CN106245134B - 一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，具体制备步骤为：1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQ GAGAAAAA‑‑且重复片段结构域为16mer、32mer、64mer或96mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含130‑170mM的NaCl；将纯化后所得溶液在空气中对流浓缩后，得到重组蜘蛛丝蛋白水溶液；2)将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片挤出，凝固、在空气中卷绕和在拉伸浴中拉伸2‑4倍后得到重组蜘蛛丝纤维。本发明制备的重组蜘蛛丝纤维力学性能优良，微纤结构紧密，纤维表面光滑，纤维的平均断裂强度为480‑680MPa，平均断裂伸长率为15‑25％，本发明可应用于仿生纺丝领域。
Description
技术领域
本发明属于仿生纺丝领域，涉及一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法。
背景技术
有着“生物钢”之称的天然蜘蛛丝是自然界最好的结构和功能材料之一，其高比强度(约为钢铁的5倍)、优异弹性(约为芳纶的10倍)、坚韧性(断裂能180MJ/m3)和断裂伸长率(约为钢的30倍)是其它天然纤维与合成纤维所无法比拟的。蜘蛛可以根据不同的用途纺出七种性能各异的纤维，其中牵引丝由于其优异的力学性能受到广泛关注，牵引丝蛋白由MaSp1和MaSp2组成，其中MaSp1是蜘蛛牵引丝刚性性能的主要来源，而MaSp2则对蜘蛛丝的弹性有很大贡献。
由于蜘蛛有同类相食的天性且蜘蛛丝种类繁多，因此不能通过饲养获得大量单一蜘蛛丝，目前通过基因工程技术，获得重组蜘蛛丝蛋白已被应用于探究蜘蛛丝的形成机理并进而指导人造蜘蛛丝的研究。所述重组蜘蛛丝蛋白是利用测定部分蜘蛛丝蛋白基因(cDNA)所获得的基因序列，应用基因工程技术得到的蛋白液。
与合成人造纤维不同，天然蜘蛛丝是在常温常压、以水为溶剂等温和的条件下形成的。蜘蛛的纺丝系统是一个集离子调控、蛋白浓缩、剪切拉伸、纺丝于一体的集成过程，蜘蛛的纺丝通道形状参数符合二阶衰减指数模型。微流体技术可以利用微流体的层流及扩散特性，从通道尺寸、pH值、离子浓度及拉伸剪切等方面高度模拟生物体内的纺丝过程，以动态调控纺丝液的组成和结构。
然而大部分重组蜘蛛丝的纺丝过程都会利用有机溶剂，如尿素、LiBr、六氟异丙醇(HFIP)、甲酸、盐酸胍等，一部分用于重组蜘蛛丝蛋白的溶解，一部分用作凝固浴。通过这种方式得到的蜘蛛丝纤维有两个劣势：(1)纤维中残留的具有毒性的有机溶剂限制了蜘蛛丝蛋白在医学材料方面的应用(2)纺丝方法均采用湿法纺丝方法，纤维的力学性能与天然蜘蛛丝的力学性能相比仍有较大差距(3)有些有机溶剂价格昂贵，限制了其进一步的大规模制备。
Hagn等(Nature,2010,465(13),239-242.)发现在蜘蛛体内没有剪切力作用时，蛋白聚集程度由盐浓度决定，离液序列高的NaCl有利于蛋白存储，即使NaCl浓度高达500mM时蛋白聚集低于15％，且NaCl的存在使得蛋白存储过程更稳定。
专利US2012/0231499A1将获得的Rep16、Rep32、Rep64、Rep96重组蜘蛛丝蛋白冷冻干燥后溶解在HFIP中，得到浓度为20％(w/v)的蛋白溶液，利用湿法纺丝技术，以1-2mL/h的速度通过注射器挤到体积百分数为90％的乙醇凝固浴中，初生纤维在凝固浴浸泡20min后剪为50mm的小段手动拉伸5倍，获得的32mer纤维断裂强度202±25MPa，断裂伸长率为3.27±0.32％，杨氏模量为8.28±0.85GPa；64mer纤维断裂强度为252±26MPa，断裂伸长率为4.31±0.64％，杨氏模量为10.14±0.67GPa；96mer纤维断裂强度为508±108MPa，断裂伸长率15±5％，杨氏模量21±4GPa。但该蛋白不含羧基端结构域(CTD)和氨基端结构域(NTD)，且有机溶剂的使用限制了应用。
Aniela等(Adv.Mater.,2015,27(13),2189-2194.)设计的蛋白N端来自黑寡妇蜘蛛的MaSp1，重复段与C端来自十字园蛛的ADF3，冷冻干燥后溶解在异丙醇中，利用湿法纺丝技术，将浓度为10％-17％(w/v)的蛋白液，以5μL/min的速度从喷丝头挤出到体积百分数为90％的乙醇凝固浴中，并以5mm/sec的速度手动拉伸6倍，获得的N1L(AQ)12NR3纤维韧性189MJ/m3略超过天然蜘蛛丝但强度较低。
Lin等(Adv.Mater.,2013,25,1216-1220.)将包卵丝蛋白的10个RP1Tu和1个RP2Tu，末端连接上小囊状腺丝MiSp1的C端CTDMi组成重组蜘蛛丝蛋白11RPC，冷冻干燥后的蛋白溶解于HFIP，利用湿法纺丝技术，将浓度为10mg/mL的蛋白液，以0.2mL/h的速度从喷丝头挤出到ZnCl2(100mM)和FeCl3(1mM)混合凝固浴中，体积百分数为50-70％乙醇水溶液共拉伸5倍，得到的纤维断裂强度308±57MPa，高出天然包卵丝30％，杨氏模量9.3±3GPa，高出天然包卵丝>50％。
Asakura等(Biomacromolecules,2007,8,175-181.)发现桑蚕腺体管道腔体的半径变化趋势大致符合二阶衰减指数模型，此模型公式为：Y＝A(1/(1+exp(BX)))+C(1/(1+exp(DX)))，其中A＝238，B＝6.18E-05，C＝588，D＝0.003，R2＝0.988。
Breslauer等(Biomacromolecules,2009,10,49-57.)根据Nephila clavipes蜘蛛腺体导管和桑蚕腺体的尺寸变化和流体在管壁内的流量变化，拟合出蜘蛛腺体半径(r,μm)对轴向位置函数(z,μm)的二阶指数函数：r(z)＝aebz+cedz，对于蜘蛛，a＝-0.004886μm，b＝0.0003718μm-1，c＝53.52μm，d＝-9.989*10-5μm-1(R2＝0.9735)，并作出了蜘蛛腺体流动参数和应变张量量级图示，表明蜘蛛腺体通道由107μm减小至10μm过程中，量级减小缓慢。
Knight等(Proceedings of the Royal Society B,1999,266,519-523.)研究表明蜘蛛腺体通道和蚕一样以二阶指数迅速衰减。
专利CN102162140A设计的微流体芯片，通道两侧面与水平面相交的迹线为指数函数曲线、双曲线函数曲线或直线中的一种以上。其中二阶指数函数公式与Breslauer等一致；双曲线公式为：R(x)＝1/2(ex-e-x)；一阶指数函数公式为：R(x)＝ea*ln(x)，其中a＝0.0125。
专利W02007/141131(A1)和US2010029553(Al)利用层流扩散原理，设计了一种微流体芯片，实现了对再生丝素蛋白溶液的组成和金属离子浓度的调节，用于制备不同形态的蛋白制品。
专利ZL201110007232.6设计了具有剪切拉伸功能的微流体芯片，与干纺结合，应用在再生丝素蛋白溶液体系，实现了对纺丝液的剪切拉伸。
专利CN102995145A和CN102995145B设计的微流体芯片，模拟了生物纺丝过程中的复杂流场，实现了对纺丝液的剪切拉伸、组分调节和浓缩等，与干法纺丝工艺相结合，制得性能优良的再生丝素纤维，但与生物纺丝过程的多种作用相比，功能单一、仿生程度低。
Rammensee等(PNAS,2008,6,6590-6595.)利用微流体技术将不同宽度的矩形通道组合在一起，研究了两种十字圆蛛蛋白eADF3、eADF4在微流体通道中的聚集机理，研究发现磷酸根和pH值以及剪切作用是重组蜘蛛丝蛋白的聚集形成纤维的必要条件，eADF3原纤只在拉伸流动时产生，eADF4只伴随eADF3产生本身没有自组装只有球状固体蛋白聚集。
专利CN102134757A设计的微流体芯片模拟了蜘蛛和蚕纺丝过程中腺体内的复杂流场，实现了对纺丝液的剪切拉伸、组分调节和浓缩等，制得性能优良的再生丝素纤维。
综上所述，目前还没有将微流体芯片技术与湿-干法纺丝结合起来用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝专利发明和文献报道，同时目前制备的重组蜘蛛丝纤维力学性能有待于进一步地提高，因此，将微流体芯片技术与湿-干法纺丝结合可作为新的突破点制备力学性能优良的重组蜘蛛丝纤维。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的上述不足提出一种重组蜘蛛丝蛋白水溶液的微流体纺丝方法，制备综合性能良好的重组蜘蛛丝纤维。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括：
一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，制备步骤如下：
1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQGAGAAAAA--且重复片段结构域为16mer、32mer、64mer或96mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中先用100mL缓冲液A(含2.6-3.4mL 5M NaCl、200μL 2.5M咪唑、2mL 1M Tris-HCl，pH＝8.0)和100mL缓冲液B(含2.6-3.4mL 5M NaCl、2.4mL 2.5M咪唑、2mL 1M Tris-HCl，pH＝8.0)洗去杂质，再用100mL缓冲液C(含2.6-3.4mL 5M NaCl、10mL 2.5M咪唑、2mL 1M Tris-HCl，pH＝8.0)收集目标蛋白，得到NaCl浓度为130-170mM、重组蜘蛛丝蛋白浓度为1.5-3wt％的重组蜘蛛丝蛋白水溶液；在空气中对流浓缩后得到重组蜘蛛丝蛋白浓度为18-25wt％、NaCl与溶液中水的质量比36:100的重组蜘蛛丝蛋白水溶液；NaCl的加入使得蛋白溶解度提高，即使浓缩后期蛋白浓度过高也不会聚集沉淀，成为可纺的蛋白水溶液，避免了大部分文献中蛋白冷冻干燥后溶解于有机溶剂，纯化后在空气中对流浓缩后得到重组蜘蛛丝蛋白水溶液；
2)将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片以3-5μL/min的速度挤出，在凝固浴中固化成丝，并在空气中卷绕上辊，在拉伸浴中以0.5-1.5mm/s的拉伸速度拉伸2-4倍后得到重组蜘蛛丝纤维；
所述微流体芯片的微通道的两侧面与水平面相交的迹线为指数函数、双曲线函数或直线中的一种以上；
所述重组蜘蛛丝纤维的力学性能优良，纤维的平均断裂强度为480-680MPa，平均断裂伸长率为15-25％。
作为优选的技术方案：
如上所述的纺丝方法，所述重组蜘蛛丝蛋白设计过程中还可通过增加重复片段结构域的重复次数提高分子量，如重复片段结构域重复次数为16时，重组蜘蛛丝蛋白分子量Mw为约48kDa，重复片段结构域重复次数为32时，重组蜘蛛丝蛋白分子量Mw为100.7kDa，重复片段结构域重复次数为64时，重组蜘蛛丝蛋白分子量Mw为192.8kDa，重复片段结构域重复次数为80时，重组蜘蛛丝蛋白分子量Mw为238.8kDa，重复片段结构域重复次数为96时，重组蜘蛛丝蛋白分子量Mw为284.9kDa；
所述重组蜘蛛丝蛋白设计过程中还可通过增加CTD促进重组蜘蛛丝蛋白的溶解，储存高浓度的蛋白溶液，CTD中半胱氨酸形成二硫键形成二聚使蛋白分子量增加到两倍，CTD的两亲结构对纤维形成重要，可影响聚集行为，控制蛋白聚合形成有序纤维而不是无定型状态；
所述重组蜘蛛丝蛋白设计过程中还可通过增加NTD控制重组蜘蛛丝蛋白的自组装行为，NTD对pH值有高度的响应，当pH值大于7时，NTD主要以单体的形式存在，而NTD当pH值下降到5左右时，NTD可形成反向平行的二聚体，主要以单体的形式存在，可以抑制蛋白存储过程因蛋白浓度过高而过早聚集，蜘蛛喷丝管内pH值低的时候NTD加速自组装，如pH值小于6.4加速自组装，pH大于7延迟聚集；
所述重组蜘蛛丝蛋白设计过程中还可通过将两种牵引丝蛋白刚性的MaSp1和弹性的MaSp2氨基酸序列以不同的比例连接形成嵌段结构，并优化对应的核苷酸序列，得到具有不同力学性能的纤维，MaSp1是蜘蛛牵引丝刚性性能的主要来源，而MaSp2则对蜘蛛丝的弹性有很大贡献，如络新妇蛛(Nephila clavipes)中含有81％MaSp1和19％MaSp2，而十字园蛛(A.diadematus)中两种牵引丝蛋白均为MaSp2；
所述重组蜘蛛丝蛋白设计过程中还可通过将刚性的牵引丝蛋白MaSp1和弹性蛋白(Elastin)氨基酸序列以不同的比例连接形成嵌段结构，并优化对应的核苷酸序列，得到具有不同力学性能的纤维，所得的纤维包含了丝素和弹性体的优异的物理和生物特性，作为功能材料可以用于不同领域如生物材料、生物传感器、纳米装置、生物分离、组织工程、药物传送等；
所述重组蜘蛛丝蛋白设计过程中还可通过将弹性的牵引丝蛋白MaSp2和弹性蛋白(Elastin)氨基酸序列以不同的比例连接形成嵌段结构，并优化对应的核苷酸序列，得到具有不同力学性能的纤维，以用于不同领域；
所述重组蜘蛛丝蛋白设计过程中还可通过将两种牵引丝蛋白刚性的MaSp1和弹性的MaSp2以及弹性蛋白(Elastin)氨基酸序列以不同的比例连接形成嵌段结构，并优化对应的核苷酸序列，得到具有不同力学性能的纤维，以用于不同领域。
如上所述的纺丝方法，所述纯化后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液中重组蜘蛛丝蛋白的浓度为1.5-3wt％，NaCl的浓度为130-170mM。
如上所述的纺丝方法，所述浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液中重组蜘蛛丝蛋白的浓度为18-25wt％，NaCl与溶液中水的质量比为36:100。
如上所述的纺丝方法，所述微流体芯片的制造过程为：将SU-8光刻胶涂层在印有微通道图案的掩膜下进行紫外曝光，显影后浇铸PDMS预聚物及固化剂，固化后得到PDMS膜片，将PDMS膜片与载玻片直接键合后即得到微流体芯片。
如上所述的纺丝方法，所述PDMS膜片印有微通道图案，所述PDMS膜片与载玻片直接键合前需经等离子体处理，所述载玻片的尺寸为75*25mm。
如上所述的纺丝方法，所述挤出的条件为温度10-30℃，相对湿度30％-50％；所述凝固浴组分为无水乙醇，所述凝固浴长度为1-2m。
如上所述的纺丝方法，所述在空气中卷绕上辊前经过10-20cm的空气段；所述拉伸浴为体积百分数为70％-90％的乙醇水溶液。
如上所述的纺丝方法，所述重组蜘蛛丝纤维的直径为10-14μm，微纤结构紧密，纤维表面光滑。
研究表明，进行湿法纺丝时，微纤中的水迅速扩散到乙醇中，而微纤中的氯化钠不溶于乙醇，在乙醇中析出聚集在微纤表面，阻碍微纤分子间作用力，因此形成的纤维结构不紧密，表面粗糙。空气中卷绕时，空气中的水迅速进入微纤，由于蜘蛛丝对水很敏感，微纤变为弹性体开始伸展，使得氯化钠聚集在一起，微纤间相互作用力增大，纤维由无定型态转变为β-折叠结构，形成表面光滑结构紧密的纤维，微纤间的紧密排列使得大分子间作用力提高,β-折叠结构增多使得结晶度增大、取向提高，因而提高了纤维的力学性能。
有益效果：
1)本发明方法操作简单，模拟蜘蛛的天然纺丝器，设计了含有微流体通道的仿生纺丝芯片，并采用湿法-干法结合的特殊纺丝工艺，室温下实现了重组蜘蛛丝蛋白水溶液的微流体纺丝，制得的纤维表面光滑，微纤结构紧密。
2)本发明制备的重组蜘蛛丝纤维具有优良的力学性能，构成纤维的重复片段结构域为16mer时纤维的断裂强度为480±30MPa，已与文献中重复片段结构域为96mer时力学性能(纤维断裂强度508±108MPa)接近，远远超过同分子量纤维的力学性能；重复片段结构域为96mer时纤维的断裂强度为680±63MPa，断裂伸长率为25±8％，已超过文献专利中记载的重组蜘蛛丝蛋白纤维的力学性能。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，制备步骤如下：
1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQGAGAAAA A--且重复片段结构域为16mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含130mM的NaCl，得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为1.5wt％，NaCl的浓度为130mM的重组蜘蛛丝蛋白水溶液，在空气中对流浓缩后得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为18wt％，NaCl与溶液中水的质量比为36:100的重组蜘蛛丝蛋白水溶液；
2)将SU-8光刻胶涂层在印有微通道图案的掩膜下进行紫外曝光，显影后浇铸印有微通道图案的PDMS预聚物及固化剂，固化后得到PDMS膜片，将经等离子体处理的PDMS膜片与尺寸为75*25mm的载玻片直接键合后即得到微流体芯片，微流体芯片的微通道的两侧面与水平面相交的迹线为指数函数；
3)在温度为10℃，相对湿度为30％的条件下，将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片以3μL/min的速度挤出，在长度为1m的无水乙醇凝固浴中固化成丝，经过10cm的空气段后在空气中卷绕上辊，在体积百分数为70％的乙醇水溶液中以0.5mm/s的拉伸速度拉伸3倍后得到重组蜘蛛丝纤维。
测试表明，制备的重组蜘蛛丝纤维的直径为10μm，微纤结构紧密，纤维表面光滑，力学性能优良，纤维的断裂强度为480±30MPa，断裂伸长率为23±8％。
实施例2
一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，制备步骤如下：
1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQGAGAAAA A--且重复片段结构域为16mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含150mM的NaCl，得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为1.5wt％，NaCl的浓度为150mM的重组蜘蛛丝蛋白水溶液，在空气中对流浓缩后得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为19wt％，NaCl与溶液中水的质量比为36:100的重组蜘蛛丝蛋白水溶液；
2)将SU-8光刻胶涂层在印有微通道图案的掩膜下进行紫外曝光，显影后浇铸印有微通道图案的PDMS预聚物及固化剂，固化后得到PDMS膜片，将经等离子体处理的PDMS膜片与尺寸为75*25mm的载玻片直接键合后即得到微流体芯片，微流体芯片的微通道的两侧面与水平面相交的迹线为双曲线函数；
3)在温度为12℃，相对湿度为32％的条件下，将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片以4μL/min的速度挤出，在长度为2m的无水乙醇凝固浴中固化成丝，经过12cm的空气段后在空气中卷绕上辊，在体积百分数为72％的乙醇水溶液中以0.6mm/s的拉伸速度拉伸2倍后得到重组蜘蛛丝纤维。
测试表明，制备的重组蜘蛛丝纤维的直径为10μm，微纤结构紧密，纤维表面光滑，力学性能优良，纤维的断裂强度为500±42MPa，断裂伸长率为20±7％。
实施例3
一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，制备步骤如下：
1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQGAGAAAA A--且重复片段结构域为32mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含170mM的NaCl，得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为1.8wt％，NaCl的浓度为170mM的重组蜘蛛丝蛋白水溶液，在空气中对流浓缩后得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为20wt％，NaCl与溶液中水的质量比为36:100的重组蜘蛛丝蛋白水溶液；
2)将SU-8光刻胶涂层在印有微通道图案的掩膜下进行紫外曝光，显影后浇铸印有微通道图案的PDMS预聚物及固化剂，固化后得到PDMS膜片，将经等离子体处理的PDMS膜片与尺寸为75*25mm的载玻片直接键合后即得到微流体芯片，微流体芯片的微通道的两侧面与水平面相交的迹线为直线；
3)在温度为15℃，相对湿度为35％的条件下，将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片以5μL/min的速度挤出，在长度为1m的无水乙醇凝固浴中固化成丝，经过15cm的空气段后在空气中卷绕上辊，在体积百分数为75％的乙醇水溶液中以0.8mm/s的拉伸速度拉伸3倍后得到重组蜘蛛丝纤维。
测试表明，制备的重组蜘蛛丝纤维的直径为11μm，微纤结构紧密，纤维表面光滑，力学性能优良，纤维的断裂强度为540±52MPa，断裂伸长率为18±9％。
实施例4
一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，制备步骤如下：
1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQGAGAAAA A--且重复片段结构域为32mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含150mM的NaCl，得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为1.8wt％，NaCl的浓度为150mM的重组蜘蛛丝蛋白水溶液，在空气中对流浓缩后得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为21wt％，NaCl与溶液中水的质量比为36:100的重组蜘蛛丝蛋白水溶液；
2)将SU-8光刻胶涂层在印有微通道图案的掩膜下进行紫外曝光，显影后浇铸印有微通道图案的PDMS预聚物及固化剂，固化后得到PDMS膜片，将经等离子体处理的PDMS膜片与尺寸为75*25mm的载玻片直接键合后即得到微流体芯片，微流体芯片的微通道的两侧面与水平面相交的迹线为指数函数和双曲线函数；
3)在温度为18℃，相对湿度为40％的条件下，将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片以3μL/min的速度挤出，在长度为2m的无水乙醇凝固浴中固化成丝，经过16cm的空气段后在空气中卷绕上辊，在体积百分数为80％的乙醇水溶液中以0.9mm/s的拉伸速度拉伸4倍后得到重组蜘蛛丝纤维。
测试表明，制备的重组蜘蛛丝纤维的直径为11μm，微纤结构紧密，纤维表面光滑，力学性能优良，纤维的断裂强度为570±38MPa，断裂伸长率为19±6％。
实施例5
一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，制备步骤如下：
1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQGAGAAAA A--且重复片段结构域为64mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含150mM的NaCl，得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为2.5wt％，NaCl的浓度为150mM的重组蜘蛛丝蛋白水溶液，在空气中对流浓缩后得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为22wt％，NaCl与溶液中水的质量比为36:100的重组蜘蛛丝蛋白水溶液；
2)将SU-8光刻胶涂层在印有微通道图案的掩膜下进行紫外曝光，显影后浇铸印有微通道图案的PDMS预聚物及固化剂，固化后得到PDMS膜片，将经等离子体处理的PDMS膜片与尺寸为75*25mm的载玻片直接键合后即得到微流体芯片，微流体芯片的微通道的两侧面与水平面相交的迹线为指数函数和直线；
3)在温度为20℃，相对湿度为42％的条件下，将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片以4μL/min的速度挤出，在长度为1m的无水乙醇凝固浴中固化成丝，经过18cm的空气段后在空气中卷绕上辊，在体积百分数为83％的乙醇水溶液中以1mm/s的拉伸速度拉伸2倍后得到重组蜘蛛丝纤维。
测试表明，制备的重组蜘蛛丝纤维的直径为12μm，微纤结构紧密，纤维表面光滑，力学性能优良，纤维的断裂强度为610±47MPa，断裂伸长率为15±5％。
实施例6
一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，制备步骤如下：
1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQGAGAAAA A--且重复片段结构域为64mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含150mM的NaCl，得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为2.5wt％，NaCl的浓度为150mM的重组蜘蛛丝蛋白水溶液，在空气中对流浓缩后得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为23wt％，NaCl与溶液中水的质量比为36:100的重组蜘蛛丝蛋白水溶液；
2)将SU-8光刻胶涂层在印有微通道图案的掩膜下进行紫外曝光，显影后浇铸印有微通道图案的PDMS预聚物及固化剂，固化后得到PDMS膜片，将经等离子体处理的PDMS膜片与尺寸为75*25mm的载玻片直接键合后即得到微流体芯片，微流体芯片的微通道的两侧面与水平面相交的迹线为双曲线函数和直线；
3)在温度为23℃，相对湿度为45％的条件下，将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片以5μL/min的速度挤出，在长度为2m的无水乙醇凝固浴中固化成丝，经过20cm的空气段后在空气中卷绕上辊，在体积百分数为86％的乙醇水溶液中以1.1mm/s的拉伸速度拉伸3倍后得到重组蜘蛛丝纤维。
测试表明，制备的重组蜘蛛丝纤维的直径为12μm，微纤结构紧密，纤维表面光滑，力学性能优良，纤维的断裂强度为630±48MPa，断裂伸长率为17±7％。
实施例7
一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，制备步骤如下：
1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQGAGAAAA A--且重复片段结构域为96mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含150mM的NaCl，得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为3wt％，NaCl的浓度为150mM的重组蜘蛛丝蛋白水溶液，在空气中对流浓缩后得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为24wt％，NaCl与溶液中水的质量比为36:100的重组蜘蛛丝蛋白水溶液；
2)将SU-8光刻胶涂层在印有微通道图案的掩膜下进行紫外曝光，显影后浇铸印有微通道图案的PDMS预聚物及固化剂，固化后得到PDMS膜片，将经等离子体处理的PDMS膜片与尺寸为75*25mm的载玻片直接键合后即得到微流体芯片，微流体芯片的微通道的两侧面与水平面相交的迹线为指数函数、双曲线函数和直线；
3)在温度为25℃，相对湿度为48％的条件下，将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片以3μL/min的速度挤出，在长度为1m的无水乙醇凝固浴中固化成丝，经过15cm的空气段后在空气中卷绕上辊，在体积百分数为88％的乙醇水溶液中以1.2mm/s的拉伸速度拉伸4倍后得到重组蜘蛛丝纤维。
测试表明，制备的重组蜘蛛丝纤维的直径为13μm，微纤结构紧密，纤维表面光滑，力学性能优良，纤维的断裂强度为650±50MPa，断裂伸长率为24±10％。
实施例8
一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，制备步骤如下：
1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQGAGAAAA A--且重复片段结构域为96mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含150mM的NaCl，得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为3wt％，NaCl的浓度为150mM的重组蜘蛛丝蛋白水溶液，在空气中对流浓缩后得到重组蜘蛛丝蛋白的浓度为25wt％，NaCl与溶液中水的质量比为36:100的重组蜘蛛丝蛋白水溶液；
2)将SU-8光刻胶涂层在印有微通道图案的掩膜下进行紫外曝光，显影后浇铸印有微通道图案的PDMS预聚物及固化剂，固化后得到PDMS膜片，将经等离子体处理的PDMS膜片与尺寸为75*25mm的载玻片直接键合后即得到微流体芯片，微流体芯片的微通道的两侧面与水平面相交的迹线为直线；
3)在温度为30℃，相对湿度为50％的条件下，将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片以5μL/min的速度挤出，在长度为2m的无水乙醇凝固浴中固化成丝，经过20cm的空气段后在空气中卷绕上辊，在体积百分数为90％的乙醇水溶液中以1.5mm/s的拉伸速度拉伸3倍后得到重组蜘蛛丝纤维。
测试表明，制备的重组蜘蛛丝纤维的直径为14μm，微纤结构紧密，纤维表面光滑，力学性能优良，纤维的断裂强度为680±63MPa，断裂伸长率为25±8％。
Claims (8)
1.一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，其特征是，制备步骤如下：
1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQGAGAAAAA--且重复片段结构域为16mer、32mer、64mer或96mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含130-170mM的NaCl；将纯化后所得溶液在空气中对流浓缩后，得到重组蜘蛛丝蛋白水溶液；
2)将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片以3-5μL/min的速度挤出，在凝固浴中固化成丝，并在空气中卷绕上辊，在拉伸浴中以0.5-1.5mm/s的拉伸速度拉伸2-4倍后得到重组蜘蛛丝纤维；
所述微流体芯片的微通道的两侧面与水平面相交的迹线为指数函数、双曲线函数或直线中的一种以上；
所述重组蜘蛛丝纤维的力学性能优良，纤维的平均断裂强度为480-680MPa，平均断裂伸长率为15-25％。
2.根据权利要求1所述的纺丝方法，其特征在于，纯化后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液中重组蜘蛛丝蛋白的浓度为1.5-3wt％，NaCl的浓度为130-170mM。
3.根据权利要求1所述的纺丝方法，其特征在于，所述浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液中重组蜘蛛丝蛋白的浓度为18-25wt％，NaCl与溶液中水的质量比为36:100。
4.根据权利要求1所述的纺丝方法，其特征在于，所述微流体芯片的制造过程为：将SU-8光刻胶涂层在印有微通道图案的掩膜下进行紫外曝光，显影后浇铸PDMS预聚物及固化剂，固化后得到PDMS膜片，将PDMS膜片与载玻片直接键合后即得到微流体芯片。
5.根据权利要求4所述的纺丝方法，其特征在于，所述PDMS膜片印有微通道图案，所述PDMS膜片与载玻片直接键合前需经等离子体处理，所述载玻片的尺寸为75*25mm。
6.根据权利要求1所述的纺丝方法，其特征在于，所述挤出的条件为温度10-30℃，相对湿度30％-50％；所述凝固浴组分为无水乙醇，所述凝固浴长度为1-2m。
7.根据权利要求1所述的纺丝方法，其特征在于，所述在空气中卷绕上辊前经过10-20cm的空气段；所述拉伸浴为体积百分数为70％-90％的乙醇水溶液。
8.根据权利要求1所述的纺丝方法，其特征在于，所述重组蜘蛛丝纤维的直径为10-14μm，微纤结构紧密，纤维表面光滑。
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| CN102995145A (zh) * | 2012-10-19 | 2013-03-27 | 东华大学 | 一种集成微流体纺丝芯片及其制备再生丝素蛋白纤维的方法 |
| CN104695052A (zh) * | 2013-12-04 | 2015-06-10 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种制备具球形空腔聚合物纤维的方法及专用微流控芯片 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Secondary Structure Transition and Critical Stress for a Model of Spider Silk Assembly";Tristan Giesa 等;《Biomacromolecules》;20151215;第17卷(第2期);第427-436页 * |
| "Tough silk fibers prepared in air using a biomimetic microfluidic chip";Jie Luo 等;《International Journal of Biological Macromolecules》;20140305;第66卷;第319-324页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106245134A (zh) | 2016-12-21 |
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |