CN106250683B - 用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及荧光寿命成像领域，为拓展在相同激光频率条件下的荧光寿命估算范围，进而提高寿命估算准确度。本发明对RLD预估算方法进行了改进，避免了迭代运算。本发明采用的技术方案是，用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法，包括如下步骤：待还原的衰减寿命为τ，时域时间相关单光子计数TCSPC系统采用的激光频率为F，记录到的总光子数为N_C，量化得到的光子到达时间总和为N_T；定义阈值并进行判定，低于阈值时采用采用非线性一次迭代补偿寿命偏差，否则通过RLD方法估算出荧光寿命，再通过非线性补偿进行校正后得到最终荧光寿命。本发明主要应用于荧光寿命成像产品设计制造场合。

Description

用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法

技术领域

本发明涉及荧光寿命成像领域，尤其是实时荧光衰减寿命的估算算法。适用于高速荧光寿命分析。具体讲，涉及硬件可执行的质心算法(Center of Mass Method,CMM)，尤其涉及用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法。

背景技术

荧光寿命不受激发光强度变化、荧光团的浓度和环境吸收等因素的影响，具有非常高的灵敏度和分子特异性。荧光寿命成像通过荧光示踪剂分子在不同环境中激发荧光衰减时间的不同，对微环境进行定量测量。荧光成像分析技术广泛应用于生命科学、医学等领域，如临床医疗诊断、血液病理学研究、离子浓度与氧压测定等。

在衰减寿命的估算方法中，质心算法相比迭代算法具有计算量小的优势，且能够通过硬件或片上资源执行运算。此外，质心算法在所有的寿命还原算法中具有最高的光子利用效率。适合应用于具有较高光子收集效率的时间相关单光子计数(Time-correlatedsingle-photon counting,TCSPC)系统中，与能够兼容CMOS工艺的单光子雪崩二极管(Single Photon Avalanche Diode,SPAD)也有较好的处理兼容性。

对于单指数响应的荧光寿命衰减曲线：

其中f(t)为激发荧光的强度，A为激发荧光强度的幅度，t为以荧光分子受激时刻为起点的时间轴，τ为待还原的荧光分子衰减寿命。荧光光子激发后，通过时间数字转换器(Time-to-digital Converter,TDC)量化光子到达时间，在探测时间内，通过绘制不同光子到达时间的光子计数值分布图，进行寿命还原，如图1所示。采用质心算法直接得到的质心寿命为：

其中T为激光周期。通过公式(2)可以看出，CMM算法直接估算出的寿命τ_CM与样本待还原寿命τ有偏差，偏差量为公式(2)最后一项。通常需要对直接得到的粗糙的估算寿命进行校正，即补偿公式(2)最后一项所带来的偏差。传统的非线性校正方法是直接估算出的寿命τ_CM直接带入到公式(2)中最后一项的τ中，进行近似补偿。通过传统非线性补偿进行校正后得到的寿命为：

传统的CMM校正方法是把通过近似寿命的一次迭代进行非线性补偿。当所探测的荧光寿命较短时，其精确度较好；但当所探测的荧光寿命与激光周期相近时，由于非线性补偿的偏离变得严重，对质心点的补偿能力下降，寿命还原的精确度快速降低。因此传统非线性补偿方法在估算长时间衰减的荧光分子时，需要配合更低频率的激光。同时这也降低了成像系统的帧频，增加了系统功耗。

另一种还原样本荧光寿命的算法是快速寿命估算(Rapid LifetimeDetermination,RLD)，其原理方法如图2所示，通过荧光衰减过程中两点荧光计数强度的比值，估算荧光寿命，寿命还原公式为：

其中t₂和t₁为荧光衰减过程中两个测量时间点，而N₁和N₂分别是t₁和t₂时间点处的计数码值。RLD算法的优势是算法简单，速度快，但缺点十分明显，精度不高，光子利用率十分低，选通门延时时间难以控制。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明结合传统RLD算法与CMM算法，旨在通过RLD的预估算和基于CMM迭代运算的细校正方法，拓展在相同激光频率条件下的荧光寿命估算范围，进而提高寿命估算准确度。本发明对RLD预估算方法进行了改进，避免了迭代运算。本发明采用的技术方案是，用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法，包括如下步骤：

待还原的衰减寿命为τ，时域时间相关单光子计数TCSPC系统采用的激光频率为F，周期为T，每个激光周期看作一个探测窗口，且每个激光周期内至多能够记录到一个光子，质心算法CMM算法每个数据提取的时间周期为T_T，T_T时间长度为p个激光周期T，把每个探测时间窗口分为m部分，即求解窗口数目为m，每个部分的光子计数数值分别为N₁，N₂……N_m，需要的判定对比的参数为实测得到的光子计数比值K_N和理论计算所得到的光子计数比值K₀，记录到的总光子数为N_C，量化得到的光子到达时间总和为N_T；定义阈值并进行判定，低于阈值时采用采用非线性一次迭代补偿寿命偏差，否则通过RLD方法估算出荧光寿命，再通过非线性补偿进行校正后得到最终荧光寿命。

定义阈值并进行判定具体步骤是，CMM寿命还原的误差不超过ε，非线性补偿还原的寿命误差与T/τ比值的关系是固定的，如表1所示，通过查表可以得到误差不超过ε对应的T/τ的范围；另一方面，T/τ与光子计数比值K₀的关系也是确定的，通过查表进一步可以确定ε与K₀的关系：

表1

其中N_T1，N_Tm是理论计算的光子计数值，K₀是理论得出的计数比值关系，而K_N是实测得到的光子计数比值，若K₀<K_N，则采用质心算法CMM，若K₀>K_N，则选择两级校正方法。

两级校正方法即首先通过RLD方法估算出荧光寿命，再把RLD估算出的寿命值通过非线性补偿进行校正后得到最终荧光寿命，具体步骤是，已得到光子计数比值K_N，则通过有理函数近似可以得到：

其中N₁，N_m分别是实测的光子计数值，τ_RLD是采用基于有理函数拟合近似表达式得到的寿命；

将τ_RLD带入到误差校正式中(2)

得到：其中t代表时间，T为激光周期，τ为待还原的荧光分子衰减寿命，τ_CMMT为两级校正后的最终估算寿命。

本发明的特点及有益效果是：

传统的非线性补偿方法的误差主要来源于迭代过程中使用的质心直接估算值，该直接估算值在长衰减寿命估算时是不准确的。本发明采用RLD方法得到精确度较高的估算值，再进行迭代计算，提高了寿命还原的精确度，拓展了荧光寿命的还原范围，解除了估算长寿命时对激光频率的限制。

附图说明：

图1：基于TCSPC的荧光寿命成像原理；

图2：RLD算法荧光寿命还原原理；

图3：本发明对质心算法估算寿命的补偿方法；

图4：采用本发明校正方法得到的荧光寿命还原误差曲线；

图5：本发明校正方法的寿命还原误差与求解窗口数目的关系曲线。

具体实施方式

本发明采用的技术方案是，基于RLD预估算的两步校正方法，校正方法在计算机或FPGA中进行处理执行，包括如下步骤：

待还原的衰减寿命为τ，时域TCSPC系统采用的激光频率为F(周期为T)，每个激光周期看作一个探测窗口，且每个激光周期内至多能够记录到一个光子，CMM算法每个数据提取的时间周期为T_T(T_T时间长度为p个激光周期T)，软件处理系统把每个探测时间窗口分为m部分(即求解窗口数目为m)，每个部分的光子计数数值分别为N₁，N₂，N_m，两步校正过程中需要的判定对比的参数为实测得到的光子计数比值K_N和理论计算所得到的光子计数比值K₀，记录到的总光子数为N_C，量化得到的光子到达时间总和为N_T。具体校正流程为：

具体校正流程如图3所示：

第一阶段，定义阈值并进行判定。与激光周期相比，较短的衰减寿命采用传统非线性校正方法的准确度较高；较长的衰减寿命则有误差较高的问题。因此需要经过判断过程选择不同校正模式。对于仍然能够满足精度要求的寿命范围，传统非线性校正方法简洁高效；但对于不能够满足精度要求的寿命范围，则要采用本发明所提供的校正方法。根据具体应用环境条件的要求，CMM寿命还原的误差不超过ε。非线性补偿还原的寿命误差与T/τ比值的关系是固定的，如表1所示。通过查表可以得到误差不超过ε对应的T/τ的范围。另一方面，T/τ与光子计数比值K₀的关系也是确定的，通过查表进一步可以确定ε与K₀的关系。

表1

其中N_T1，N_Tm是理论计算的光子计数值，K₀是理论得出的计数比值关系，而K_N是实测得到的光子计数比值。若K₀<K_N，则还原方式与传统方法一致，如式(3)，若K₀>K_N，则选择两级校正方法。

第二阶段，通过RLD方法估算出精确度较高的寿命。如上所述，已得到光子计数比值K_N，则通过有理函数近似可以得到：

其中τ_RLD是采用基于有理函数拟合近似表达式得到的寿命。通过有理函数近似估算RLD寿命目的是避免对数运算以节约硬件资源，增强硬件可执行性。

第三阶段，进行第二步校正。将τ_RLD带入到误差校正式中(2)得到：

其中τ_CMMT为两级校正后的估算寿命。

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。

传统对CMM的校正方法对T/τ有约束，当衰减寿命与激光周期相差较小时，寿命还原的误差较大。通过RLD的寿命预估算，能进一步提高直接由质心算法推演出的寿命的精确度，再把估算值带入修正公式(8)，得到的二级校正寿命，具有较高准确度。

带还原寿命τ范围为0.3ns-20ns，时域TCSPC系统采用的激光频率为40MHz(周期T为25ns)，每个激光周期看作一个探测窗口，且每个激光周期内至多能够记录到一个光子，CMM算法每个数据提取的时间周期为2.5ms(T_T时间长度为10^5个激光周期T)，软件处理系统把每个探测时间窗口分为1024个部分(m＝1024)，每个部分的光子计数数值分别为N₁，N₂，N_m，两级校正过程中需要的判定参数K_N，为记录到的总光子数为N_C，量化得到的光子到达时间总和为N_T。具体校正流程为：

第一阶段，定义阈值并进行判定。与激光周期相比，较短的衰减寿命采用传统非线性校正方法的准确度较高；较长的衰减寿命则有误差较高的问题。因此需要经过判断过程选择不同校正模式，在衰减寿命较短的情况，依然选择传统的校正方法，其简洁性能够降低功耗，节约硬件资源。根据具体应用环境条件的要求，CMM寿命还原的误差不超过ε。非线性补偿还原的寿命误差与T/τ比值的关系是固定的，通过查表可以得到误差不超过ε对应的T/τ的范围。另一方面，T/τ与光子计数比值K₀的关系也是确定的，通过查表进一步可以确定ε与K₀的关系。在生物分析领域应用中，采用寿命还原误差不超过1％的条件,此误差水平能够达到与传统迭代的最大可能性算法(Maximum-likelihood-estimation,MLE)相当的精度。则由表1可知，T/τ的范围为T/τ>4.5，对应光子计数比值的阈值为K₀＝90。K₀是理论得出计数比值关系，而K_N是在2¹³个光子收集数量条件下实测得到的计数比值。若K₀<K_N，则还原方式与传统方法一致，如式(3)，若K₀>K_N，则选择两级校正方法。

第二阶段，通过RLD方法估算出精确度较高的寿命。如上所述，已得到光子计数比值K_N，则通过有理函数近似可以得到：

其中N₁，N_m分别是实测的光子计数值，τ_RLD是采用基于有理函数拟合近似得到的寿命。

第三阶段，进行第二级校正。将τ_RLD带入到误差校正式中得到：

其中τ_CMMT为两级校正后的估算寿命。

待还原寿命范围为0.3ns-20ns，激光频率为40MHz，CMM数据收集时间(总曝光时间)为2.5ms。探测光子总数为2¹³个。在Mat lab环境中进行数值仿真，传统校正方法与本发明的两级校正方法的寿命还原误差如图4所示。仿真的数值分析过程，不但包含了质心估算的校正偏差，还包括了随机光子产生与探测的泊松噪声，因此仿真结果的精度比上述理论计算的精度稍低一些。ε<5％寿命还原范围为T/τ>1；ε<2％寿命还原范围为T/τ>2；寿命还原误差与求解窗口数目的关系如图5所示。当还原极短寿命时，寿命偏差主要取决于求解窗口数目m。

Claims (1)

1.一种用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法，其特征是，步骤如下：待还原的衰减寿命为τ，时域时间相关单光子计数TCSPC系统采用的激光频率为F，周期为T，每个激光周期看作一个探测窗口，且每个激光周期内至多能够记录到一个光子，质心算法CMM算法每个数据提取的时间周期为T_T，T_T时间长度为p个激光周期T，把每个探测时间窗口分为m部分，即求解窗口数目为m，每个部分的光子计数数值分别为N₁，N₂……N_m，需要的判定对比的参数为实测得到的光子计数比值K_N和理论计算所得到的光子计数比值K₀；定义光子计数比值阈值并进行判定，低于阈值时采用采用非线性一次迭代补偿寿命偏差，否则通过RLD方法估算出荧光寿命，再通过非线性补偿进行校正后得到最终荧光寿命；

定义阈值并进行判定具体步骤是，CMM寿命还原的误差不超过ε，非线性补偿还原的寿命误差与T/τ比值的关系是固定的，如表1所示，通过查表可以得到误差不超过ε对应的T/τ的范围；另一方面，T/τ与光子计数比值K₀的关系也是确定的，如下式：

其中N_T1，N_Tm是理论计算的光子计数值，K₀是理论得出的计数比值关系，而K_N是实测得到的光子计数比值，若K₀<K_N，则采用质心算法CMM，若K₀>K_N，则选择两级校正方法，两级校正方法即首先通过RLD方法估算出荧光寿命，再把RLD估算出的寿命值通过非线性补偿进行校正后得到最终荧光寿命；

两级校正方法具体步骤是，已得到光子计数比值K_N，则通过有理函数近似得到：

其中，τ_RLD是采用基于有理函数拟合近似表达式得到的寿命；

将τ_RLD带入到误差校正式中(2)

得到：

其中t代表时间，T为激光周期，τ为待还原的荧光分子衰减寿命，τ_CMMT为两级校正后的最终估算寿命。