CN106222144B - 重组细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种重组细胞及其制备方法和用途，该重组细胞的基因组中整合有外源核酸分子，所述外源核酸分子编码荧光蛋白，并且所述外源核酸分子的表达与内源性GATA2的表达是同步的。该重组细胞可有效用于示踪内皮向造血转变(EHT)和精确界定生血内皮和非生血内皮。

Description

重组细胞及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种重组细胞、一种重组基因、重组细胞的制备方法及重组细胞的用途。
背景技术
从人的多潜能干细胞(pluripotent stem cells；PSCs)，包括胚胎干细胞(embryonic stem cells；ESCs)以及诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPSCs)，分化获得造血干/前体细胞(hematopoietic stem/progenitor cells；HS/PCs)，具有十分重要的应用前景。然而，目前在体外分化获得的HPC不具有造血重建能力。因此，有必要详细地解析HPC的生成机制，从而助力于在体外从PSCs到HPCs的分化研究。
在胚胎发育过程中，造血干细胞是从生血内皮(hemogenic endothelium；HE)转变过来的；而这个转变的过程被称为内皮向造血转变(endothelial to hematopoietictransition；EHT)。生血内皮可以进一步分化，变成HPC；而非生血内皮不具备这种能力。通过精确地解析HE及EHT有助于在体外优化HPC的分化方法。
通常认为,HE存在于CD34+CD31+/CD144+的内皮细胞中，但难以将生血内皮和非生血内皮区分开来；目前只有一例报道，认为CD73具有区分功能，且CD73+的细胞不具有造血功能。但是尚不能判断CD73-的细胞是否都是HE。
因此，如何精确地界定生血内皮(HE)还有待进一步研究。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
GATA2是能够直接调控EHT过程的转录因子，在小鼠血液发育和人胚胎干细胞造血分化过程中，GATA2都被证实参与到内皮向造血转变(EHT)的调控中，且GATA2的缺失会导致造血发生障碍。因此，发明人提出可以通过分析GATA2的表达情况来区分生血内皮和非生血内皮。
基于上述发现，在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞的基因组中整合有外源核酸分子，所述外源核酸分子编码荧光蛋白，并且所述外源核酸分子的表达与内源性GATA2的表达是同步的，因此，可以通过荧光分析，反映GATA2的表达。本发明实施例重组细胞在造血分化诱导下，具有分化为造血前体细胞(hematopoietic progenitor cells，HPCs)的潜能的生血内皮(hemogenic endothelium，HE)可实现GATA2的表达，由于本发明实施例的重组细胞可实现GATA2和荧光蛋白的同步表达，进而可通过荧光信号的分析，精确地将生血内皮和非生血内皮区分开来，从而可进一步分析GATA2+的内皮细胞特异表达的表面标记分子，筛选到可以精确地区分和界定生血内皮和非生血内皮的表面标记分子。本发明实施例的重组细胞可有效用于示踪内皮向造血转变(endothelial to hematopoietic transition，EHT))和界定生血内皮和非生血内皮。
根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述荧光蛋白是eGFP。eGFP是绿色荧光蛋白，通过分析eGFP的绿色荧光，可以有效反映GATA2的表达，进而将生血内皮和非生血内皮区进一步有效区分开来。
根据本发明的实施例，所述荧光蛋白与所述GATA2是以融合蛋白的形式表达的。荧光蛋白与GATA2以融合蛋白的形式表达，进而荧光蛋白与GATA2的表达完全同步进行，从而通过荧光分析，进一步有效反映GATA2的表达，从而进一步有效将生血内皮和非生血内皮区分开来。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白含有Flag标签序列，所述Flag标签序列与所述GATA2的C端相连。进而通过蛋白免疫印迹更加可靠地验证GATA2的表达与荧光蛋白表达的同步性，避免假阳性结果，进一步可靠、有效地通过荧光分析将生血内皮和非生血内皮区分开来。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白含有可切割连接肽，所述可切割连接肽的N端与所述flag标签蛋白相连，所述可切割连接肽的C端与所述荧光蛋白相连。可切割连接肽的引入使得荧光蛋白与GATA2-flag(连接有flag标签蛋白的GATA2)以融合蛋白的形式表达后，在连接肽的位置被切割，荧光蛋白和GATA2-flag分开,GATA2作为转录因子调控EHT过程的生物功能将不会受到影响。
根据本发明的实施例，所述外源核酸分子还编码药物抗性蛋白。药物抗性蛋白的表达，有利于通过药物筛选得到基因组中整合有本发明实施例的重组基因的细胞，进而提高本发明实施例的重组细胞用于示踪内皮向造血转变(EHT)和界定生血内皮和非生血内皮的有效性和可靠性。
根据本发明的实施例，所述重组细胞是重组人胚胎干细胞系细胞(embryonicstem cells，ESCs)。利用本发明实施例的重组人胚胎干细胞系细胞进行体外造血分化诱导，可形成造血前体细胞，在造血分化诱导过程中，可根据荧光信号分析，将生血内皮和非生血内皮区分开来，进而精确地区分和界定生血内皮和非生血内皮的表面标记分子，为进一步研究内皮向造血转变的过程提供了有力的工具。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种重组基因。根据本发明的实施例，所述基因包括同源左臂和同源右臂，所述同源左臂和同源右臂适于与宿主细胞的内源性GATA2基因发生同源重组；目的基因，所述目的基因包括荧光蛋白编码序列、筛选基因以及任选的标签蛋白编码序列，所述目的基因设置在所述同源左臂与所述同源右臂之间，其中，所述筛选基因的5’端和3’端分别具有loxP位点序列。根据本发明的实施例，将本发明实施例的重组基因导入受体细胞人胚胎干细胞系细胞，在造血分化诱导下，具有分化为造血前体细胞的生血内皮表达GATA2蛋白，由于GATA2蛋白和荧光蛋白的同步表达，因此可通过荧光分析，精确地将生血内皮和非生血内皮区别开来。
根据本发明的实施例，上述重组基因还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
所述目的基因包括：标签蛋白编码序列，所述标签蛋白编码序列设置在所述同源左臂与所述同源右臂之间；荧光蛋白编码序列，所述荧光蛋白编码序列设置在所述标签蛋白编码序列与所述同源右臂之间；筛选基因，所述筛选基因设置在所述荧光蛋白与所述同源右臂之间。根据本发明的实施例，将本发明实施例的重组基因导入受体细胞人胚胎干细胞系细胞，上述目的基因通过同源重组替换内源性GATA2基因的终止密码子区域，在造血分化诱导下，具有分化为造血前体细胞的生血内皮表达GATA2蛋白，荧光蛋白同步表达，因此可通过荧光分析，精确地将生血内皮和非生血内皮区别开来。
根据本发明的实施例，所述重组基因进一步包括可切割连接肽编码序列，所述可切割连接肽编码序列设置在所述标签蛋白编码序列与所述荧光蛋白编码序列之间，优选地所述可切割连接肽编码序列编码具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽。
VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：1)。
SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽为2A肽段。2A肽段是手足口病毒(一种小RNA病毒)肽段。其在受体细胞中表达后，可被特异性内切酶降解切割，进而实现荧光蛋白和GATA2-flag的特异性分离，进一步有效保证了GATA2作为转录因子调控EHT过程的生物功能。
根据本发明的实施例，所述重组基因具有SEQ ID NO：2示的核苷酸序列。
atggagttagagcgcagggtagttgggggaggtagctaattctcctctgtagctcttgcaatcccgttgattctaacatcaggcttctgagagttctttattccaaagttctgtgagtcttgacttatttcgttctcaaattctaaaattccatggttctgagatgctttgattcccatgtgagatttagccctccttgactgagctggtggggactgggggtggagcgagggtcagggaggggggtcgaggtgggcgtgggagtccagcctgctgacgctgccttgccctcccagtcggccgccagaagagccggcacctgttgtgcaaattgtcagacgacaaccaccaccttatggcgccgaaacgccaacggggaccctgtctgcaacgcctgtggcctctactacaagctgcacaatgtgagtgcgccccgccccggccaccccgcccctcccaggggacctctgcgctttgtgctgccaggcaagaggccccagccacaatatccagcttggcttggcttgggaagctgctgccctgagtgagcgccagaagggcttcccgtaagaggggtgccttgcctctgctcaggaggtggagctggctaggacagggtctcggactagggaagtggtttctctgcttaaaaagggtcagggtgggggggaggacttcagttggctgggcagtgctggcatgcggtgggcagagccagggagggtgtgggtcagccccatatgccagaacccgcccttcctggaatggtagccatctggtgatgggactatgaaggtcgggcacaattcctggcttcctgggaccctcagcttgacctgcctctggtccacgctgtggcggggtgggaggaatgttgctggaggaaggaactggccctctgaaaactggtggttgcctctaggttaacaggccactgaccatgaagaaggaagggatccagactcggaaccggaagatgtccaacaagtccaagaagagcaagaaaggggcggagtgcttcgaggagctgtcaaagtgcatgcaggagaagtcatcccccttcagtgcagctgccctggctggacacatggcacctgtgggccacctcccgcccttcagccactccggacacatcctgcccactccgacgcccatccacccctcctccagcctctccttcggccacccccacccgtccagcatggtgaccgccatgggcgattacaaggatgacgacgataagggtaccgtcaaacagaccctgaacttcgacctgctgaagctggctggggatgtggagagcaatcccggacctatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtgatctagatatcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgtcgagtaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacatcccccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttctactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggcggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgacctgcagcccaagctagcttaccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaggtacctctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtcgtataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgtcgacggaacagatggacgtcgaggaccgggcactcccgggatgggtggaccaaacccttagcagcccagcatttcccgaaggccgacaccactcctgccagcccggctcggcccagcaccccctctcctggagggcgcccagcagcctgccagcagttactgtgaatgttccccaccgctgagaggctgcctccgcacctgaccgctgcccaggtggggtttcctgcatggacagttgtttggagaacaacaaggacaactttatgtagagaaaaggaggggacgggacagacgaaggcaaccatttttagaaggaaaaaggattaggcaaaaataatttattttgctcttgtttctaacaaggacttggagacttggtggtctgagctgtcccaagtcctccggttcttcctcgggattggcgggtccacttgccagggctctgggggcagatttgtggggacctcagcctgcaccctcttctcctctggcttccctctctgaaatagccgaactccaggctgggctgagccaaagccagagtggccacggcccagggagggtgagctggtgcctgctttgacgggccaggccctggagggcagagacaatcacgggcggtcctgcacagattcccaggccagggctgggtcacaggaaggaaacaacattttcttgaaaggggaaacgtctcccagatcgctcccttggctttgaggccgaagctgctgtgactgtgtccccttactgagcgcaagccacagcctgtcttgtcaggtggaccctgtaaatacatcctttttctgctaacccttcaaccccctcgcctcctactctgagacaaaagaaaaaatattaaaaaaatgcataggcttaactcgctgatgagttaattgttttatttttaaactctttttgggtccagttgattgtacgtagccacaggagccctgctatgaaaggaataaaacctacacacaaggttggagctttgcaattctttttggaaaagagctgggatcccacagccctagtatgaaagctgggggtggggaggggcctttgctgcccttggtttctgggggctggttggcatttgctggcctggcagggggtgaaggcaggagttgggggcaggtcaggaccaggacccagggagaggctgtgtccctgctggggtctcaggtccagctttactgtggctgtctggatccttcccaaggtacagctgtatataaacgtgtcccgagcttagattctgtatgcggtgac(SEQ ID NO：2)。
SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列是重组基因GATA2同源左臂+flag+2A+eGFP+loxP+PGK-puro+loxP+GATA2同源右臂的全长核苷酸序列。将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列导入受体细胞人胚胎干细胞系细胞可与人体基因组发生同源重组，在造血分化诱导后可有效实现GATA2蛋白和荧光蛋白的同步表达，通过荧光信号分析，精确地将生血内皮和非生血内皮区别开来。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种载体。根据本发明的实施例，所述载体包含前面所述的重组基因。本发明实施例的载体可有效用于构建前面所述的重组基因，并将前面所述的重组基因运送进入受体细胞，进而有效实现GATA2蛋白和荧光蛋白在受体细胞中的同步表达，进而通过精确的荧光信号分析，精确地将生血内皮和非生血内皮区别开来。
根据本发明的实施例，上述载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述载体为pUC57载体，根据本发明的具体实施例，pUC57载体可有效用于构建前面所述的重组基因，并将前面所述的重组基因运送进入受体细胞，进而可进一步提高GATA2蛋白和荧光蛋白在受体细胞中的同步高效表达，进而更加精确地用于示踪内皮向造血转变和区分生血内皮和非生血内皮。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备前面所述重组细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(a)将前面所述的载体和编码TALEN核酸酶的质粒对转化宿主细胞，所述TALEN核酸酶是基于靶序列设计的，所述靶序列具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；(b)利用药物对步骤(a)中所获得的转化产物进行筛选，以便获得基因组中整合所述目的基因的细胞，所述药物是基于所述筛选基因确定的；(c)使所述基因组中整合所述目的基因的细胞中表达Cre重组酶，以便获得所述重组细胞。上述制备重组细胞的方法，可快速、高效地获得前面所述的重组细胞，如前所述，所获得的重组细胞可实现荧光蛋白和GATA2的同步表达，进而可通过精确的荧光信号分析，反映内源性GATA2的表达，进而精确地将生血内皮和非生血内皮区分开来。
根据本发明的实施例，上述制备前面所述重组细胞的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，使所述基因组中整合所述重组基因的细胞中表达Cre重组酶是通过向所述基因组中整合所述重组基因的细胞中引入mRNA进行的，所述mRNA编码Cre重组酶。根据本发明的实施例，将编码Cre重组酶的mRNA引入细胞，可实现Cre重组酶的特异性表达。根据本发明的具体实施例，Cre重组酶可特意性识别LoxP位点序列，进而可特异性在LoxP位点序列切割，进而将筛选基因在发挥完功能之后从重组基因上切除，进而进一步排除了重组细胞在示踪内皮向造血转变的过程中的可能干扰因素，进而进一步保证了所得到的重组细胞更加精确的示踪内皮向造血转变的过程。
根据本发明的实施例，所述宿主细胞是人胚胎干细胞系细胞。将本发明实施例的载体导入人胚胎干细胞系细胞，在造血分化诱导因子的作用下，具有分化为造血前体细胞潜能的生血内皮可实现GATA2的表达，由于荧光蛋白与GATA2的同步表达，进而可通过荧光信号的分析，精确地将生血内皮和非生血内皮的区分开来。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂包括前面所述的载体；编码TALEN核酸酶的质粒对，所述TALEN核酸酶是基于靶序列设计的，所述靶序列具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；以及mRNA，所述mRNA编码Cre重组酶。如前所述，本发明实施例的试剂盒可有效实现GATA2蛋白和荧光蛋白在受体细胞人胚胎干细胞系细胞中的同步表达，进而通过可视化的荧光分析，精确地将生血内皮和非生血内皮区别开来。
在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的重组细胞在示踪内皮向造血转变中的用途或区分生血内皮细胞和非生血内皮细胞中的用途。如前所述，本发明实施例的重组细胞在造血分化诱导下，具有分化为造血前体细胞的潜能的生血内皮可实现GATA2的表达，由于本发明实施例的重组细胞可实现GATA2和荧光蛋白的同步表达，因此，本发明实施例的重组细胞可用于精确示踪内皮向造血转变或精确地区分内皮细胞和非生血内皮细胞。
附图说明
图1是根据本发明实施例的H1-GATA2w/eGFP的人胚胎干细胞报告细胞(重组细胞)系的构建策略，
其中A显示了GATA2/eGPF基因敲入的流程图，
B显示了PCR鉴定序列整合情况结果图，
C显示了Southern杂交鉴定eGFP序列整合情况和脱靶情况结果图，
D显示了Southern杂交鉴定外源序列特异整合情况结果图，
E显示了在造血分化第10天，分选eGFP+和eGFP-的细胞结果图，
F显示了GATA2表达的RT-qPCR分析结果图，
G显示了利用BMP4处理H1-GATA2w/eGFP细胞5天，分选出eGFP+和eGFP-细胞的结果图，
H显示了利用BMP4处理H1-GATA2w/eGFP细胞5天，GATA2表达的RT-qPCR结果分析图，
I显示了利用BMP4处理H1-GATA2w/eGFP细胞5天，GATA2表达的蛋白免疫印迹的结果分析图；
图2是根据本发明实施例的GATA2/eGFP表达可以示踪HE及HPC的结果图，
其中，A显示了H1-GATA2w/eGFP和OP9共培养进行造血分化过程中不同时间点，CD34、CD31、CD43以及eGFP的表达情况结果图，
B显示了H1-GATA2w/eGFP和OP9共培养进行造血分化第8天，分选CD34+CD31+CD43-的内皮细胞中GATA2/eGPF+和GATA2/eGFP-的细胞及检测CD34+细胞中CD34+CD43+的生成比例的结果图，
C显示了CD34+CD31+CD43-的内皮细胞的细胞形态、Ac-LDL吞噬以及网格形成功能实验结果图，
D显示了H1-GATA2w/eGFP和OP9共培养进行造血分化第10天，CD34+CD43+细胞中GFP的表达情况结果图，
E显示了细胞的CFU形成能力的结果图；以及
图3显示了根据本发明实施例的生血内皮和非生血内皮的转录组比较分析结果图，
其中，A显示了GATA2/eGPF+和GATA2/eGFP-细胞RNA-Seq结果的MA图谱分析以及GATA2/eGPF+和GATA2/eGFP-细胞中高表达的基因GO分析结果图，
B显示了基因在GATA2/eGPF+细胞的表达结果图，
C显示了基因在GATA2/eGFP-细胞的表达结果图，
D显示了基因GATA2/eGFP-和GATA2/eGFP+细胞中差异表达的转录因子的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
重组细胞
在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞的基因组中整合有外源核酸分子，外源核酸分子编码荧光蛋白，并且所述外源核酸分子的表达与内源性GATA2的表达是同步的，因此，可以通过荧光分析，反映GATA2的表达。本发明实施例重组细胞在造血分化诱导下，具有分化为造血前体细胞(hematopoieticprogenitor cells，HPCs)的潜能的生血内皮(hemogenic endothelium，HE)可实现GATA2的表达，由于本发明实施例的重组细胞可实现GATA2和荧光蛋白的同步表达，进而可通过荧光信号的分析，精确地将生血内皮和非生血内皮区分开来，从而可进一步分析GATA2+的内皮细胞特异表达的表面标记分子，筛选到可以精确地区分和界定生血内皮和非生血内皮的表面标记分子。本发明实施例的重组细胞可有效用于示踪内皮向造血转变(endothelial tohematopoietic transition，EHT))和界定生血内皮和非生血内皮。
根据本发明的实施例，该荧光蛋白是可采用但不限于eGFP。eGFP是绿色荧光蛋白，通过分析eGFP的绿色荧光，可以有效反映GATA2的表达，进而将生血内皮和非生血内皮区进一步有效区分开来。
根据本发明的实施例，本发明实施例的荧光蛋白与GATA2是以融合蛋白的形式表达的。荧光蛋白与GATA2以融合蛋白的形式表达，进而荧光蛋白与GATA2的表达完全同步进行，从而通过荧光分析，进一步有效反映GATA2的表达，从而进一步有效将生血内皮和非生血内皮区分开来。
根据本发明的实施例，本发明实施例的融合蛋白含有Flag标签蛋白，所述Flag标签蛋白与所述GATA2的C端相连。从而，发明人在通过蛋白免疫印记技术验证显现荧光的细胞中GATA2的表达情况时，可使用信号更强的flag标签蛋白抗体进行孵育，从而可以更加高效和直观的观察GATA2的表达水平，由于有荧光的细胞是表达荧光蛋白的细胞，进而更加可靠地验证GATA2的表达与荧光蛋白表达的同步性，避免假阳性结果，进一步可靠、有效地通过荧光分析将生血内皮和非生血内皮区分开来。
根据本发明的实施例，本发明实施例的融合蛋白含有可切割连接肽，该可切割连接肽的N端与所述flag标签蛋白相连，所述可切割连接肽的C端与所述荧光蛋白相连。可切割连接肽的引入使得荧光蛋白与GATA2-flag(连接有flag标签蛋白的GATA2)以融合蛋白的形式表达后，在连接肽的位置被切割，荧光蛋白和GATA2-flag分开,GATA2作为转录因子调控EHT过程的生物功能将不会受到影响。
根据本发明的实施例，本发明实施例的外源核酸分子还编码药物抗性蛋白。药物抗性蛋白的表达，有利于通过药物筛选得到基因组中整合有本发明实施例的重组基因的细胞，进而提高本发明实施例的重组细胞用于示踪内皮向造血转变(EHT)和界定生血内皮和非生血内皮的有效性和可靠性。
根据本发明的实施例，所述重组细胞是重组人胚胎干细胞系细胞(embryonicstem cells，ESCs)。利用本发明实施例的重组人胚胎干细胞系细胞进行体外造血分化诱导，可形成造血前体细胞，在造血分化诱导过程中，可根据荧光信号分析，将生血内皮和非生血内皮区分开来，进而精确地区分和界定生血内皮和非生血内皮的表面标记分子，为进一步研究内皮向造血转变的过程提供了有力的工具。
重组基因
在本发明的第二方面，本发明提出了一种重组基因。根据本发明的实施例，该基因包括同源左臂和同源右臂，同源左臂和同源右臂适于与宿主细胞的内源性GATA2基因发生同源重组；目的基因，该目的基因包括荧光蛋白编码序列、筛选基因以及任选的标签蛋白编码序列，该目的基因设置在所述同源左臂与所述同源右臂之间，其中，上述筛选基因的5’端和3’端分别具有loxP位点序列。根据本发明的实施例，将本发明实施例的重组基因导入受体细胞人胚胎干细胞系细胞发生同源重组后，在TALEN核酸酶的介导下，目的基因成功整合入基因组中GATA2基因的终止密码子区域，在造血分化诱导下，具有分化为造血前体细胞的生血内皮表达GATA2蛋白，由于GATA2蛋白和荧光蛋白的同步表达，因此可通过荧光分析，精确地将生血内皮和非生血内皮区别开来。
根据本发明的实施例，本发明实施例的目的基因包括：标签蛋白编码序列，该标签蛋白编码序列设置在所述同源左臂与所述同源右臂之间；荧光蛋白编码序列，该荧光蛋白编码序列设置在所述标签蛋白编码序列与所述同源右臂之间；筛选基因，该筛选基因设置在所述荧光蛋白与所述同源右臂之间。根据本发明的实施例，将本发明实施例的重组基因导入受体细胞人胚胎干细胞系细胞，在TALEN核酸酶的介导下，上述目的基因通过同源重组整合到内源性GATA2基因的终止密码子区域，在造血分化诱导下，具有分化为造血前体细胞的生血内皮表达GATA2蛋白，荧光蛋白同步表达，因此可通过荧光分析，精确地将生血内皮和非生血内皮区别开来。
根据本发明的实施例，上述筛选基因的5’端和3’端分别具有loxP位点序列。根据本发明的具体实施例，筛选基因的5’端和3’端loxP位点序列的引入，可使筛选基因在发挥完筛选功能之后，被Cre重组酶特异性切除。从而可排除药物抗性蛋白对于本发明实施例的重组细胞作为示踪工具细胞的可能干扰因素，进一步保证了本发明实施例的重组细胞可精确示踪内皮向造血转变(EHT)和通过荧光信号分析精确界定生血内皮和非生血内皮。
根据本发明的实施例，所述重组基因进一步包括可切割连接肽编码序列，可切割连接肽编码序列设置在标签蛋白编码序列与荧光蛋白编码序列之间，优选地所述可切割连接肽编码序列编码具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽。SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽为2A肽段。2A肽段是手足口病毒(一种小RNA病毒)肽段。其在受体细胞中表达后，可被特异性内切酶降解切割，进而实现荧光蛋白和GATA2-flag的特异性分离，进一步有效保证了GATA2作为转录因子调控EHT过程的生物功能。
根据本发明的实施例，所述重组基因具有SEQ ID NO：2示的核苷酸序列。SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列是重组基因GATA2同源左臂+flag+2A+eGFP+loxP+PGK-puro+loxP+GATA2同源右臂的全长核苷酸序列。将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列导入受体细胞人胚胎干细胞系细胞可与人体基因组发生同源重组，在造血分化诱导后可有效实现GATA2蛋白和荧光蛋白的同步表达，通过荧光信号分析，精确地将生血内皮和非生血内皮区别开来。
载体
在本发明的第三方面，本发明提出了一种载体。根据本发明的实施例，所述载体包含前面所述的重组基因。本发明实施例的载体可有效用于构建前面所述的重组基因，并将前面所述的重组基因运送进入受体细胞，进而有效实现GATA2蛋白和荧光蛋白在受体细胞中的同步表达，进而通过精确的荧光信号分析，精确地将生血内皮和非生血内皮区别开来。
根据本发明的实施例，所述载体为pUC57载体，根据本发明的具体实施例，SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列可有效构建在pUC57质粒载体上，进而将载体线性化，以便将线性化的载体通过电转，导入受体细胞，在TALEN核酸酶的介导下，细胞通过自身的同源重组，可有效将目的基因整合进含有GATA2基因的终止密码子区域。pUC57载体可有效用于构建前面所述的重组基因，并将前面所述的重组基因运送进入受体细胞，进而可进一步提高GATA2蛋白和荧光蛋白在受体细胞中的同步高效表达，进而更加精确地用于示踪内皮向造血转变和区分生血内皮和非生血内皮。
制备重组细胞的方法
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备前面所述重组细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(a)将前面所述的载体和编码TALEN核酸酶的质粒对转化宿主细胞，所述TALEN核酸酶是基于靶序列设计的，所述靶序列具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
ccagcatggtgaccgccatgggctagggaacagatggacgtcgagg(SEQ ID NO：3)。
其中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中ccagcatggtgaccg是TALEN核酸酶识别的靶序列的左臂序列，agatggacgtcgagg是TALEN核酸酶识别的靶序列的右臂序列，ccatgggctagggaac是TALEN核酸酶识别的靶序列的切割位点序列；(b)利用药物对步骤(a)中所获得的转化产物进行筛选，以便获得基因组中整合所述目的基因的细胞，所述药物是基于所述筛选基因确定的；(c)使所述基因组中整合所述目的基因的细胞中表达Cre重组酶，以便获得所述重组细胞。上述制备重组细胞的方法中，TALEN核酸酶是基于靶序列设计的，其中的切割位点序列位于GATA2基因终止密码子区域，受体细胞在导入前面所述的载体和编码TALEN核酸酶的载体后，TALEN核酸酶可特异性切割GATA2基因终止密码子区域的核苷酸序列，受体细胞继而启动自身基因修复机制，本发明实施例的重组基因的同源左臂和同源右臂与被切割的GATA2基因发生同源配对，进而通过同源重组，所述目的基因有效整合进入宿主细胞，从而可快速、高效地获得前面所述的重组细胞，如前所述，所获得的重组细胞可实现荧光蛋白和GATA2的同步表达，进而可通过精确的荧光信号分析，反映内源性GATA2的表达，进而精确地将生血内皮和非生血内皮区分开来。
根据本发明的实施例，使所述基因组中整合所述重组基因的细胞中表达Cre重组酶是通过向所述基因组中整合所述重组基因的细胞中引入mRNA进行的，所述mRNA编码Cre重组酶。根据本发明的实施例，将编码Cre重组酶的mRNA引入细胞，可实现Cre重组酶的特异性表达。根据本发明的具体实施例，Cre重组酶可特意性识别LoxP位点序列，进而可特异性在LoxP位点序列切割，进而将筛选基因在发挥完功能之后从重组基因上切除，进而进一步排除了重组细胞在示踪内皮向造血转变的过程中的可能干扰因素，进而进一步保证了所得到的重组细胞更加精确的示踪内皮向造血转变的过程。
根据本发明的实施例，所述宿主细胞是人胚胎干细胞系细胞。将本发明实施例的载体导入人胚胎干细胞系细胞，在造血分化诱导因子的作用下，具有分化为造血前体细胞潜能的生血内皮可实现GATA2的表达，由于荧光蛋白与GATA2的同步表达，进而可通过荧光信号的分析，精确地将生血内皮和非生血内皮的区分开来。
试剂盒
在本发明的第五方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂包括前面所述的载体；编码TALEN核酸酶的载体，所述TALEN核酸酶是基于靶序列设计的，所述靶序列具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；以及mRNA，所述mRNA编码Cre重组酶。如前所述，本发明实施例的试剂盒可有效实现GATA2蛋白和荧光蛋白在受体细胞人胚胎干细胞系细胞中的同步表达，进而通过可视化的荧光分析，精确地将生血内皮和非生血内皮区别开来。
重组细胞的用途
在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的重组细胞在示踪内皮向造血转变中的用途或区分生血内皮细胞和非生血内皮细胞中的用途。如前所述，本发明实施例的重组细胞在造血分化诱导下，具有分化为造血前体细胞的潜能的生血内皮可实现GATA2的表达，由于本发明实施例的重组细胞可实现GATA2和荧光蛋白的同步表达，因此，本发明实施例的重组细胞可用于精确示踪内皮向造血转变或精确地区分内皮细胞和非生血内皮细胞。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1构建GATA2/eGFP基因敲入的人胚胎干细胞系
发明人采用TALEN介导的基因敲入的方法，在H1基因组的GATA2基因最后一个外显子后，将终止密码子替换成含有flag-2A序列的eGFP报告基因，具体的构建流程如图1A所示，构建流程如下所述：
(1)构建打靶载体：提取人胚胎干细胞系基因组DNA,以人胚胎干细胞系基因组DNA为模板，从GATA2终止密码子上游及下游，分别扩增出各约1kb的同源左臂和同源右臂，然后将同源左臂和同源右臂连接入pUC57载体，继而在左右同源臂中间插入flag-2A-eGFP-loxP-PGK-puro-loxP序列，即为打靶载体(target vector)；
(2)在打靶前，将打靶载体pUC57线性化；
(3)将线性化的打靶载体和编码TALEN核酸酶的载体，一起电转进入到人胚胎干细胞系细胞中。TALEN核酸酶会特异识别，并切割其特异识别位点，并导致DNA发生断裂，由于发明人是基于终止密码子附近靶序列设计的TALEN核酸酶，因此TALEN核酸酶特异性识别并切割GATA2的终止密码子附近区域。DNA发生断裂后，细胞启动同源重组进行DNA修复，在打靶载体存在的情况下，由于打靶载体含有同源臂，因此会和断裂的DNA发生同源重组，从而实现将flag-2A-eGFP-loxP-PGK-puro-loxP序列替换H1基因组中GATA2的终止密码子区域。
(4)利用抗性药物puromycin对成功整合有flag-2A-eGFP-loxP-PGK-puro-lox的细胞进行筛选，获得整合成功的细胞。
(5)利用电转将编码Cre重组酶的mRNA单链导入整合成功的受体细胞，利用表达的Cre重组酶切除loxP-PGK-puro-loxP序列，即获得GATA2-flag-2A-eGFP的报告细胞系。
图1A中的P1和P2用于PCR鉴定序列整合；Probe1和Probe2分别用于Southern杂交鉴定序列整合情况。重组后的GATA2在转录时，会同时转录出flag-2A和eGFP序列；同时在翻译时由于2A序列的存在，会导致GATA2-flag和eGFP蛋白发生分离。
继而，发明人通过PCR和Southern杂交实验证实，发明人构建的H1-GATA2w/eGFP的人胚胎干细胞报告细胞系是成功的，结果如图1B和图1C所示，其中，图1B显示了PCR鉴定flag-2A-eGFP-loxP-PGK-puro-loxP序列整合情况，以及loxP-PGK-Puro-loxP序列切除情况，图1C显示了Southern杂交鉴定eGFP序列整合情况和脱靶情况，图1D显示了Southern杂交鉴定外源序列是否特异整合到预设位点。
继而，发明人通过在造血分化过程的第10天，分选eGFP+和eGFP-的细胞，分析GATA2和eGFP的表达，发现eGFP+的细胞中高表达GATA2，而eGFP-的细胞中几乎不表达GATA2，结果如图1E和1F所示。其中，图1E显示了在造血分化因子TRA-1-85的诱导下，造血分化第10天，TRA-1-85+(在人源细胞中特异表达)细胞群中分选的eGFP+和eGFP-的细胞，图1F显示了GATA2表达的RT-qPCR检测结果。同时发明人通过分析BMP4(一种可诱导GATA2表达的细胞因子)处理后H1-GATA2w/eGFP的细胞中GATA2与eGFP表达情况，发现只有在GATA2表达时eGFP才能有效地表达，结果如图1G-1I所示，其中图1G表征利用BMP4处理H1-GATA2w/eGFP细胞5天，分选出eGFP+和eGFP-的细胞，图1H表示GATA2表达的RT-qPCR结果，图1I表示GATA2表达的蛋白免疫印迹结果。
实施例2 GATA2/eGFP表达可以示踪HE(生血内皮)及HPC(造血前体细胞)
发明人通过在造血分化过程中分析CD34、CD31、CD43以及eGFP的表达情况发现，eGFP的表达和CD34、CD31及CD43的时序表达相关，提示GATA2可能和内皮以及造血前体细胞的生成相关，结果如图2A所示，图2A显示H1-GATA2w/eGFP和OP9(一种小鼠骨髓间充质细胞，分泌诱导造血分化因子，以支持造血分化)共培养进行造血分化，在不同的时间点，CD34、CD31、CD43以及eGFP的表达相关。
在造血分化第8天时，发明人发现CD34+CD31+CD43-的细胞中，含有GATA2/eGPF+和GATA2/eGFP-的两群细胞，且只有GATA2/eGPF+的细胞可以有效地生成CD34+CD43+的HPC，结果如图2B所示，图2B显示了H1-GATA2w/eGFP和OP9共培养进行造血分化，第8天时，分选CD34+CD31+CD43-的内皮细胞中GATA2/eGPF+和GATA2/eGFP-的细胞，继而分别与OP9进行共培养，以检测CD34+细胞中CD34+CD43+的生成比例。
同时，发明人发现，GATA2/eGPF+和GATA2/eGFP-的两群细胞都具有典型的内皮特征，结果如图2C所示，图2C显示了CD34+CD31+CD43-的内皮细胞的细胞形态、Ac-LDL吞噬以及网格形成功能的实验结果。
最后，发明人发现，CD34+CD43+的HPC都是GATA2/eGPF+的细胞,且只有CD34+CD43+的细胞具有CFU形成能力，结果如图2D和2E所示，其中图2D显示了H1-GATA2w/eGFP和OP9共培养进行造血分化,第10天时，CD34+CD43+细胞中eGFP的表达情况,图2E显示了细胞CFU的形成能力。
其中，E代表红细胞集落；G代表粒细胞集落；M代表巨噬细胞集落；GM代表G和M的混合集落；Mix代表E、G和M的混合集落。
实施例3生血内皮和非生血内皮的转录组比较分析
基于实施例1和实施例3的发现，发明人采用RNA-Seq的方法分析CD34+CD31+CD43-的细胞中，GATA2/eGPF+的生血内皮(HE)和GATA2/eGFP-的非生血内皮，在转录组水平的差异。结果如图3A所示，图3A显示了GATA2/eGPF+和GATA2/eGFP-的细胞RNA-Seq结果的MA图谱分析；以及GATA2/eGPF+和GATA2/eGFP-的细胞中高表达的基因GO分析的结果，图3A结果显示GATA2/eGPF+的细胞中高表达的基因在血液发育相关的生物学过程中富集；而GATA2/eGPF-的细胞中高表达的基因在内皮及血管的发育的生物学过程中富集。
发明人进一步分析经典的血液及内皮相关基因，发现GATA2/eGPF+的细胞富集表达造血干/前体细胞、造血微环境及各系血液细胞相关的基因，结果如图3B所示，图3B显示了基因在GATA2/eGPF+中的表达情况；而GATA2/eGPF-的细胞富集表达血管内皮相关的基因，结果如图3C所示，图3C显示了基因在GATA2/eGFP-细胞中的表达情况。
进一步地，发明人通过分析GATA2/eGPF+和GATA2/eGFP-细胞中差异表达的转录因子，证实了在GATA2/eGPF+细胞中，表达有关键的造血调控转录因子，如RUNX1、GFI1和SPI1等，在GATA2/eGPF-细胞中，表达有SOX17等内皮调控因子。结果如图3D所示，图3D显示了GATA2/eGFP-(左)和GATA2/eGFP+(右)的细胞中差异表达的转录因子。
通过实施例3所得结果，可以得出：GATA2/eGPF+细胞和造血分化相关，GATA2/eGFP-细胞和内皮发育相关。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Figure IDA0001066891860000011
Figure IDA0001066891860000021
Figure IDA0001066891860000031

Claims (6)

1.重组细胞在示踪生血内皮细胞中的用途，其特征在于，所述重组细胞的基因组中整合有外源核酸分子，所述外源核酸分子编码荧光蛋白，并且所述外源核酸分子的表达与内源性GATA2的表达是同步的，所述外源核酸分子整合于内源性GATA2基因终止密码子区域，所述重组细胞为重组商业化人胚胎干细胞。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述荧光蛋白是eGFP。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述荧光蛋白与所述GATA2是以融合蛋白的形式表达的。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述融合蛋白含有Flag标签蛋白，所述Flag标签蛋白与所述GATA2的C端相连。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述融合蛋白含有可切割连接肽，所述可切割连接肽的N端与所述flag标签序列相连，所述可切割连接肽的C端与所述荧光蛋白相连。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述外源核酸分子还编码药物抗性蛋白。
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