CN106232128A - 用于减少反刍动物中的总气体产量和/或甲烷产量的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及包含红色海洋大型藻类物种的动物饲料和饲料补充剂。本申请还涉及通过施用红色海洋大型藻类物种或通过施用包含红色海洋大型藻类的饲料或饲料补充剂减少反刍动物中的总气体产量和/或甲烷产量的方法。

Description

用于减少反刍动物中的总气体产量和/或甲烷产量的方法

发明领域

本发明涉及减少反刍动物中总气体产量和/或甲烷产量的方法。

发明背景

甲烷(CH₄)是一种温室气体(GHG)，其主要由自然生态系统中(例如，沼泽、海洋和湖泊)和无脊椎动物和脊椎动物(如白蚁和反刍动物)胃肠道中存在的产甲烷微生物产生。每年通过与羟基(OH)自由基的反应从大气中去除～429-507Tg的CH₄并且从平流层中去除～40Tg；并且通过土壤中的CH₄-氧化性细菌去除～30Tg。

然而，人类活动产生的GHG排放已经日益快速增加，与19世纪早期相比，现在大气中CH₄的浓度要超过两倍更高。甲烷在吸收太阳红外辐射方面非常有效，具有比CO₂高25倍的全球变暖潜能。因此，其在大气中的积累大大促进了气候变化。人类活动产生的甲烷的一个主要来源可以归因于农业活动，包括反刍动物畜牧。

按照最近的UN报告，家畜饲养比交通产生更多的全球变暖温室气体，如以CO₂当量测量的。在澳大利亚，估计反刍动物贡献GHG排放总量的～10％。反刍动物产生的CH₄作为饲料在瘤胃的厌氧微生物发酵的副产品，并且，在较小的程度上，作为饲料在大肠中的厌氧微生物发酵的副产品。瘤胃微生物群落是高度多样化的，由细菌、原生动物、真菌和噬菌体构成，它们共同作用来发酵摄入的有机物(OM)，产生CO₂、H₂、挥发性脂肪酸(VFA)和甲酸盐。存在于瘤胃中的产甲烷古细菌利用这些终产物并且产生CH₄。虽然CH₄的产生降低H₂分压，这可能另外抑制瘤胃发酵，但是其也降低了用于形成用于反刍动物营养的必需VFA的能量和碳量。在反刍动物中产生的大部分CH₄被动物呼出或嗝出，并且表示多至总能量摄入的12％的损失。

减少肠内CH₄形成的缓解策略是重要的，并且减少反刍动物中总气体产量和/或甲烷产量的方法代表一种重大的挑战。

发明概述

在一个方面，本发明提供一种用于减少反刍动物中总气体产量和/或甲烷产量的方法，所述方法包括向所述反刍动物施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种的步骤。

在一个实施方案中，所述红色海洋大型藻类物种是海门冬属(Asparagopsis)物种。在另一个实施方案中，所述海门冬属物种是紫杉状海门冬(A.taxiformis)。

在一个实施方案中，通过用所述有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种补充旨在用于所述反刍动物的食物，而将所述有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种施用给所述动物。

在另一个方面，本发明提供了一种用于减少反刍动物中总气体产量和/或甲烷产量的方法，所述方法包括向所述反刍动物施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种的步骤，其中保持有效水平的需要的挥发性脂肪酸。

在一个实施方案中，乙酸盐与丙酸盐之比下降。

在另一个实施方案中，保持降解的有机物和/或干物质的水平。

在另一个实施方案中，所述至少一种红色海洋大型藻类物种以施用给所述反刍动物的有机物的至少3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％的剂量施用。

在另一个方面，相对于脱壳棉籽在体外进行瘤胃发酵时产生的总气体的量，体外瘤胃发酵产生的总气体的量减少了至少61％。

在另一个方面，相对于由被施用了脱壳棉籽的反刍动物产生的甲烷的量，反刍动物中甲烷的产量减少至少10％。

在另一个方面，相对于由被施用了脱壳棉籽的反刍动物产生的甲烷的量，反刍动物中甲烷的产量减少至少15％。

在另一个方面，相对于脱壳棉籽在体外进行瘤胃发酵时产生的甲烷量，体外瘤胃发酵产生的甲烷的量减少至少98.8％。

在另一个方面，相对于由被施用了羽扇豆饮食的反刍动物产生的甲烷的量，反刍动物中甲烷的产量减少至少83％。

在一个实施方案中，所述反刍动物选自反刍亚目(Ruminantia)和胼足亚目(Tylopoda)的成员。在另一个实施方案中，所述反刍动物是牛或绵羊。在另一个实施方案中，所述反刍动物是牛。

在另一个实施方案中，方法还包括向所述反刍动物施用有效量的至少一种选自由下述组成的组的大型藻类物种：刺海门冬(Asparagopsis armata)、紫杉状海门冬(Asparagopsis taxiformis)、网地藻属(Dictyota)物种(例如，Dictyota bartayresii)、鞘藻属(Oedogonium)物种、石莼(Ulva)物种和扩展刚毛藻(C.patentiramea)。

在另一个方面，本发明还提供用于减少反刍动物中总气体产量和/或甲烷产量的饲料补充剂，其包含有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种。在一个实施方案中，所述红色海洋大型藻类物种是海门冬属物种。在另一个实施方案中，所述海门冬属物种是紫杉状海门冬。

在另一个实施方案中，所述补充剂还包含有效量的至少一种选自由下述组成的组的大型藻类物种：刺海门冬、紫杉状海门冬、网地藻属物种(例如，Dictyota bartayresii)、鞘藻属物种、石莼物种和扩展刚毛藻。

在另一个方面，本发明还提供一种用于反刍动物的饲料，其中所述饲料补充有本文所述的饲料补充剂。

在另一个方面，本发明提供一种减少反刍动物的甲烷产量的方法，所述方法包括向所述动物施用本文所述的饲料补充剂或本文所述的饲料的步骤。

附图简述

图1显示在大型藻类物种存在下在72小时的温育期间内体外厌氧发酵的总气体产量(TGP)(ml.g^-1OM)。误差条表示±SE(n＝4)。物种的全称在表1中给出。该图表明网地藻属和海门冬属物种减少厌氧发酵的总气体产量。

图2显示在大型藻类物种存在下在24、48和72小时体外厌氧发酵的甲烷(CH₄)产量(ml.g^-1OM)。误差条表示±SE(n＝3-4)。物种的全称在表1中给出。该图表明网地藻属和海门冬属物种减少厌氧发酵的甲烷气量。

图3显示多维尺度分析(MDS)以基于生化和发酵后参数说明大型藻类物种之间的相似性。(A)在分类空间(ordination space)内的物种分布的MDS图(Stress＝0.11)。灰色簇集内的物种具有最高的TGP和CH₄产量，而虚线灰色簇集内的物种具有最低的TGP和CH₄产量。(B)显示具有叠加的大于0.7的Pearson相关系数(r)的MDS向量。(C)显示叠加的发酵后参数向量(注意所有的相关系数低于0.7，见表2)。白色和蓝色三角形：淡水绿藻，绿色三角形：海洋绿藻，棕色圆形：褐藻，红色菱形：红藻；和方形：DCS。物种的全称在表1中给出。该图表明减少厌氧发酵的甲烷和/或TGP产量的物种(例如，网地藻属、海门冬属物种)散布在MDS双标图(bi-plot)上，并且这些变量与影响物种在MDS内的散布的任何主要生化变量不十分相关。

图4显示多变量分类和回归树模型。该CART是基于解释总气体产量(TGP)、CH₄产量和乙酸盐(C2)与丙酸盐(C3)摩尔比的79.1％的变化的生化参数。数据是四次方根转化的(fourth-root transformed)。括号中的数字表示每个终端分支中群集的物种的数量。该图表明锌是独立的变量，对多变量CART模型具有最高的重要性，表明锌可以与网地藻属和海门冬属物种特有的其他生化变量相互作用。

图5显示与脱壳棉籽粗粉(DCS)相比，大型藻类物种的体外总气体(ml.g^-1OM)和CH₄产量(ml.g^-1OM)之间的线性关系。单个数据点表示每个物种的平均值(mg.g^-1OM，±SE)。

图6显示海门冬属(A)和鞘藻属(B)在72小时的培养时间在体外的总气体产量。误差条表示±SE(n＝4)。该图表明海门冬属和鞘藻属物种减少体外厌氧发酵的总气体产量。该图还表明海门冬属和鞘藻属物种以剂量依赖性方式减少厌氧发酵的总气体产量。

图7显示在海门冬属、鞘藻属和无芒虎尾草(Rhodes grass)(对照)存在下在72小时的总气体产量。该图表明海门冬属和鞘藻属物种减少体外厌氧发酵的总气体产量。该图还表明海门冬属和鞘藻属物种以剂量依赖性方式减少厌氧发酵的总气体产量。误差条表示±SE。

图8显示在海门冬属、鞘藻属和无芒虎尾草(对照)存在下在体外72小时厌氧培养后的有机物降解(％)。该图表明海门冬属和鞘藻属物种以剂量依赖性方式减少厌氧发酵的降解的有机物的量。该图还表明海门冬属物种在抑制总气体和甲烷产量的剂量不减少降解的有机物的量。误差条表示±SE。

图9显示在海门冬属、鞘藻属和无芒虎尾草(对照)存在下在体外72小时厌氧培养后的干物质降解(％)。该图表明海门冬属和鞘藻属物种以剂量依赖性方式减少厌氧发酵的降解的干物质的量。该图还表明海门冬属在抑制总气体和甲烷产量的海门冬属的剂量不减少降解的干物质的量。误差条表示±SE。

图10显示作为在体外厌氧培养24和72小时产生的总气体的％的平均CH₄产量。该图表明海门冬属减少厌氧发酵的CH₄产量(作为TGP的％)。该图还表明海门冬属以剂量依赖性方式减少CH₄产量(作为TGP的％)。误差条表示±SE。

图11显示在海门冬属、鞘藻属和无芒虎尾草(对照)存在下在体外厌氧培养24和72小时的平均CH₄产量(ml.g^-1OM)。误差条表示±SE。该图表明海门冬属减少厌氧发酵的CH₄产量。该图还表明海门冬属以剂量依赖性方式减少厌氧发酵的CH₄产量。误差条表示±SE。

图12显示在体外厌氧培养24和72小时海门冬属、鞘藻属和无芒虎尾草(对照)的总气体(ml.g^-1OM)和甲烷产量(ml.g^-1OM)之间的关系。误差条表示±SE。

图13显示在体外剂量-反应实验中的平均总挥发性脂肪酸(VFA)产量(A)和乙酸盐与丙酸盐(B)比例。该图表明海门冬属在抑制总气体和甲烷产量的海门冬属剂量不减少VFA的量。该图还表明海门冬属在不减少厌氧发酵的降解的有机物或干物质的量的海门冬属剂量不减少VFA的量。该图还表明海门冬属在抑制总气体和甲烷产量的海门冬属剂量减小乙酸盐与丙酸盐之比。结合表8，该数据还证明海门冬属在不减少来自厌氧发酵的降解的有机物或干物质的量的海门冬属的剂量增加丙酸盐的量。结合表8，该图还表明海门冬属在不减少来自厌氧发酵的降解的有机物或干物质的量的海门冬属剂量减少乙酸盐的量。

图14显示以碎片草(Flinders grass)(Iseilema sps.)基础饮食喂饲的或以具有海门冬属的碎片草(Iseilema sps.)基础饮食喂饲的肉用公牛(steer)的平均甲烷产量。误差条表示SD。该图表明施用海门冬属物种减少喂饲低质量饲料的动物体内的甲烷产量。

图15显示表现出针对海门冬属处理的一致性反应的肉用公牛的以g.kg^-1DMI(A)和g.d^-1(B)计的平均甲烷产量。该图表明海门冬属减少体内甲烷产量。误差条表示±SE。括号中的数字表示每次处理的肉用公牛的头数。

图16显示肉用公牛七天的平均饲料摄入，以干物质摄入(kg.d^-1)表示。括号中的数字表示每次处理的肉用公牛的头数。该图表明海门冬属不减少体内干物质摄入。该图还表明海门冬属在抑制体内总气体和甲烷产量的海门冬属剂量不减少体内干物质摄入。误差条表示±SE。

图17显示肉用公牛的平均总挥发性脂肪酸(VFA)产量(A)和乙酸盐与丙酸盐比(B)。误差条表示±SE(n＝2)。该图表明海门冬属在抑制体内甲烷产量的海门冬属剂量不减少总VFA产量的量(瘤胃功能的指示)。该图还表明海门冬属在不减少体内干物质摄入量的海门冬属剂量不减少总VFA量。该图还表明在处理15天和30天后，海门冬属在抑制总气体和甲烷产量的海门冬属剂量减小乙酸盐与丙酸盐之比。该图还表明海门冬属在不减少有机物或干物质摄入量的海门冬属剂量降低乙酸盐与丙酸盐之比。

图18显示用补充有或未补充海门冬属的丸粒化饮食喂饲的绵羊的每日的平均甲烷产量(g.kg^-1DMI)。显示了不同的海门冬属剂量(作为有机物的％)。该图表明海门冬属减少体内甲烷产量。剂量反应是显著的，增加海门冬属剂量(作为有机物的％)高于0.5％OM基础，导致产生的甲烷减少53％-80％。误差条表示±SE。结合表10和11，该图还表明海门冬属在不减少来自厌氧发酵的降解的有机物或干物质的量的海门冬属剂量减少产生的甲烷的量，并且海门冬属在没有不利地影响丙酸盐的摩尔浓度且减小乙酸盐与丙酸盐之比的海门冬属剂量减少产生的甲烷的量。

详述

本发明涉及一种用于减少反刍动物的总气体产量(TGP)和/或甲烷(CH₄)产量的方法。具体地，本发明人已经证明红色海洋大型藻类具有减少反刍动物中的甲烷产量的性质。

图1、6和7显示在红色海洋大型藻类的存在下体外厌氧发酵(本文也称为瘤胃发酵)产生的总气体的减少。图2、10和11显示了在红色海洋大型藻类存在下体外厌氧发酵产生的甲烷的减少。图14、15和18显示施用红色海洋大型藻类的反刍动物体内产生的甲烷的减少。

因此，本发明涉及一种减少反刍动物中总气体产量和/或甲烷产量的方法，所述方法包括向所述反刍动物施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种的步骤。

在一个实施方案中，所述红色海洋大型藻类物种属于海门冬属(Asparagopsis)。

用于本文的术语“减少”包括与参照相比物质量的减少。例如，相对于没有施用包含本发明的红色海洋大型藻类组合物的组合物的动物，施用包含本发明所述的红色海洋大型藻类的组合物的反刍动物产生的总气体和/或甲烷的量的减少。减少可以用模拟厌氧发酵的人造瘤胃系统在体外测量，或用限制在呼吸室的动物体内测量。评估反刍动物的肠内甲烷产生在本领域受过训练的技术人员的知识和技能内。

用于本文的术语“厌氧发酵”旨在包括体内厌氧发酵，例如，在反刍动物中的厌氧发酵。

用于本文的术语‘减少总气体产量’是指减少产生的气体总量，例如，减少在胃肠道中产生的总气体的量。该术语包括例如在本文所述的系统中由于厌氧发酵产生的所有气体的总体体积。反刍动物的瘤胃和肠道内的发酵引起气体产生，所述气体包括甲烷。本发明目的是减少这一过程，诸如减少在胃肠道内产生的气体总量。评估反刍动物的总气体产量在本领域受过训练的技术人员的知识和技能内。

用于本文的术语‘减少甲烷产量’是指减少在胃肠道内产生的甲烷。该术语包括例如在本文所述的系统中由于厌氧发酵产生的甲烷的特定体积。反刍动物的瘤胃和肠道内的发酵引起甲烷产生。本发明目的是减少这一过程，诸如减少在胃肠道内产生的甲烷总量。评估反刍动物的甲烷产量在本领域受过训练的技术人员的知识和技能内。

本研究提供大型藻类能够有效地减少甲烷产量的首份证据，并且本发明人已经证明，相对于脱壳棉籽(DCS)阳性对照，所有物种具有相似的或更低的TGP和CH₄产量。重要地是，由于脱壳棉籽较其他高能量谷物极大减少CH₄产量，所以其被用作牛的饲料补充剂。与DCS相比，总气体产量的减少在物种间相似，这表明大型藻类相对于高能量谷物减少瘤胃TGP和CH₄产量，并且一些大型藻类相对于DCS阳性对照减少瘤胃TGP和CH₄产量。

例如，本发明人已经证明了扩展刚毛藻(Cladophora patentiramea)具有海洋绿色大型藻类的最低的TGP，共产生79.7mL.g^-1OM(图1b)。网地藻属是最有效的褐色大型藻类物种，72小时后将TGP减少至59.4mL.g-1OM(图1c)，导致比脱壳棉籽(DCS)阳性对照显著更低的TGP(53.2％)(图1c，Tukey’s HSD 72h，p<0.0001)。该作用在24小时时甚至更大(TGP＝比DCS低76.7％)。其他褐色大型藻类使TGP减少>10％，与DCS相比，扇藻属(Padina)、翅藻属(Cystoseira)和囊藻属(Colpomenia)显著减少TGP(表2，Tukey’s HSD 72h，p<0.02)。所有大型藻类中最有效的是红藻海门冬属(图1d)，其具有最低的TGP，48.4mL.g-1OM。

此外，本发明人已经证明CH₄产量整体上按照与上文和实施例中所述的TGP相同的方式，并且显著地，CH₄产量直接且显著地与TGP值相关。例如，阳性对照DCS具有最高的CH₄输出，在72小时产生18.1mL.g^-1OM。海门冬属、网地藻属和扩展刚毛藻也对减少体外CH₄产量具有最明显的作用。扩展刚毛藻具有6.1mL.g-1OM的CH₄输出(表1)，并且产生比DCS少66.3％的CH₄(图2b，Tukey’s HSD 72h，p<0.0001)。网地藻属产生1.4mL.g^-1OM，并且是最有效的褐色大型藻类，与DCS相比，使CH₄输出减少92％(图2c，表2，Tukey’s HSD 72h，p<0.001)并且使TGP内CH₄的浓度(23.4mL.L-1)减少83.5％(表2)。

在所有大型藻类物种中，海门冬属具有最低的CH₄输出，在整个温育期间最大产生0.2mL.g-1OM(表2，Tukey’s HSD 72h，p<0.001)。与DCS相比，这是CH4输出的98.9％的减少(图2d)，与时间无关。显著地，海门冬属还具有TGP内最低的CH₄浓度，72小时后，每升TGP仅产生4.3mL.L^-1的CH⁴，这令其与所有其他的物种截然不同(表2)。

在本发明的优选实施方案中，与参照相比，产生的总气体量减少至少90％、80％、70％、61％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。在一个实施方案中，所述参照是动物未施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种时产生的总气体的量。在另一个实施方案中，所述参照是动物施用脱壳棉籽时产生的总气体的量。在另一个实施方案中，所述参照是脱壳棉籽进行体外厌氧发酵时产生的总气体的量。

在一个实施方案中，相对于脱壳棉籽进行体外瘤胃发酵时产生的总气体量，体外瘤胃发酵产生的总气体量减少至少61.8％。

在本发明的优选实施方案中，与参照相比，产生的甲烷的量减少至少90％、80％、70％、61％、60％、53％、50％、40％、30％、20％、15％、11％或10％。在一个实施方案中，所述参照是动物不施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种时产生的甲烷的量。在另一个实施方案中，所述参照是动物施用脱壳棉籽时产生的甲烷的量。在另一个实施方案中，所述参照是动物施用本文中称为‘羽扇豆饮食’的具有额外量的粉碎的羽扇豆的以谷草作为粗饲料组分[化学组成(g/kg DM)为：灰分，72；粗蛋白(CP)112；中性洗涤纤维(neutraldetergent fibre)(aNDFom)519；酸性洗涤纤维(ADFom)338，并且无钴、硒和瘤胃调节剂]的基于羽扇豆、燕麦、大麦、小麦的丸粒化商业货运配给料时产生的甲烷的量。在另一个实施方案中，所述参照是羽扇豆饮食进行体外厌氧发酵时产生的甲烷的量。

在一个实施方案中，与脱壳棉籽进行体外瘤胃发酵时产生的甲烷的量相比，通过体外瘤胃发酵产生的甲烷的量减少至少98.8％。

在一个实施方案中，与反刍动物施用脱壳棉籽时产生的甲烷的量相比，产生的甲烷的量减少至少10％。

在一个实施方案中，与反刍动物施用脱壳棉籽时产生的甲烷的量相比，产生的甲烷的量减少至少15％。

本发明人还证明了相对于羽扇豆饮食阳性对照，海门冬属能够有效地减少绵羊中的甲烷产量。在一个实施方案中，与反刍动物施用羽扇豆饮食时产生的甲烷的量相比，产生的甲烷的量减少至少53％。

“有效量”意指至少一种红色海洋大型藻类物种的足以允许改善的量，所述改善为例如：与参照或对照相比，甲烷生产的量的减少，与参照或对照相比，产生的总气体的量的减少，与参照或对照相比，保持有效水平的所需的挥发性脂肪酸，与参照或对照相比，减小乙酸盐与丙酸盐之比，与参照或对照相比，保持活重、干物质摄入和/或有机物摄入。在本发明的意义内，可以使用人造瘤胃系统(如在T.Hano.，J.Gen.Appl.Microbiol.，39，35-45,1993中所述的)在瘤胃中测量甲烷减少效果，或者通过口服施用给反刍动物在体内测量。

因此，在一个实施方案中，所述至少一种红色海洋大型藻类物种优选以施用给反刍动物的有机物的至少16.67、10、5、3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％的剂量施用。

在优选的实施方案中，所述至少一种红色海洋大型藻类物种优选以施用给反刍动物的有机物的至少3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％的剂量施用。

例如，如果一只450kg的反刍动物(例如，肉用公牛)每天消耗其体重2.5％至3％的饲料，那么，所述至少一种红色海洋大型藻类物种以与施用给所述反刍动物的有机物的量成比例的剂量施用。在450kg的反刍动物(并且其中80％的饲料是有机物)的情形中，如果动物每天消耗其体重的约2.5％的饲料，那么，所述至少一种红色海洋大型藻类物种以导致施用给所述反刍动物的有机物的至少3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％的剂量的约0.27、0.18、0.09、0.045、0.0225、0.01125或0.00603kg/天的剂量施用。

在450kg的反刍动物的情形中，如果该动物每天消耗其体重的约3％的饲料，并且其中80％的饲料是有机物，那么，所述至少一种红色海洋大型藻类物种以导致施用给所述反刍动物的有机物的至少3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％的剂量的约0.324、0.216、0.108、0.054、0.027、0.0135或0.007236kg/天的剂量施用。

所述至少一种红色海洋大型藻类物种的有效量可以通过本文所述的方法确定，包括本文所述的体外和体内剂量-反应研究。例如，本发明人已经证明体外瘤胃发酵可以用于检验所述至少一种红色海洋大型藻类物种的量对挥发性脂肪酸(包括乙酸盐和丙酸盐)的水平、甲烷产量和总气体产量的作用。因此，体外瘤胃发酵可以用来表征可以作为足以允许改善的有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种的剂量，所述改善例如是，与参照或对照相比，甲烷生产的量的减少，与参照或对照相比，产生的总气体量的减少，与参照或对照相比，保持有效水平的所需的挥发性脂肪酸，或与参照或对照相比，乙酸盐与丙酸盐之比减小。

反刍动物是偶蹄目(Artiodactyla)的哺乳动物，其通过在动物的第一胃室内初始软化和部分发酵食物，然后反流半消化的物质(现在称为反刍物)并且再次咀嚼它而消化基于植物的食物。

反嚼反刍物以进一步分解植物物质并且刺激消化的过程称为“反刍”。反刍动物的消化道具有四个室，即，瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃。在前两个室内，即在瘤胃和网胃内，食物与唾液混合并且分成固体和液体物质的层。固体团在一起形成反刍物或食团。反刍物然后被反流，缓慢咀嚼以将其与唾液完全混合，唾液进一步分解纤维。在这些室内，纤维，主要是纤维素，被共生的厌氧细菌、原生动物和真菌分解成葡萄糖。然后，现在处在内容物的液体部分中的分解的纤维通过瘤胃进入下一个胃室，即，瓣胃。皱胃中的食物更像其在单胃中那样被消化。最后，消化道内容物被传送到小肠，在此处发生营养物质的吸收。几乎所有由纤维素分解产生的葡萄糖都被共生的细菌所利用。反刍动物从由细菌产生的挥发性短链脂肪酸(VFA)获得它们的能量，所述挥发性短链脂肪酸即乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐和异戊酸盐。

重要地是，本发明人已经证明了红色海洋大型藻类具有在不损害瘤胃发酵的前提下减少反刍动物中的总气体产量和/或甲烷产量的性质。

例如，本发明人已经证明红色海洋大型藻类具有在不损害瘤胃发酵的前提下(例如，同时保持有效水平的需要的挥发性脂肪酸)减少反刍动物中的总气体产量和/或甲烷产量的性质。

本发明人还已经证明红色海洋大型藻类具有在不损害瘤胃发酵的前提下(例如，同时不显著地影响日常饲料摄入和/或动物活重)减少反刍动物中的总气体产量和/或甲烷产量的性质。

用于本文的术语“有效水平”包括在处理后(例如，施用至少一种红色海洋大型藻类物种)与对照或参照没有显著不同的动物中物质的量，所述对照或参照包括没有施用包含本发明的红色海洋大型藻类组合物的组合物的动物中的物质的量。

例如，“有效量的挥发性脂肪酸”意欲包括由没有施用包含本发明所述的红色海洋大型藻类的组合物的反刍动物产生的一种或多种挥发性脂肪酸的量。

碳水化合物代谢主要通过纤维素和淀粉发酵为瘤胃微生物的生长提供能量。不溶性聚合物被来自瘤胃微生物的细胞外酶转化成寡糖和可溶的糖。然后，产生的糖被发酵成多种形式的挥发性脂肪酸、二氧化碳和氢气中的一种。用于本文时，所述挥发性脂肪酸–乙酸、丙酸和丁酸–也分别称为乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。

挥发性脂肪酸被动物以不同程度的效率用作主要的碳和能量来源。因为丙酸是动物中糖异生的主要代谢前体，因此高水平的丙酸是理想的。6-碳糖到乙酸的发酵相对效率低，原因在于在该过程中，碳和氢通过以二氧化碳或重要地以甲烷的形式嗝气而失去。另一方面，丙酸的产生利用氢并且不导致碳或甲烷的失去。

那么，通过增加丙酸相对于乙酸的摩尔比，或者在另一个实施方案中，通过增加瘤胃中的总挥发性脂肪酸浓度(即，乙酸、丙酸和丁酸的总和)来改善饲料利用效率和/或反刍动物生长率是可行的。

本发明人已经证明了红色海洋大型藻类的存在减少了体外和体内厌氧发酵中产生的总气体和/或产生的甲烷，而没有不利地影响牛中的总VFA产量。图13A显示海门冬属在体外厌氧发酵过程中保持有效水平的VFA。该图还显示海门冬属在抑制总气体和甲烷产量的海门冬属剂量减少乙酸盐与丙酸盐之比。结合表8，该数据还证明海门冬属在不减少来自厌氧发酵的降解的有机物或干物质的量的海门冬属剂量减少乙酸盐的量并且增加丙酸盐的量。图17证明海门冬属在抑制牛体内甲烷生产的海门冬属剂量和在不减少体内干物质摄入的量的海门冬属剂量，没有不利地影响VFA的量。该数据还证明海门冬属在处理的15天和30天抑制总气体和甲烷产量的海门冬属剂量减小乙酸盐与丙酸盐之比，并且海门冬属在不减少有机物或干物质摄入量的海门冬属剂量减小乙酸盐与丙酸盐之比。

重要地是，本发明人已经证明海门冬属在下述剂量不减少牛中的VFA的量：在不减少有机物或干物质摄入/降解的量的海门冬属剂量；在减小乙酸盐与丙酸盐之比的剂量；在减少乙酸盐的量的剂量；在增加丙酸盐的量的剂量；和/或在体外和体内抑制总气体和甲烷产生的海门冬属剂量。

重要地是，本发明人已经证明海门冬属在抑制牛中的总气体和甲烷产量的海门冬属剂量不减少VFA的量。

本发明人还已经证明海门冬属在下述剂量不减少绵羊中的有机物或干物质摄入/降解量：在减小乙酸盐与丙酸盐之比的剂量；在减少乙酸盐的量的剂量；在增加丙酸盐的量的剂量；和/或在体外和体内抑制甲烷产生的海门冬属剂量。例如，本发明人已经证明海门冬属不减少以1.2倍维持能喂饲的绵羊中的有机物或干物质摄入/降解的量。

结合表10和11，图18证明海门冬属在抑制绵羊中甲烷产生的海门冬属剂量减少乙酸盐的量；增加丙酸盐的量；并且减小乙酸盐与丙酸盐之比。

结合表10和11，图18证明海门冬属在不影响绵羊的动物活重或每日饲料摄入的海门冬属剂量减少乙酸盐的量；增加丙酸盐的量；并且减小乙酸盐与丙酸盐之比。

因此，在一个方面，本发明涉及一种减少反刍动物中总气体产量和/或甲烷产量的方法，所述方法包括给所述反刍动物施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种的步骤，其中保持有效水平的需要的挥发性脂肪酸。

在一个实施方案中，所述需要的挥发性脂肪酸是乙酸盐和丙酸盐。

用于本文的术语“挥发性脂肪酸”("VFA")包括饲料成分在瘤胃中厌氧微生物发酵的终产物。常见的VFA包括乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐、戊酸盐和异戊酸盐。VFA被瘤胃吸收并且被动物利用进行能量和脂质合成。

在本发明优选的实施方案中，在有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种的存在下在瘤胃发酵中产生的总VFA是至少80mmol/L。

在本发明的其他实施方案中，在有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种的存在下在瘤胃发酵中产生的总VFA是至少65mmol/L。

本发明人还已经证明海门冬属在不减少来自瘤胃发酵的降解的有机物或干物质的量或干物质摄入量的海门冬属剂量不减少牛中VFA的量。本发明人还已经证明海门冬属不减少绵羊的干物质摄入量或活重。例如，本发明人已经证明海门冬属不减少以1.2倍维持能喂饲的绵羊的干物质摄入量或活重。这表明红色海洋大型藻类在不损害瘤胃发酵的前提下减少反刍动物中的总气体产量和/或甲烷产量。

因此，在一个方面，本发明涉及用于减少反刍动物中总气体产量和/或甲烷产量的方法，所述方法包括向所述反刍动物施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种的步骤，其中保持降解的有机物和/或干物质的量。在另一个方面，本发明涉及一种减少反刍动物中总气体产量和/或甲烷产量的方法，所述方法包括向所述反刍动物施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种的步骤，其中保持干物质的摄入量。

用于本文的术语“有机物”和“干物质”意指动物在给定时间期间(典型地24小时)内消耗的饲料量(分别在有机或无水基础上)。本领域已知怎样计算有机物和干物质摄入和/或降解。例如，干物质和有机物可以分别为饲料量的90％和80％。

在一个实施方案中，所述至少一种红色海洋大型藻类物种优选以施用给反刍动物的有机物的至少16.67、10、5、3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％的剂量施用。

在一个优选的实施方案中，所述至少一种红色海洋大型藻类物种优选以施用给反刍动物的有机物的至少3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％的剂量施用，以保持降解的有机物和/或干物质的量。

在另一个实施方案中，保持降解的有机物或干物质的量，并且保持有效水平的需要的挥发性脂肪酸。

在一个优选的实施方案中，所述至少一种红色海洋大型藻类物种优选以施用给反刍动物的有机物的至少3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％的剂量施用，以保持有效水平的需要的挥发性脂肪酸。

重要地是，本发明人已经证明海门冬属在抑制总气体和甲烷产量的海门冬属剂量增加丙酸盐的量，并且海门冬属在不减少降解的有机物或干物质的量的海门冬属剂量增加丙酸盐的量。

在另一个方面，本发明涉及一种减少反刍动物中总气体产量和/或甲烷产量的方法，所述方法包括向所述反刍动物施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种的步骤，其中降解的有机物或干物质的量得到保持和/或乙酸盐与丙酸盐之比减小。

在一个优选的实施方案中，所述至少一种红色海洋大型藻类物种优选以施用给反刍动物的有机物的至少3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％的剂量施用，以减小乙酸盐与丙酸盐之比。

在一个实施方案中，在施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种后乙酸盐与丙酸盐之比(C2/C3比例)没有受到不利影响。在另一个实施方案中，在施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种后乙酸盐与丙酸盐之比(C2/C3比例)减小。

在本发明的一个优选实施方案中，在施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种后乙酸盐与丙酸盐之比(C2/C3比例)不大于5。在另一个实施方案中，在施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种后乙酸盐与丙酸盐之比(C2/C3比例)不大于4。在另一个实施方案中，在施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种后乙酸盐与丙酸盐之比(C2/C3比例)不大于3。在另一个实施方案中，在施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种后乙酸盐与丙酸盐之比(C2/C3比例)不大于2。

在另一个实施方案中，丙酸盐的摩尔浓度没有受到不利影响。

例如，图17显示在向反刍动物(牛)施用海门冬属后，总VFA浓度没有受到不利影响，对于对照，在第1天、15天后和30天后，总VFA浓度分别等于73.5、75.5和102.3mmol.L-1。

表11显示在向反刍动物(绵羊)施用海门冬属后，丙酸盐浓度没有受到不利影响，在饲料中以每天有机物摄入的0.5、1、2和3％的剂量包含海门冬属后，具有显著更高的丙酸盐浓度。

本发明人已经证明剂量对总VFA产量和/或乙酸盐与丙酸盐之比的剂量依赖性作用。例如，图13显示剂量对总VFA产量和/或乙酸盐与丙酸盐之比的剂量依赖性作用。图17显示向反刍动物施用至少一种红色海洋大型藻类物种减小乙酸盐与丙酸盐之比。表11显示在动物饲料中包含海门冬属减小反刍动物(绵羊)中的乙酸盐与丙酸盐之比。

低质量纤维饲料的瘤胃发酵是反刍动物中甲烷产生的主要来源。

下面列出了反刍动物的实例。然而，优选的，使用红色海洋大型藻类作为家畜(诸如牛、山羊、绵羊和美洲驼)的饲料食品添加剂。本发明特别用于牛和绵羊。因此，在一个实施方案中，所述反刍动物选自反刍亚目(Ruminantia)和骈足亚目(Tylopoda)的成员。在另一个实施方案中，所述反刍动物是牛或绵羊。在另一个实施方案中，所述反刍动物是牛。

“施用”或“被施用”意指向动物的胃肠道中引入至少一种本发明所述的红色海洋大型藻类物种的动作。更具体地，该施用是通过口服途径施用。该施用可以特别地通过下述进行：给意欲用于动物的饲料补充以所述至少一种红色海洋大型藻类物种，然后由动物摄取这样补充的饲料。施用还可以使用胃管或使得直接将所述至少一种红色海洋大型藻类物种引入到动物的胃肠道中成为可能的任意其他方式进行。

本发明人已经证明在有效量的红色海洋大型藻类的存在下，厌氧发酵中产生的总气体和/或产生的甲烷减少。

如上文讨论的，在本发明优选的实施方案中，至少一种红色海洋大型藻类物种的有效量是施用给反刍动物的有机物的至少16.67、10、5、3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％。

例如，所述至少一种红色海洋大型藻类物种优选以反刍动物饮食中可用的有机物的至少3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％的剂量施用。

例如，如果反刍动物一天消耗其活重的约2.5-3％的饲料，则一只400kg的反刍动物一天可以消耗10-12kg饲料。

如上文讨论的，在本发明优选的实施方案中，至少一种红色海洋大型藻类物种的有效量是每天施用给反刍动物的有机物的至少16.67、10、5、3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％。优选的，所述至少一种红色海洋大型藻类物种优选以每天施用给反刍动物的有机物的至少3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％的剂量施用。

因此，如果一只400kg的反刍动物一天消耗约10kg有机物，则至少一种红色海洋大型藻类物种的有效量为至少约0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125或0.0067kg的至少一种红色海洋大型藻类物种/天。这些剂量等价于0.00075、0.0005、0.00025、0.000125、0.0000625、0.0000325或0.00001675kg/kg体重/天。

所述有效量可以以一次或多次剂量施用给反刍动物。

所述有效量还可以以每日基础以一次或多次剂量施用给反刍动物。

在另一个优选的实施方案中，提供本文前述定义的方法，其中至少一种红色海洋大型藻类物种的剂量在0.0005-1.8g/kg体重/天的范围内，更优选在0.05-0.9g/kg体重/天的范围内，最优选在0.1-0.45g/kg体重/天的范围内。

在另一个优选的实施方案中，提供本文前述定义的方法，其中至少一种红色海洋大型藻类物种的剂量在0.025-8g/kg体重/天的范围内，更优选地在0.05-4g/kg体重/天的范围内，最优选在0.1-5g/kg体重/天的范围内。

本文以每kg体重每天的量限定的剂量涉及在给定处理期间(例如在一周或一个月的处理期间)所述至少一种红色海洋大型藻类物种的平均量。因此，所述至少一种红色海洋大型藻类物种可以每天、每隔一天、每隔两天等施用，而不背离本发明的范围。但是优选的，所述方法包括以指示的剂量每天施用至少一种红色海洋大型藻类物种。甚至更优选地，所述至少一种红色海洋大型藻类物种在每次喂饲动物的动物喂料过程中以产生上述每日剂量的量施用。

本发明的方法可以包括按照上述剂量方案施用至少一种红色海洋大型藻类物种达至少5、10、25、50、100、250或350天的时间。本发明的一个方面在于这样的事实，即本发明的方法提供在减少肠甲烷生成方面非常持久的效用，例如，所述作用不随处理时间的延长而减少，例如，由于增加了瘤胃或肠道微生物的耐受性，由此使得长期的反刍动物处理是特别可行的。

“至少一个物种”意指单一物种，但是也指包括至少两个红色海洋大型藻类物种的物种混合物。

当使用物种的混合物时，每种物种的比例可以在小于1％至99％之间变化，更有利地在25％至75％之间变化，并且甚至更有利地为约50％。

在一个实施方案中，所述至少一种红色海洋大型藻类物种选自属于柏桉藻科(Bonnemaisoniaceae)家族中的红海藻的五个属(海门冬属，柏桉藻属(Bonnemaisonia)，栉齿藻属(Delisea)，Ptilonia，Leptophyllis)的物种。

在一个实施方案中，红色海洋大型藻类物种是海门冬属物种。

海门冬属具有异形生活史，其具有两个自由生长的生活史阶段-配子体(大叶状形式)和孢子体(或四分孢子体-较小的丝状形式)。历史上，四分孢子体被认为是一种单独的种属(Falkenbergia)。因此，本文中使用的“海门冬属”是指海门冬属和现在已知属于海门冬属的其他分类学分类。

存在两种认可的海门冬属物种，一种是热带/亚热带的(紫杉状海门冬)，一种是温带的(刺海门冬)，并且遍布全世界存在。

因此，在一个实施方案中，海门冬属物种选自下述物种：

a.刺海门冬

b.紫杉状海门冬

不希望受到理论限制，柏桉藻科家族中的红海藻的五个属(海门冬属，柏桉藻属，栉齿藻属，Ptilonia，Leptophyllis)产生并且存储具有生物活性的卤化天然产物。这些次级代谢物作为针对捕食、污损生物体和微生物的天然防御和物种间竞争起作用。

网地藻属(Dictyota)(本文中也称为)产生一系列次级代谢物，特别是类异戊二烯(萜)。海门冬属产生卤化的低分子量化合物，特别是溴化和氯化卤仿。这些化合物中有多种具有强抗微生物特性，并且抑制多种微生物，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌以及分支杆菌和真菌活性，并且因此可以参与贡献于本文所述的作用。来自海门冬属的次级代谢物还抑制原生动物。

因此，鉴于本文所述的海门冬属的显著作用，包括减少总气体产量和CH₄输出，在一个实施方案中，所述至少一种红色海洋大型藻类物种优选地以导致本文所述的作用(例如，减少CH₄输出)而不影响营养重要性的发酵参数的形式施用。

在另一个实施方案中，所述至少一种红色海洋大型藻类物种优选以其中次级代谢物保持治疗有效性的形式施用。

按照本发明的一个实施方案。所述至少一种红色海洋大型藻类物种被冻干并且碾成粉末。例如，所述至少一种红色海洋大型藻类物种被冻干，并且碾磨通过筛子(例如，1mm的筛子)。

按照本发明的另一个实施方案，所述至少一种红色海洋大型藻类物种被风干并被粗磨。

所述至少一种红色海洋大型藻类物种可以以多种方式中的一种施用给反刍动物。所述至少一种红色海洋大型藻类物种可以以作为兽医药物的固体形式施用，可以分布在赋型剂中，并且直接喂给动物，可以与干形式的饲料物质物理混合，或者所述至少一种红色海洋大型藻类物种可以被制成溶液，然后喷到饲料物质上。向动物施用所述至少一种红色海洋大型藻类物种的方法被认为在技术人员的技能之内。

当与饲料物质组合使用时，所述饲料物质优选是基于谷物/干草/青贮饲料/草的。包括在所述饲料物质中的是改良的和/或基于热带草或豆科植物的草料(直接放牧或被制成保存的草料干草)，任意饲料成分和食品或饲料工业副产物以及生物燃料工业副产物和玉米粗粉及其混合物，或饲养场和牛奶场配给料，诸如谷物含量高的那些。

施用时间不重要，只要显示出对甲烷产量的减少作用即可。只要饲料保留在瘤胃中，可以在任何时间进行施用。然而，由于所述至少一种红色海洋大型藻类物种优选在大约甲烷产生的时间存在于瘤胃中，所述至少一种红色海洋大型藻类物种优选地与饲料一起或在饲料之前立即施用。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种通过用所述有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种补充意欲用于动物的饲料而施用给反刍动物。在本发明的意义内，“补充”意指向意欲用于动物的饲料中直接掺加本发明所述的有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种。因此，当喂饲时，动物摄取至少一种本发明所述的红色海洋大型藻类物种，然后所述物种可以增加例如动物饲料中包含的纤维和/或谷物的消化性。

因此，本发明的另一个主题涉及一种用于反刍动物的饲料补充剂，其包含至少一种红色海洋大型藻类物种。

在另一个方面，本发明还提供一种用于减少反刍动物中的总气体产量和/或甲烷产量的饲料补充剂，所述补充剂包含有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种。

在一个实施方案中，有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种通过用所述有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种补充意欲用于反刍动物的食物而施用给所述动物。

在一个实施方案中，所述红色海洋大型藻类物种是海门冬属物种。在另一个实施方案中，所述海门冬属物种是紫杉状海门冬。

如上文讨论的，在一个实施方案中，本发明保持反刍动物中的VFA水平。因此，该方法允许反刍动物保持来自基于例如纤维和谷物的饲料的能量，并且作为结果，始于相同的热量摄入，保持可用于代谢的能量同时减少总气体和CH₄产量。

这对畜牧业农场主是有利的，他们因此可以优化每单位可用的代谢能量的饲料成本。这也代表着实质性的经济益处。

本发明人已经证明向反刍动物施用有效量的海门冬属没有不利地影响自发的饲料摄入。例如，图16显示以等价于平均每天干物质摄入的2.9％的剂量向反刍动物施用有效量的海门冬属没有不利地影响自发的饲料摄入，在处理30天后，对照与补充的动物之间的摄入差异不大于5.6％。表11证明以等价于平均每天有机物摄入的0.5％、1％、2％或3％的剂量向反刍动物施用有效量的海门冬属没有不利地影响自发饲料摄入。

因此，本发明提供这样的方法，其中降解的有机物和/或干物质的水平得到保持。

用于本文的术语“动物饲料补充剂”是指包含活性成分的浓缩的添加剂预混合物，所述预混合物或补充剂可以添加到动物饲料或口粮中以形成本发明所述的补充的饲料。通常认为术语“动物饲料预混合物”、“动物饲料补充剂”和“动物饲料添加剂”具有相似或相同的意思，并且通常认为可互换使用。典型地，本发明的动物饲料补充剂的形式是粉末或压实或粒化的固体。在实践中，典型地可以通过将动物饲料补充剂直接添加到口粮中(例如，作为所谓的表肥)而将动物饲料补充剂喂给牲畜，或者其可以用于制备或制造产品，诸如复合动物饲料或舔块(lick blocks)，这将在下文中更详细地描述。本发明在这方面不特别受限。本发明所述的补充剂典型的以16-2500g/动物/天的量喂饲给动物。

在一个实施方案中，本发明所述的补充剂以基于实际个体动物摄入的量(例如，g/kg DM摄入)施用。

本发明的动物饲料补充剂包含至少一种红色海洋大型藻类物种，并且这样配制，以致当添加到饲料中时，所述至少一种红色海洋大型藻类物种以所述饲料的有机物的至少0.067、0.125、0.25、0.5、1、2、3、5、10或16.67％存在。

例如，如果一只反刍动物一天消耗大约5kg有机物，则动物饲料补充剂包含至少一种红色海洋大型藻类物种，并且这样配制，以致当添加到饲料中时，所述至少一种红色海洋大型藻类物种分别以3.35、6.25、12.5、25、50、100、150、250、500或833.5克/天的剂量存在。

在本发明优选的实施方案中，基于干重，所述补充剂包含以10-100重量％的量存在的至少一种红色海洋大型藻类物种，优选地所述量超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、97或99重量％。

考虑特定类型的动物和其被养殖的环境，准确确定包含在补充剂中的组分的理想的量和要用在口粮制剂或复合动物饲料中的补充剂的量等是在受过训练的专业人员的技能范围内的。本文中给出了每种组分的优选剂量。

在不背离本发明的范围的前提下，本发明的动物饲料补充剂可以包含任意其他成分。其可以典型地包含制备所需要的产品所需要的公知的赋型剂，并且其可以包含旨在改善饲料的治疗和/或改善消耗所述补充剂的动物的性能的其他添加剂。所述成分的适当的实例包括载体或填充剂，诸如乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉结晶纤维素、碳酸氢钠、氯化钠等，和粘合剂，诸如阿拉伯树胶、黄蓍胶、藻酸钠、淀粉、PVP和纤维素衍生物等。本领域技术人员已知的饲料添加剂的实例包括维生素、氨基酸和痕量元素、消化增强剂和肠道菌群稳定剂等。

此外，本发明人已经发现当使用其他的大型藻类时，获得良好的结果。例如，本发明人已经证明网地藻属、鞘藻属和扩展刚毛藻减少来自瘤胃发酵的总气体产量和CH₄产量。

因此，在另一个实施方案中，方法还包括向所述反刍动物施用有效量的选自由下述组成的组的至少一种大型藻类物种：刺海门冬、紫杉状海门冬、网地藻属物种(例如Dictyota bartayresii)、鞘藻属物种、石莼物种和扩展刚毛藻。

一般地，海洋藻类比淡水藻类更有效地减少CH₄产生。淡水大型藻类具有与DCS相似的生化组成，然而，相对于DCS，在72小时温育后，水绵属(Spirogyra)的CH₄输出减少至4.4％，鞘藻属的CH₄输出减少至30.3％。然而，淡水大型藻类的生化组成与CH₄的减少之间没有相关性。尽管CH₄被减少了，但是，对发酵变量没有明显的不利作用。相反，淡水大型藻类具有比DCS略高的总VFA浓度，具有相似的有机物降解(OMd)，这表明发酵过程没有受损害。

海洋藻类显著减少CH₄产生，其中两种物种，褐色大型藻类网地藻属和红色大型藻类海门冬属具有最显著的作用。与DCS相比，网地藻属抑制53.2％的TGP和大于92％的CH₄产量，而海门冬属是最有效的处理，与DCS相比，减少61.8％的TGP和98.9％的CH₄产量。当在体外以有机物的16.67％的剂量施用时，在所有物种中，网地藻属和海门冬属还产生最低的总VFA浓度，和最高的丙酸盐摩尔浓度，这证明在该剂量，发酵被显著影响。

总VFA浓度的减少通常与干扰瘤胃发酵的抗营养因子有关。与单宁含量高的陆生植物或一些饲料谷物或豆科植物相比，牛中检测的浓度的海门冬属在减少产生的总气体中的CH₄的比例方面更有效。

海门冬属具有与DCS相似的(主要)生化组成，不同之处在于高水平的锌和低的PUFA。海门冬属和网地藻属二者都具有高浓度的锌，然而，海膜属(Halymenia)也具有相似的浓度，但是，与网地藻属相比，产生47.9％更多的TGP和89.5％更多的CH₄。显著地，当以高于250mg.kg-1DM的浓度向饮食中加入锌时，其可以减少体外底物降解，并且增加丙酸盐的摩尔比，这是减少的甲烷输出的指示性参数。然而，网地藻属中锌的浓度为0.099mg.kg-1DM，海门冬属中为0.15mg.kg-1DM，并且这些浓度远低于250mg.kg-1DM的阈值。因此，几乎不存在证据证明锌减少CH₄产量至在网地藻属和海门冬属中发生的程度。不希望受到理论限制，然而，可能的是，锌与这两个藻类物种产生的次级代谢物协同作用从而减少CH₄产量。一些元素甚至能够在低阈值浓度增加植物的次级代谢物浓度。

不希望受到理论限制，本发明人提出海门冬属和网地藻属富含具有强抗微生物性质并且缺少气体与甲烷产生之间的强烈关系的次级代谢物，并且分析的>70种主要生化参数中的任一种都提示总气体产生和CH₄的减少可能与次级代谢物相关。

因此，在一个方面，本发明涉及用于减少反刍动物中的总气体产量和/或甲烷产量的方法，所述方法包括向所述反刍动物施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种和第二海洋大型藻类物种的步骤。

在一个实施方案中，所述第二海洋大型藻类物种选自由下述组成的组：刺海门冬、紫杉状海门冬、网地藻属物种(例如Dictyota bartayresii)、鞘藻属物种、石莼物种和扩展刚毛藻。

本发明另一个方面涉及产品，诸如复合动物饲料和舔块，其包含本文前文限定的补充剂。

术语‘复合动物饲料组合物’用在本文中意指适合用作动物饲料并且掺和多种天然的或非天然的基质或原料和/或添加剂的组合物。因此，特别地，术语‘复合’用在本文中区分所述动物饲料组合物与任何天然存在的原料。这些掺和物或复合饲料按照目标动物的特定需求配制。用于商业制备的复合饲料的主要成分典型地包括麦麸、米糠、玉米粗粉、谷粒、诸如大麦、小麦、黑麦和燕麦、大豆面、苜蓿粗粉、棉籽粗粉、小麦粉等。商业复合饲料典型地包含不少于15％的粗蛋白和不少于70％的可消化总营养物，但是本发明在这方面不是特别受限制。在本发明的范围内包括液体、固体以及半固体的复合动物饲料组合物，固体和半固体形式是特别优选的。这些组合物典型地制备成粉面型、丸粒或粉碎物。实践中，典型地，用复合饲料(诸如本发明的复合饲料)和青贮饲料或干草等组合喂养牲畜。典型地，复合动物饲料以0.3-10kg/动物/天的量给料。考虑动物类型和养殖其的环境，确定这些包含在复合动物饲料中的组分的适当量在受过训练的专业人员的技能之内。

本发明的复合动物饲料可以包含典型地用在本领域中的任意其他饲料添加剂。如本领域技术人员已知的，在这一情形中，术语‘饲料添加剂’是指出于改善饲料质量和动物来源的食品的质量的目的，或为了改善动物性能，例如，提供增强的饲料物质消化性，用于动物营养的产品。非限制性的实例包括技术添加剂，诸如防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、酸性调节剂和青贮饲料添加剂；感觉添加剂，尤其是调味剂和着色剂；(其他)营养添加剂，诸如维生素、氨基酸和痕量元素；和(其他)动物学技术添加剂(zootechnicaladditives)，诸如消化增强剂和肠道菌群稳定剂。

本领域技术人员应该清楚，在不背离本发明的范围的前提下，本发明的复合动物饲料组合物可以包含任意其他的成分或添加剂。

在另一个方面，本发明提供包含本发明的补充剂的舔石料(lick stone)或舔块。如本领域技术人员已知的，舔石料或舔块特别方便用于向在天然牧场和栽培牧场放牧的反刍动物喂饲矿物补充剂(以及蛋白和碳水化合物)。除了本发明的红色海洋大型藻类之外，本发明所述的舔块或舔石料典型地包含多种类型的粘合剂，例如，胶泥、石膏、石灰、磷酸钙、碳酸盐和/或明胶；并且任选地其他添加剂，诸如维生素、痕量元素、矿物盐、感觉添加剂等。

本发明的另一个方面涉及一种减少反刍动物中肠胃甲烷产量的方法，所述方法包括施用包含至少一种红色海洋大型藻类物种的组合物。

术语‘减少肠胃甲烷生成’和‘减少肠胃甲烷产量’用在本文中是指减少胃肠道中的甲烷气体产生。如前文解释的，反刍动物的瘤胃和肠道中的发酵通过所谓的产甲烷菌引起甲烷气体产生。本发明目的是减少这一过程，诸如减少直接来自胃肠道的甲烷排放。评估动物的甲烷排放在本领域受过训练的技术人员的知识和技能之内。如之前解释的，瘤胃和肠中的甲烷产生是在健康动物中正常发生的过程，并且减少甲烷生成不增加或减少反刍动物的总体健康或安康状态。

因此，本发明的处理方法是非治疗性的处理方法，即，所述方法不改善患有特定病症的动物的健康，不预防特定的疾病或病症，其也不以任何其他方式在任何程度上影响反刍动物的健康，即，与没有接受本发明的处理方法的反刍动物相比。本发明的方法的优点限于前文阐释的环境和/或经济方面。

从上文应该清楚地，本发明的方法包括口服施用至少一种红色海洋大型藻类物种。优选地，所述处理包括口服施用前文限定的复合动物饲料组合物和/或动物饲料补充剂产品，但是在不背离本发明的范围的前提下也可以使用其他的液体、固体或半固体可口服摄入的组合物，这是本领域技术人员将理解的。

按照前述，本发明的另一个优选方面涉及包含至少一种红色海洋大型藻类物种的组合物用于非治疗性减少反刍动物中的胃肠甲烷产量的用途。

在另一个方面，本发明还提供用于反刍动物的饲料，其中所述饲料补充有本文所述的饲料补充剂。

在另一个方面，本发明提供一种用于减少反刍动物的甲烷产生的方法，所述方法包括向所述动物施用本文所述的饲料补充剂或本文所述的饲料的步骤。

现在，将通过实施例的方式进一步描述本发明，所述实施例旨在用于辅助本领域普通技术人员实施本发明，并且不意欲以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：材料和方法

藻类样品的收集和制备

选择二十种海洋和淡水大型藻类物种用于本研究，所述选择是基于所述物种在Townsville,Queensland,Australia的水产养殖系统和潮间地区的存在和丰富度进行的(表3)。在James Cook University,Townsville从大规模培养物收集七种大型藻类物种。其余的物种在下述两个潮间带岩礁滩收集：Nelly Bay，Magnetic Island(19°16’S；146°85’E)，GBRMPA许可证号为GO2/20234.1；Rowes Bay(19°23’S，146°79’E，Townsville)，DPIF许可证号103256；并且来自Townsville和周边地区的海洋和淡水水产养殖场。

将所有的大型藻类在淡水中清洗以去除沙子、残骸和附生植物。将生物质以1000rpm离心(MW512；Fisher&Paykel)5分钟以去除过量的水并称重。将每个物种的次级样品保存在4％福尔马林中用于分类学鉴定，同时将剩余的生物质在-55℃和120μbar(VirTisK台式冷冻干燥机)冷冻干燥至少48小时。将冷冻干燥的样品在分析磨中通过1mm筛子碾磨，并且在培育之前将其在-20℃保存在气密容器中。

底物的生化参数

一式两份地评价大型藻类、脱壳棉籽粗粉(DCS)和碎片草(Iseilema sp.)干草的近似和元素组成(从此处起称为生化参数)(表3和表4)。使用数字水分分析仪(A&D，MS-70，Tokyo，Japan)确定水分含量，其中将2g样品在105℃加热至恒重。通过从样品总重量减去水分含量而确定干物质(DM)含量。通过将2g样品在马弗炉中在550℃燃烧6小时而确定有机物含量(OM)。碳、氢、氧、氮、磷和硫(CHONS)通过元素分析(OEA laboratory Ltd.，UK)定量。使用生物质的总氮含量(重量％)估测粗蛋白(CP)分数，绿色、褐色和红色大型藻类的氮因数分别为5.13、5.38和4.59，DCS与碎片草干草的氮因数为6.25。提取总脂质内容物，并且使用Folch法定量。通过一步提取/酯交换法提取脂肪酸，并且通过气相GC/MS/FID(Agilent7890GC，配以FID–Agilent 5975C EI/TurboMS)以脂肪酸甲酯(FAME)进行定量，如在(表5)中所述。通过按照等式(1)的差确定碳水化合物含量：

碳水化合物(重量％)＝100–(灰分+水分+总脂质+粗蛋白)(1)

其中灰分、水分、总脂质和粗蛋白表示为DM的百分数。

按照Channiwala和Parikh，基于元素组成计算各样品的总能量含量(GE)：

GE(Mj kg^-1DM)＝0.3491*C+1.1783*H+0.1005*S–0.1034*O–0.0151*N–0.0211*灰分

由于大型藻类积聚必需矿物元素和可能抑制厌氧消化的重金属，还使用ICP-MS分析定量了100mg样品的21种元素的浓度。

实施例2：体外实验设计

从三头瘤胃瘘管印度肩峰牛(Bos indicus)肉用公牛(632±32.62kg活重)收集瘤胃液，所述牛根据由CSIRO动物伦理委员会(CSIRO Animal Ethics Committee)核准的实验指导(A5/2011)并且根据澳大利亚关于用于科学目的的动物的护理和应用的实践规范(Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals for ScientificPurposes，NHMRC，2004)在JCU的生物医学和兽医科学学院(School of Biomedical andVeterinary Sciences)维持。在整个研究期间将所述肉用公牛随意喂饲碎片草干草(Iseilema spp.)以保持接种物中一致的微生物活性。在早上喂料之前从每头动物收集大约1L瘤胃液和固体，并且将其置于预热的热烧瓶中。将汇集的瘤胃液用手持混合器以高速混合30秒，以确保固相和液相完全混合并将与细菌结合的颗粒物解离到悬浮液中，然后通过1mm网孔过滤。将过滤的瘤胃液连续用高纯度N2净化，并且保持在39℃。以1:4(vol:vol)的比例使用瘤胃液和预先加热的缓冲液[Goering H，Van Soest PJ(1970)Forage fiberanalyses(apparatus，reagents，procedures，and some applications):US AgriculturalResearch Service Washington，DC](不加入胰酶解酪蛋白)制备瘤胃培养基。

进行一系列分批培养温育以使用Ankom RF气体产量系统(Ankom RF GasProduction System)(Ankom Technology，New York，USA)评估大型藻类物种对顶部空间中的瘤胃发酵/总气体产量和CH₄浓度的影响。将0.2g OM的大型藻类的样品称入预先加温的具有碎片草的1g OM(通过1mm筛碾磨)的250mL Schott瓶中，产生0.2/1.2g OM和125mL的瘤胃培养基。因此，以16.67％OM的剂量施用海门冬属。为了优化厌氧条件，将瓶子用N₂净化，密封并且在三个温控培养箱/摇床(Ratek，OM11Orbital Mixer/Incubator，Australia)中在39℃温育，振荡设定为85rpm。空白和阳性对照，即包含碎片草的1g OM和DCS的0.2g OM的瓶子，在每个培养箱中温育。在三个不同的场合(四次重复)来重复温育。对于每次温育运行，将瓶子随机分配并放置在培养箱内部。每个瓶子接上Ankom RF模块，并且以20分钟的读数间隔监测72小时，产生TGP曲线。各模块包含压力阀，其设置为在5psi排气。每24小时将来自各模块的顶部空间气体样品直接收集到预先排空的10mL exetainer(Labco Ltd，UK)中。将顶部空间样品的TGP由压力读数转换为mL/g OM。

发酵后参数

72小时温育后，记录pH(PHM220Lab pH Meter，Radiometer Analytical，Lyon，France)，并且在分析之前将残余的液体样品保存在-20℃。在昆士兰大学(University ofQueensland)(Ruminant Nutrition Lab，Galton College，Queensland，Australia)按照标准方法[Cottyn BG,Boucque CV(1968)Rapid method for the gas-chromatographicdetermination of volatile fatty acids in rumen fluid.Journal of Agriculturaland Food Chemistry16:105-107；Ottenstein D,Bartley D(1971)Separation of freeacids C2–C5in dilute aqueous solution column technology.Journal ofChromatographic Science 9:673-681；Playne MJ(1985)Determination of ethanol,volatile fatty acids,lactic and succinic acids in fermentation liquids by gaschromatography.Journal of the Science of Food and Agriculture 36:638-644]定量VFA。总VFA浓度通过从残余液体中的总VFA浓度减去初始接种物(缓冲的瘤胃液)中的总VFA浓度而计算。还使用半自动的比色法(Tropwater Analytical Services，JCU，Townsville)分析残余液体的总氨浓度。分析固体残渣的表观有机物降解性(OMd)，其计算为温育和在72小时后回收的有机物之间的比例差异。通过装配有Carbosphere 80/100柱和FlameIonization Detector(FID)的气相层析(GC-2010，Shimadzu)测量收集的气体样品中的CH4浓度。柱、注射器和FID的温度分别设置为129℃、390℃和190℃。氦和H2分别用作载体气和燃烧气。每天注入已知组成的四个外部标准物：1)在N₂中CH₄ 0％和CO₂ 0％；2)在N₂中CH₄3％和CO₂ 7％；3)在N₂中CH₄8.89％，CO₂ 15.4％，和H₂ 16.8％；和4)在N₂中CH₄ 19.1％，CO₂27.1％，H₂ 38.8％(BOC Ltd，Australia)用于构建标准曲线，并且用于定量CH₄浓度。遵循用于收集发酵气体样品的相同步骤收集标准物。另外，在相继的气体样品之间每2小时注入标准物2(在N₂中CH₄ 3％和CO₂ 7％)，以验证GC气体组成读数。将顶部空间样品(1mL)自动注入GC中，以确定CH₄浓度。通过自动积分确定峰面积。测量的CH₄与TGP产量相关，以估测相对浓度。

数据分析

将校正的TGP数据拟合成改良的非线性S型Gompertz模型[Bidlack J，Buxton D(1992)Content and deposition rates of cellulose，hemicellulose，and ligninduring regrowth of forage grasses and legumes.Canadian Journal of PlantScience 72:809-818]:

$y={\mathrm{Ae}}^{-{\mathrm{Be}}^{-Ct}}---\left(3\right)$

其中，y是累积的总气体产量(mL)，A是最大气体产量(mL.g^-1)，B是指数气体产生开始前的延迟期(h)，C是在时间t(h)时具体的气体产生率(h)。使用非线性SAS方法(JMP 10，SAS Institute，Cary，NC，USA)计算气体生产参数A、B和C。利用单向方差分析(ANOVA)比较各物种之间在72小时的总气体产量(TGP)和CH₄产量的差异。使用Tukey’s HSD多元比较进行事后(post-hoc)比较。

ANOVA之后，使用多变量分析来研究生化和发酵后参数之间的关系。使用两种互补的多变量技术。为了检验变量之间的相关性，使用非计量多维尺度分析(MDS；Primer v6[Clarke KR，Gorley RN(2006)PRIMER v6:User Manual/Tutorial:PRIMER-E Ltd，Plymouth，UK.190p.])，并且为了检验作用的可能阈值，使用分类和回归树(CART；TreesPlus software)。

对于MDS，在图上靠近在一起的样品具有相似的组成。因此，生成MDS双标图来研究在72小时温育时物种的生化和发酵后参数之间的相关性。使用各物种的平均值，在Bray-Curtis相似性矩阵中重装数据。

关于生化或发酵后参数与MDS空间内物种分布的相关性的强度和性质的信息在排序bi-plot中以向量表示。绘制基于高于0.7的Pearson相关系数(PCC)的与MDS空间最高度相关的参数(表1和2)。

由于在主要的一级组成变量和TGP、CH4与其他发酵后变量之间不存在总体关系(overarching relationship)(见结果，实施例3)，进行多变量CART来检测各物种的生化组成值对TGP、CH₄产量、乙酸盐和丙酸盐浓度的直接作用。在该实例中，将CART用于突出可能对发酵后参数具有微妙或相互的作用的独立变量。基于最小化方差和(error sum ofsquares)，使用10倍交叉确认对数据进行拟合。平方和等价于线性模型的最小平方。基于±1SE原则，选择最终的树模型，其提供关于划分的2个关键的独立变量。

实施例3：总气体和甲烷产量

与DCS相比，全部大型藻类物种的总气体产量(TGP)都较低(图1，ANOVA:72h，F20,63＝14.36，p<0.001)。淡水绿色大型藻类水绵属(Spirogyra)(图1a)和海洋绿色大型藻类德氏藻属(Derbesia)(图1b)在所有物种中具有最高的TGP，分别产生总计119.3mL.g^-1OM和119.7mL.g^-1OM，并且没有显著不同于DCS(表2，Tukey’s HSD 72h，p>0.05)。鞘藻属是显著不同于DCS的唯一的淡水绿色大型藻类(图1a，Tukey’s HSD 72h，p<0.05)，在72小时温育后减少TGP多至20.3％。扩展刚毛藻在海洋绿色大型藻类中具有最低的TGP，共产生79.7mL.g^-1OM(图1b)。在24小时，该作用最显著，此时，与DCS相比，TGP减少68.9％，并且在72小时TGP显著减少(图1b，Tukey’s HSD 72h，p<0.0001)。

网地藻属是最有效的褐色大型藻类物种，72小时后将TGP减少至59.4mL.g-1OM(图1c)，导致比DCS显著更低的TGP(53.2％)(图1c，Tukey’s HSD 72h，p<0.0001)。该作用在24小时时甚至更高(TGP＝比DCS低76.7％)。尽管其他褐色大型藻类不如网地藻属有效，但是整体上，它们减少>10％的TGP，其中，与DCS相比，扇藻属(Padina)、囊链藻属(Cystoseira)和囊藻属(Colpomenia)显著减少TGP(表2，Tukey’s HSD 72h，p<0.02)。所有大型藻类中最有效的是红藻海门冬属(图1d)，其具有最低的TGP，48.4mL.g-1OM。

尽管在前48小时海门冬属具有与网地藻属和扩展刚毛藻相似的趋势，但是其功效在整个温育期间保持，在72小时后产生比DCS少61.8％的TGP。

CH₄产量通常按照与TGP相同的模式，并且显著地，CH₄产量与TGP值直接且显著相关(图12)。DCS具有最高的CH₄输出，在72小时产生18.1mL.g^-1OM。72小时后，所有大型藻类处理平均低于DCS(图2，ANOVA:72h，F20,55＝10.24，p<0.0001)。以与TGP相似的方式，淡水绿色大型藻类水绵属(图2a)和海洋绿色大型藻类德氏藻属(图2b)在所有物种中具有最高的CH₄产量，并且与DCS分成一组(表2，Tukey’s HSD 72h，p>0.05)。海门冬属、网地藻属和扩展刚毛藻也对减少体外CH₄产量具有最明显的作用。扩展刚毛藻具有6.1mL.g-1OM的CH₄输出(表1)，并且产生比DCS少66.3％的CH4(图2b，Tukey’s HSD 72h，p<0.0001)。网地藻属产生1.4mL.g^-1OM并且是褐色大型藻类中最有效的，与DCS相比，使CH₄输出减少92％(图2c，表2，Tukey’s HSD 72h，p<0.001)，并且使TGP内的CH₄浓度，23.4mL.L-1，减少83.5％(表2)。

在所有大型藻类物种中，海门冬属具有最低的CH₄输出，在整个温育期间产生最多0.2mL.g-1OM(表2，Tukey’s HSD 72h，p<0.001)。与DCS相比，CH₄输出减少98.9％(图2d)，这与时间无关。显著地，海门冬属还具有最低的TGP内的CH₄浓度，72小时后，仅产生4.3mL.L^{- 1}CH⁴/升TGP，这使其不同于所有其他的物种(表2)。

其他发酵后参数

在物种间存在大型藻类对VFA产生的显著的作用(ANOVA:72h，F20,60＝2.01，p＝0.02)。水绵属产生36.59mmol.L^-1VFA，是所有物种中最高的总VFA产量，并且比DCS多31.6％。鞘藻属、C.Vagabunda、蕨藻(Caulerpa)、硬毛藻(Chaetomorpha)、石莼物种、马尾藻属(Sargassum)和沙菜属(Hypnea)也比对照DCS多产生2.3％-20.4％VFA(表2)。网地藻属和海门冬属具有最低的总VFA产量。总VFA的减少受乙酸盐(C2)产生的抑制(导致C2:C3比例降低)的影响。海门冬属具有最低的C2:C3比(0.92)，之后是网地藻属，几乎是该值的两倍(1.73)(表2)。

氨(NH₃)产量在物种间显著变化(ANOVA:72h，F20,63＝3.37，p<0.0001)。DCS具有最高的NH₃浓度，9.5mg N.L^-1，而海门冬属和沙菜属具有最低的NH₃浓度，6.7mg N.L^-1。尽管表观有机物降解性(OMd)在从网地藻属58％的最小值到DCS 64％的最大值之间变化，该差异不显著(p>0.05)。类似地，pH在从水绵属6.85的最小值到网地藻属7.13的最大值之间变化(表2)，该差异不显著，并且所有值都在使反刍动物的纤维消化最大化所需要的范围内。

生化和发酵后参数

72小时时生化参数与发酵后参数之间的MDS双标图显示鞘藻属和德氏藻属与DCS紧密群集，并且该群集与C.Vagabunda、C.Coelothrix、海门冬属和水绵属最相似(图3a)。与MDS空间具有最高相关性的生化参数是灰分、C、GE和H，并且这些是区分藻类的最重要的参数(表1)。位于MDS双标图右上角的物种(图3a)与元素C、N、H和GE、总脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)和C:16正相关(图3b)。大部分褐色大型藻类一起群集在MDS图的左上角(图3a)，其中扇藻属(Padina)、囊藻属(Colpomenia)和尾藻属具有>1.5g.kg^-1DM的最高的锶浓度(表1)。具有较高的TGP和CH₄产量的物种簇集在MDS双标图的左侧(实线群，图3a)。然而，具有低TGP和CH₄产量的物种散布在双标图上(虚线群，图3a)，这表明这些变量不与任何影响物种在MDS内的散布的生化变量强相关(分别地，r<0.19和0.42；图3a)。类似地，其余发酵后参数不与MDS双标图中的任何生化参数强相关(图4b，表2)。

产生多变量CART模型，以研究生化参数对主要发酵参数(TGP，CH₄产量，乙酸盐和丙酸盐浓度)的直接影响(图4)。解释数据中79.1％的差异性的最佳树模型表明锌是独立的变量，具有最高的相对重要性(100％)，将具有≥0.099g.kg-1DM的锌浓度的海门冬属和网地藻属与其余物种分开(表1)。这两个物种具有最低的TGP和CH₄产量和最高的丙酸盐比例。然而，海膜属(Halymenia)具有相似的锌浓度，0.099g.kg^-1DM，和在红色和褐色大型藻类的任何物种中最高的TGP和CH₄输出(表1)。这表明锌阈值与海门冬属和/或网地藻属特有的其他生化变量相互作用，其影响这些发酵参数。线性关系的缺少也得到锌与MDS空间的低相关性的证实(r＝0.21)。对于具有<0.099g.kg^-1DM的锌浓度的物种，多不饱和脂肪酸(PUFA)浓度的差异产生第二个区分，指示具有>12.64g.kg^-1DM的PUFA的物种具有比PUFA浓度低于该值的物种更高的CH₄产量。然而，PUFA具有锌的14.8％的相对重要性，这表明在该模型中PUFA的影响小。

实施例4：施用海门冬属减少体内甲烷产量。

将四头插瘘管的肉用公牛(印度肩峰牛，320-380Kg活重)用于体内喂饲试验，该试验在CSIRO的Lansdown研究站进行。在实验期开始之前，所有动物插瘘管并且在呼吸室中训练。开始时，肉用公牛以碎片草干草在群围栏(养牛场)中养殖四天。然后，将肉用公牛分成两组，并且分配为处理组、对照(仅有碎片草干草)和海门冬属补充。藻类剂量的选择(每天2％的OM摄入)基于从之前的研究甲烷减少潜力的体外研究得到的结果。将肉用公牛分配到研究站的个体围栏中，具有随意的碎片草干草和水供应。在早上喂饲之前，补充藻类的动物的剂量直接至瘤胃中，以确保处理海藻的完全摄取和动物之间处理摄取的一致性。肉用公牛具有14天的对不同饮食的适应期，之后进入开路呼吸室以测量甲烷产量48小时。还在处理21天和29天后测量动物的甲烷产量，以评价海门冬属在随时间减少动物中的甲烷产量的功效。31天后，藻类处理终止，并将动物重新分配到围场中。在藻类处理的第1、15和30天在瘤胃内插入海藻处理后4小时收集瘤胃样品，以评价VFA产量和乙酸盐与丙酸盐之比的变化。每天测量活重以及提供和拒绝的饲料，并且计算总干物质(DM)摄入和总有机物(OM)摄入以确定平均个体DM和OM摄入。结果显示在图14、15、16和17以及表9中。在所有检测的时间点，平均甲烷产量减少超过10％。在第15-18天，牛中的平均甲烷产量减少超过15％。

证明施用海门冬属物种减少动物体内的甲烷产量(图14)。图15显示对藻类处理响应最佳的肉用公牛的平均甲烷产量。重要的是，如图16所示，海门冬属在抑制体内甲烷产生的海门冬属剂量不减少体内降解的干物质。此外，如图17所示，海门冬属在抑制体内甲烷产生的海门冬属剂量不减少VFA的量。然而，该图还显示在处理15天和30天时，海门冬属在抑制总气体和甲烷产生的海门冬属剂量增加丙酸盐的量。

实施例5：施用海门冬属减少绵羊体内的甲烷产量。

方法

该试验在2014年9月-12月间在CSIRO Centre for Environment and LifeSciences Floreat WA进行。实验流程得到当地动物伦理委员会的核准(AEC1404)。

将24只美利奴杂交羯羊(merino cross wethers)[平均±sem活重(LW)；65.8±1.03kg]基于红色大型藻类海门冬属物种(紫杉状海门冬)的每日包含率(有机物，OM基础)分配到五个组中的一个[0(对照)、0.5、1.0、2.0、3.0％]。包含率(％OM摄入)分别等价于0、13。26、58和80g/d喂饲的藻类。

将绵羊保持在动物笼养条件下，并且在整个研究过程中以1.2X维持喂饲以谷草作为粗饲料组分[化学组成(g/kg DM)：灰分72；粗蛋白(CP)112；中性洗涤纤维(aNDFom)519；酸性洗涤纤维(ADFom)338，并且无钴、硒和瘤胃调节剂]的基于羽扇豆、燕麦、大麦、小麦的丸粒化商业货运配给料。在实验期开始之前，所有的绵羊给予Co弹丸。

从Capricorn海岸的Humpy Island吉宝湾(Keppel Bay)(23°13’S，150°54.8’E)附近的地点收集海底配子体期的野生紫杉状海门冬的生物质。开始将该生物质在阴凉处在通风架上风干，然后通过太阳能窑干燥(45-50℃)至恒重。然后，将干燥的生物质包装成大约1.0kg的块并送到CSIRO Floreat。获得每种藻类批次的次级样品用于元素和营养分析。在包含到每日口粮中之前，将得到的藻类生物质通过5mm筛研磨并重新包装。通过将碾碎的物质与200g粉碎的羽扇豆(羽扇豆饮食)混合，在开始的两周使绵羊逐渐适应藻类包含物。然后将藻类/羽扇豆混合物添加到丸粒口粮中，混合并且再喂养75天。

每天记录饲料摄入，并在试验过程中以14天的时间间隔测量活重(LW)。

进行三次个体动物甲烷产量(g/kg DM摄入)的测量，第一次在30天藻类包含后，然后在整个试验期间以21天的时间间隔测量。在使用如Li(2013)[PhD thesis；Eremophilaglabra reduced methane production in sheep,University of Western Australia]所述的开路呼吸室的24小时甲烷测量过程中，将饲料供给(丸粒/羽扇豆)成比例减少至1.0X维持，以确保一致性摄入。

在每次甲烷测量后，通过胃管收集多至50mL瘤胃液，用于确定挥发性脂肪酸(VFA)浓度。

统计分析

通过对每个反应变量拟合线性混合模型进行统计分析。这些模型能够解释实验的设计(动物分配到特定的组和室中)、数据的结构(重复的测量)和发生的遗漏值。在混合模型中的“固定作用”由处理效果(紫杉状海门冬的五个包含率)、时间效应(三个取样日期)、时间相互作用的处理和任意共变量组成。当分析活重时，包括初始的活重作为共变量。其还作为用于其他反应变量的潜在的共变量被检测，但是不显著，并且因此没有包括在终模型中。

分析产生关于所有处理和时间的组合的平均数(针对模型中的所有其他项进行调节)。计算P值，以检测时间、处理和它们的相互作用的整体效应。计算最小显著性差异(P＝0.05)，以比较平均数对。

结果

从Humpy Island吉宝湾(Keppel Bay)附近的地点收集的海底配子体期的野生紫杉状海门冬的生物质包含大约0.22mg/g DM卤化代谢物，主要是：57％二溴乙酸；26％三溴甲烷；和17％二溴氯甲烷。

当与可口的载体混合时，以较低海门冬属包含率(<2.0％)喂饲的绵羊以每日基础消耗所有的藻类。较高剂量的海门冬属通常导致约30g/d/只绵羊的研磨藻类物质的实际摄入。

如表10所示，在饲料中包含海门冬属没有减少绵羊体内降解的干物质，包括在抑制体内甲烷产量的海门冬属剂量。在75天时间，所有组的平均(±sem)每日DM摄入是1040±11.2g/d。与对照(0％海门冬属)动物相比，以0.5％的比率提供海门冬属的绵羊多消耗大约20g/d。与对照(0％海门冬属)动物相比，以3.0％的比率提供海门冬属的绵羊少消耗大约20g/d(表10)。尽管处理间存在数字差异，处理(藻类剂量)和处理x时间效应都不显著(P>0.05)。向美利奴杂交羯羊补充0-3％(OM基础)的增加水平的海门冬属没有影响平均每日DM摄入。这些结果表明在饲料中包含海门冬属保持降解的干物质的量。这些结果还表明在饲料中包含海门冬属对瘤胃发酵没有损害。

如表10所示，在饲料中包含海门冬属不影响绵羊的动物活重，包括在抑制体内甲烷产量的海门冬属剂量。在基于海门冬属物种的每日包含率分配到五组中的一个中之前，平均±sem活重(LW)是65.8±1.03kg。在试验结束时，平均±sem活重(LW)是71.4±0.99kg；如表10所示，处理(藻类剂量)和处理x时间效应都不显著(P>0.05)。向美利奴杂交羯羊补充0-3％(OM基础)增加水平的海门冬属没有影响动物活重。这些结果表明在饲料中包含海门冬属不影响动物活重。这些结果还表明在饲料中包含海门冬属对瘤胃发酵没有损害。

如表11所示，在饲料中包含海门冬属影响绵羊中的总VFA浓度和个体VFA(异丁酸盐除外)的摩尔比例。总VFA浓度和短链脂肪酸的摩尔比显示在表11中。对于总VFA浓度和个体VFA(异丁酸盐除外)的摩尔比例，整体处理效果是高度显著的(P<0.001)。与上述使用牛的工作(其中牛随意提供饲料)对比的是，在24小时的甲烷和VFA产量测量过程中，绵羊处于限制的饮食，以确保一致性的饲料摄入，并且在饲料中包含海门冬属，而不是直接施用到插瘘管的动物的瘤胃中(实施例4)。不希望收到理论限制，这些差异可能造成观察到的总VFA水平的差异。绵羊中的发酵不受损害，在对照与处理组之间活重没有显著差异，如表10所示。

与对照相比，在每日口粮中增加海门冬属的包含率导致乙酸盐(％)的减少和丙酸盐(％)的增加；与在每日口粮中包含海门冬属相关的值相比，对照处理(0％)的总VFA浓度和乙酸盐的摩尔比显著更高，当在口粮中包含海门冬属时，相比于与对照组相关的值，丙酸盐的平均摩尔比例显著更高，表明瘤胃中备用的氢阱(hydrogen sink)。重要的是，这些结果表明在饲料中包含海门冬属没有不利地影响丙酸盐的摩尔浓度。在饲料中包含海门冬属增加丙酸盐的量，包括在抑制体内甲烷产生的海门冬属剂量。

在饲料中包含海门冬属还显著地减少平均乙酸盐与丙酸盐之比；与海门冬属处理组相比，对照的平均乙酸盐:丙酸盐显著更高。在海门冬属处理组之间的乙酸盐:丙酸盐中没有显著差异。补充有1.0％或3.0％海门冬属(OM基础)的绵羊具有数字上较低的乙酸盐:丙酸盐，这对应于较高摩尔比例的丙酸盐(分别为31.5％和32％)。这些结果表明在饲料中包含海门冬属维持有效水平的需要的挥发性脂肪酸。

如图18所示，在饲料中包含海门冬属还显著减少绵羊的甲烷产量。在开始30天期间的在饮食中包含藻类后，然后在实验期间以21天的时间间隔，测量个体甲烷释放(g/kgDM摄入)(图18)。与对照相比，在饮食中包含海门冬属对甲烷产量具有显著作用(P<0.001)。对照(0％海门冬属)绵羊的平均甲烷产量为14.6g/kg DM摄入，与之相比的是分别以0.5、1.0、2.0和3.0％(OM基础)的包含率补充海门冬属的绵羊的12.8、6.8、5.7和2.9g/kg DM摄入。对照和以0.5％(OM基础)包含海门冬属在甲烷释放方面没有显著差异(P>0.05)。当与以2.0％(OM基础)包含海门冬属的甲烷释放相比时，以1.0％包含海门冬属的甲烷发生没有显著差异(P>0.05)。

饲料中1.0％、2.0％和3.0％(OM基础)的海门冬属包含率表明与对照相比在每个时间点甲烷释放的一致性减少，分别等价于53％、62％和80％。在绵羊中，不存在随时间的海门冬属包含对平均甲烷产量的显著作用，但是在以0.5％包含72天后，较之30天和51天，平均释放在数字上减少35％。

这些结果表明在施用海门冬属的绵羊中甲烷产量减少。

表1.与TGP和CH4产量的MDS和CART分析相关的生化参数。

除非另外指明，参数以g.kg^-1DM计算。对于TGP和CH₄产量，(n＝3–4)。r＝来自MDS分析的Pearson相关系数。C，碳；GE，总能量含量；H，氢，总FA，总脂肪酸；K，钾；N，氮；Sr，锶；PUFA，总多不饱和脂肪酸；C16:0，棕榈酸；Ca，钙；Na，钠；S，硫；Zn，锌；DCS，脱壳棉籽粗粉；SEM，标准误差平均数。

表2.与TGP和CH4产量的MDS和CART分析相关的发酵后参数。

对于TGP和CH4产量，同一列内不是由相同字母相连的(n＝3-4)物种显著不同。r＝来自MDS分析的Pearson相关系数；C2，乙酸盐；C3，丙酸盐；C4，丁酸盐；Iso C4，异丁酸盐；C5，戊酸盐；Iso C5，异戊酸盐；C2:C3，乙酸盐/丙酸盐比例；OMd，降解的有机物；DCS，脱壳棉籽粗粉；SEM，标准误差平均数。

表3.淡水和海洋大型藻类物种、脱壳棉籽粗粉(DCS)和碎片草干草的近似分析。

^A海洋和水产养殖研究机构单位(Marine and Aquaculture Research FacilityUnit)，大型藻类生物燃料和生物产品研究组(Macroalgal Biofuels and BioproductsResearch Group)，詹姆斯库克大学(James Cook University)(19.33°S；146.76°E)；^BGood Fortune Bay Fisheries，澳洲肺鱼养殖场(19.36°S；146.70°E)；^C Pacific ReefFisheries，Tiger养虾场(19.58°S，147.40°E)；^D耐莉湾(Nelly Bay)，位于磁岛(MagneticIsland)的潮间带岩礁滩(19.16°S；146.85°E)，^E罗斯湾(Rowes Bay)，位于Townsville的潮间带岩礁滩(19.23°S，146.79°E)。

除非另外指明，参数以g.kg^-1DM计算；FW:DW，鲜重:干重比例；DM，干物质；OM，有机物；CP，粗蛋白(绿色大型藻类、褐色大型藻类和红色大型藻类的氮因数分别为5.13、5.38和4.59[Bach SJ，Wang Y，McAllister TA(2008)Effect of feeding sun-dried seaweed(Ascophyllum nodosum)on fecal shedding of Escherichia coli O157:H7by feedlotcattle and on growth performance of lambs.Animal Feed Science and Technology142:17-32]，棉籽和碎片草干草的氮因数为6.25)；TL，总脂质；GE，总能量；(n＝2)。

表4:淡水和海洋大型藻类物种、脱壳棉籽粗粉(DCS)和碎片草干草的元素分析(±SD)。

参数以mg.kg^-1DM计算；(n＝2-5)；*对肉牛有毒或其不需要的元素；^肉牛需要的矿物质；粗体数字非常接近或高于肉牛的最大可耐受浓度(NRC，2000)；

表5:大型藻类物种、脱壳棉籽粗粉(DCS)和碎片草干草的FAME模式(±SD)。

参数以mg.g^-1DM计算；(n＝2)；总FA，总脂肪酸；PUFA，多不饱和脂肪酸；MUFA，单不饱和脂肪酸；SFA；饱和脂肪酸

表6.底物的近似分析(除非另外指明，以g/kg DM测量)。

表7.发酵后参数。

表8.体外温育72小时后平均短链挥发性脂肪酸产量。

表9.瘤胃内给药红藻的婆罗门牛(Brahman steers)的平均活重、干物质摄入(DMI)、剂量速率和甲烷产量(DMI基础)(±SD)。

表10.用具有和不具有不同包含水平的海门冬属补充剂的丸粒化饮食喂饲的绵羊在75天期间和每个实验期的平均饮食量(DM)摄入。

^#关于Asp.X时间作用固定，^*仅关于Asp作用固定

表11.用具有和不具有不同包含水平的海门冬属补充剂的丸粒化饮食喂饲的绵羊的平均瘤胃发酵参数。

¹所示的平均值是在整个实验期间以约21天时间间隔的三次取样事件的汇合的平均值；²仅是主要作用；³乙酸盐:丙酸盐。

Claims (20)

1.用于减少反刍动物中的总气体产量和/或甲烷产量的方法，所述方法包括向所述反刍动物施用有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种的步骤。

2.权利要求1的方法，其中所述红色海洋大型藻类物种是海门冬属(Asparagopsis)物种。

3.权利要求2的方法，其中所述红色海洋大型藻类物种是紫杉状海门冬(A.taxiformis)。

4.任一前述权利要求的方法，其中通过用所述有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种补充旨在用于所述反刍动物的食物来将所述有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种施用给所述动物。

5.任一前述权利要求的方法，其中保持有效水平的需要的挥发性脂肪酸。

6.权利要求5的方法，其中乙酸盐与丙酸盐之比下降。

7.任一前述权利要求的方法，其中保持降解的有机物和/或干物质的水平。

8.任一前述权利要求的方法，其中所述至少一种红色海洋大型藻类物种以施用给所述反刍动物的有机物的至少3、2、1、0.5、0.25、0.125或0.067％的剂量施用。

9.任一前述权利要求的方法，其中相对于由被施用了脱壳棉籽的反刍动物产生的甲烷的量，反刍动物中甲烷产量减少至少11％。

10.任一前述权利要求的方法，其中相对于由被施用了羽扇豆饮食的反刍动物产生的甲烷的量，反刍动物中甲烷的产量减少至少53％。

11.任一前述权利要求的方法，其中所述反刍动物选自反刍亚目(Ruminantia)和胼足亚目(Tylopoda)的成员。

12.权利要求11的方法，其中所述反刍动物是牛或绵羊。

13.权利要求12的方法，其中所述反刍动物是牛。

14.任一前述权利要求的方法，其中所述方法还包括向所述反刍动物施用有效量的至少一种选自由下述组成的组的大型藻类物种：刺海门冬(Asparagopsis armata)、紫杉状海门冬(Asparagopsis taxiformis)、网地藻属(Dictyota)物种(例如，Dictyotabartayresii)、鞘藻属(Oedogonium)物种、石莼(Ulva)物种和扩展刚毛藻(C.patentiramea)。

15.用于减少反刍动物中总气体产量和/或甲烷产量的饲料补充剂，所述补充剂包含有效量的至少一种红色海洋大型藻类物种。

16.权利要求15的补充剂，其中所述红色海洋大型藻类物种是海门冬属物种。

17.权利要求15或权利要求16的补充剂，其中所述海门冬属物种是紫杉状海门冬(A.taxiformis)。

18.权利要求15-17中任一项的补充剂，其中所述补充剂还包含有效量的至少一种选自由下述组成的组的大型藻类物种：刺海门冬、紫杉状海门冬、网地藻属物种(例如，Dictyotabartayresii)、鞘藻属物种、石莼物种和扩展刚毛藻。

19.用于反刍动物的饲料，其中所述饲料补充有根据权利要求15-18中任一项的饲料补充剂。

20.用于减少反刍动物的甲烷产量的方法，所述方法包括向所述动物施用根据权利要求15-18中任一项的饲料补充剂或根据权利要求19的饲料的步骤。