的重量比例为100∶1-10,酶解反应在惰性气体保护下进行。
3、如权利要求1所述的核素标记IgM单抗片段,其特征在于所述单抗片段经维生素C还原时的温度为20-28℃,时间为50-80分钟,单抗片段与维生素C的重量比例为1∶0.4-1.2,还原反应是在惰性气体保护下进行。
4、如权利要求1所述的核素标记IgM单抗片段,其特征在于所述的核素99mTc是经过以IgM单抗片段体积及99mTc体积之和总体积的每毫升中加入0.5-1.5mg的连二硫酸钠进行还原反应的处理,该还原反应是在惰性气体保护下进行。
5、如权利要求1所述的核素标记IgM单抗片段,其特征在于经维生素C还原的IgM单抗片段与99mTc结合进行片段标记,该过程是在惰性气体保护下进行。
6、如权利要求2、3、4或5所述的核素标记IgM单抗片段,其特征在于所述惰性气体是氮气。
7、一种用作为人体肺癌免疫放射显像定位诊断试剂的医药制品,其特征在于该医药制品含有权利要求1所述的核素标记IgM单抗片段。
8、如权利要求7所述的医药制品,其特征在于所述医药制品的注射剂量是0.6-2.5mg片段/20-40毫居里的99mTc-LC-1 IgM片段。
9、如权利要求8所述的医药制品,其特征在于所述医药制品的注射剂量是1-1.5mg片段/20-40毫居里的99mTc-LC-1 IgM片段。
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