CN106211757B - 使用维甲酸受体激动剂治疗代谢综合征相关病况的方法 - Google Patents

使用维甲酸受体激动剂治疗代谢综合征相关病况的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106211757B
CN106211757B CN201580012615.9A CN201580012615A CN106211757B CN 106211757 B CN106211757 B CN 106211757B CN 201580012615 A CN201580012615 A CN 201580012615A CN 106211757 B CN106211757 B CN 106211757B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rar
mice
agonist
diet
levels
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580012615.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106211757A (zh
Inventor
L.J.古达斯
Y.伯努瓦
R.佩雷斯
唐晓晗
S.特拉西诺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cornell University
Original Assignee
Cornell University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2014/012083 external-priority patent/WO2014113695A1/en
Application filed by Cornell University filed Critical Cornell University
Publication of CN106211757A publication Critical patent/CN106211757A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106211757B publication Critical patent/CN106211757B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/07—Retinol compounds, e.g. vitamin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/426—1,3-Thiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及使用一个或多个RAR，例如RAR激动剂以治疗(包括管理)或预防代谢综合征相关的病况的药物组合物和方法。这些病况包括，但不限于，与高脂肪的饮食和/或维生素A缺乏有关的胰、肝、肾、睾丸、肌肉或脂肪组织，以及其它器官的疾病，以及其它与甘油三酯，胆固醇和/或葡萄糖的异常水平相关的病况。

Description

使用维甲酸受体激动剂治疗代谢综合征相关病况的方法
政府资助
本发明是用属于国立卫生研究院（NCI）颁发的基金号RO1 DE010389和RO1CA043796，以及牙齿和颅面研究所颁发的基金号RO1 DE10389的政府支持完成。美国政府对于此发明拥有一定的权益。
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年1月17日递交的PCT专利申请(PCT/US/14/12083)的优先权，所述PCT/US/14/12083要求2013年1月18日递交的美国临时申请(序列号：61/754,438)的优先权。本申请还要求2014年5月9日递交的美国临时申请(序列号：61/990,808)的优先权。以上所述的全部申请以其整体并入本文中。
领域
本发明涉及某些代谢综合征相关病况的治疗或预防。例如，本发明涉及对于有需求的受试者的胆固醇，甘油三酯，和/或葡萄糖水平的控制，以及治疗或预防有需求的受试者的脂肪累积或维生素A缺乏所诱发的疾病或病况。
背景
代谢综合征是由多个代谢危险因素引起的，这些因素包括，但不仅限于，胰岛素的抗性、高血压，胆固醇水平异常以及增加的血液凝结风险。代谢综合征有关的病况的实例包括维生素缺乏、糖尿病、脂肪肝、高血压、胰岛素抗性、肥胖、异常胆固醇/甘油三酯水平、动脉和心脏病等。
仅次于吸烟，高脂肪饮食被称为第二位的致死习惯，仅在美国每年就导致三十万人死亡。高脂肪饮食引起很多健康问题，包括肥胖、中风、癌症、高血压、糖尿病、骨性关节炎、类风湿关节炎、多发性硬化症、心脏病以及诸如肝，肾等其它器官的疾病。
糖糖尿病是这样的一组疾病，其特征是身体生产和/或使用胰岛素的能力缺陷导致的高血糖水平。根据国际糖尿病联盟 (International Diabetes Federation)的报告，在2011年全球估计有三亿六千六百万病例，而且估计到2030年增至五亿两千两百万(1,2)。在美国有两千三百七十万确诊的病例，估计的健康费用为一千一百三十亿美元(2, 3)。在外围组织如脂肪和肌肉中胰岛素引导的葡萄糖的代谢受损，以及因β细胞数量和功能的丧失所致由胰腺β细胞进行的胰岛素产生不能满足代谢需求时导致二型糖尿病(4)。在一型糖尿病中，由生产胰岛素的β细胞的自身免疫破坏导致高血糖症(5). 每年在美国有超过三万确诊的一型糖尿病病例(6). 一型糖尿病患者可用胰岛素补剂控制其血糖水平(7)。然而，把干细胞分化为β细胞可能为一个更好的长期解决方案(8-10)。
二型糖尿病更为普遍。在二型糖尿病的早期身体不能正常使用胰岛素，该现象称为胰岛素抗性。响应于胰岛素抗性，胰岛会生产额外的胰岛素以作弥补。但随时间推移，因为生产胰岛素的β细胞将不能应对渐增的需求，这导致其坏损并且功能降低，所以不会有足够的胰岛素将血糖维持于正常水平。二型糖尿病越来越成为一种流行疾病，所述疾病因高频的并发症导致预期寿命的明显缩短。在工业化国家中，因为糖尿病相关的微血管的并发症，二型糖尿病目前是成人视力丧失，肾衰竭，和截肢的最常见的原因。另外，二型糖尿病与心血管疾病风险的两到五倍增加有关。长期患有二型糖尿病后，患者最终会口服治疗失败，并变得对胰岛素产生依赖，必需每天注射和每天多次测量葡萄糖。
第三种糖尿病，妊娠糖尿病，许多女性一般在怀孕第24周时发展出该病症。妊娠糖尿病的治疗的目的是把血糖水平维持在和未患有妊娠糖尿病的孕期女性相同的水平上。
一些糖尿患者可用健康饮食和锻炼管理他们的病况。一些患者需要处方药和/或胰岛素以维持他们的血糖水平。另外，糖尿病是一种发展性疾病。即使在开始时不需要药物，随着时间的推移，其还是可能需要的。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的标志为在没有肝炎和肝纤维化的情况下肝细胞内的脂肪累积(69, 70)。NAFLD是非酒精性脂肪肝炎(NASH)和肝细胞癌发展的主要风险因素(71)。在美国，由于不断上升的肥胖率，糖尿病和胰岛素抗性，NAFLD目前为最普遍的肝病形式，估计有五千五百万病例(69)。按照现在速率，到2030年在美国NAFLD将达到流行比例（epidemic proportion）；至今没有FDA批准的预防或治疗NAFLD的药物治疗(69)。
过去的十年中，动物和人的实验数据表明肝星状细胞(HSCs)是用于开发NAFLD谱系肝疾病的预防或治疗的药物治疗的重要细胞靶(73)。HSCs是存在于肝血窦(sinusoids)内的星状细胞，这细胞的主要功能是储藏全身的80-90%的维生素A (VA)库(74)。肝受损时HSCs丧失了它们的VA储藏能力，转分化为肌成纤维细胞(myofibroblasts), 并且通过分泌细胞外基质的成分，其包括1型胶原蛋白(colla1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)来配合（orchestrate）伤口愈合(72, 73)。在未经检查的NAFLD发病过程中，HSCs增殖，通过过度分泌colla1和α-SMA变得高度纤维化，这导致肝结疤和驱使进一步的肝纤维化和肝损伤的炎症级联(72,73)。
糖尿病是肾衰竭的最常见的原因，占新增病例的近44％。即使当糖尿病被控制时，糖尿病可引发慢性肾病和肾衰竭。在美国近了两千四百万人有糖尿病，将近18万人患有由糖尿病导致的肾衰竭。肾衰竭的患者经受透析，人工血液清洗过程，或接受来自供体的健康肾的移植。在2005年，肾衰竭患者的护理耗费了美国近三百二十亿美元。
甘油三酯由甘油和不同脂肪酸组成，它用来储存能量和向肌肉提供能量。甘油三酯是消化和分解食物脂肪的终端产物，但在身体中某些甘油三酯是从其它能源物制成，例如碳水化合物。通常只有少量存在于血液中。额外甘油三酯存储在身体的不同地方以备其随后所需。高血甘油三酯水平(例如在高甘油三酯血症中)与肥胖，糖尿病相关，并且具有更大的机会得心脏病。
胆固醇是一种固醇，是三类主要脂质之一，其被所有动物细胞制造和利用以构建它们的膜。它也是类固醇激素，胆汁酸和维生素D的前体。由于胆固醇不溶于水，它在蛋白颗粒(脂蛋白)内在血浆中转运。升高的血清胆固醇水平是动脉粥样硬化，心肌梗死和缺血性中风的主要风险因素。约有七仟一百万美国成年人的胆固醇水平显著升高，而这些成年人中只有三分之一的此病况得到控制((CDC) CfDCaP., 2011, MMWR Morb Mortal WklyRep. 60(4):109-14)。
鉴于健康风险，美国心脏协会建议，每个20岁以上的人至少每5年应该做一系列脂质检验来测量胆固醇和甘油三酯。健康的饮食和锻炼计划可以降低甘油三酯水平，改善胆固醇，降低心脏疾病和其它高甘油三酯血症或高胆固醇血症相关疾病的风险。它需要参加者花时间以减重和改善他们的血浆甘油三酯和胆固醇水平。通常即使在这些水平正常化后，在随访3-5年中绝大多数参与者恢复体重，并回到以前的高脂血症和高胆固醇血症的病况。在某些情况下，如家族性高胆固醇血症，需要药物甚至手术。
用于高甘油三酯血症的治疗药物包括阻断小肠里的胰甘油三酯脂酶的脂肪吸收抑制剂，提高基础代谢率的产热剂，以及抑制食欲的减食欲剂。用于高胆固醇血症的治疗药物包括胆固醇生物合成抑制剂(他汀类药物)，胆固醇吸收抑制剂，胆汁酸螯合剂，纤维酸（fibric acid）衍生物和高剂量烟酸(3-6克/天)。这些药物的每一种都有其治疗的局限性，并且一些药物的严重的副作用已有报道。当前降脂治疗不足以解决目前认为是心血管疾病的重要风险因素的高甘油三酯和胆固醇水平，而同时没有不想要的副作用。
尽管有多种药物正处于研究中，与高甘油三酯和胆固醇水平有关的健康风险实际上正在增加。最近由美国心脏病学院和美国心脏协会(ACC- AHA)发布了一个新的指南。这个新的指南会将美国正在接受胆固醇控制治疗或符合胆固醇控制治疗条件的成年人数量从四千三百二十万人( 37.5％)增加到五千六百万人( 48.6 ％)，其中此数量增加(1280万中的一千零四十万)的大多数会发生在不患有心血管疾病，但将仅基于他们10年的心血管事件风险而归类的成年人中(Pencina等, 2014, N. Engl. J. Med. 370 (15): 1422-1431)。另外，超过5000万美国人目前服用他汀类药物，但由于诸如肌肉疼痛和虚弱等副作用，高达20％的患有高胆固醇的成年人的不能使用(Mampuya等, 2013, Am Heart J., 166(3):597-603. doi: 10.1016/j.ahj.2013.06.004.)。
类视色素(retinoid)在结构上与维生素A (vitamin A, VA)相关并且用于治疗皮肤疾病和某些癌症(Tang等, 2011, Annu Rev Pathol., 6:345-64. doi: 10.1146/annurev-pathol-011110-130303; Baldwin等, 2013, J Drugs Dermatol., 12(6):638-42. PubMed PMID: 23839179)。先前，许多研究已经表明，类视色素给予人类和啮齿类动物的常见副作用是高甘油三酯血症和高胆固醇血症(Ellis等, 1982, Arch Dermatol., 118(8):559-62; Lyons等, 1982, Br J Dermatol.,107(5):591-5; Marsden J., 1986, BrJ Dermatol., 114(4):401-7; Barth等, 1993, Br J Dermatol., 129(6):704-7)。虽然在停止治疗之后，类视色素治疗的受试者的升高的血清脂质恢复到基线水平，这些观测结果提出了以下担心：类视色素(RA)治疗可增加心血管疾病的风险(Marsden J., 1986, BrJ Dermatol., 114(4):401-7)。Standeven等(1996, Fundamental and AppliedToxicology 33, 264-271) 报道了维甲酸受体在大鼠中介导类视色素诱导的高甘油三酯血症。
目前急需在上
具有对用于治疗（包括管理）上述代谢综合征相关病况的方法、医药以及药物组合物的未满足的医疗需求，尤其关于具有疾病减轻性质、快速作用并且同时显示良好的安全性性质的治疗。本发明提供了组合物和方法，以满足所述未满足的医疗需求。
概述
本发明公开了用于治疗(包管理)或预防代谢综合征相关的病况的药物组合物和方法。这样的病况包括，但不限于，胰腺、肝、肾、睾丸、肌肉或脂肪组织，以及其它器官与高脂肪饮食和/或维生素A缺乏相关的疾病，以及其它与甘油三酯，胆固醇和/或葡萄糖的异常水平相关的病况。
根据某些实施方案，本发明提供一种治疗或预防有需求的受试者的疾病的方法，所述方法包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂，其中所述所述疾病选自糖尿病、心血管疾病、肝疾病、肾疾病、肥胖症、高脂血症、高甘油三酯血症或高血糖症。
根据某些实施方案，本发明提供治疗或预防有需求的受试者的胰腺病的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
在某些实施方案中，胰腺疾病与肥胖症相关。
在某些实施方案中，胰腺疾病与高脂肪的饮食相关。
在某些实施方案中，胰腺疾病与在胰腺维生素A缺乏相关。
胰腺疾病可以是糖尿病，其可以是I型或II型糖尿病，或妊娠糖尿病。
根据某些实施方案，本发明提供增加有需求的受试者的RARβ水平的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
在某些实施方案中，RARβ水平在器官中增加。
该器官可以是胰腺、肝、肾、睾丸、肌肉或脂肪组织。
根据某些实施方案，本发明提供治疗或预防有需求的受试者的胰腺β细胞退化的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供维持或改善有需求的受试者的胰腺β细胞功能的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的胰岛素分泌的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供维持或改善有需求的受试者的胰腺胰岛素分泌的方法，其包括向该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的胰岛素敏感性的方法，其包括向该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供维持或改善有需求的受试者的胰岛素敏感性的方法，其包括向该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的胰岛素代谢的方法，其包括向该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供维持或改善有需求的受试者的胰岛素代谢的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的胰岛素抗性的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据本发明的一个实施方案，维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂可以同时控制胰岛素抗性和胰岛素分泌。如此，大型胰岛数量和/或胰腺胰岛素含量可以在有需求的受试者中降低。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的胰高血糖素水平的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供维持或改善有需求的受试者的胰高血糖素水平的方法，其包括对受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供治疗或预防有需求的受试者的脂肪沉积的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的体重的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的炎症的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供治疗或预防有需求的受试者的炎症反应的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供降低有需求的受试者的炎症介质水平的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的氧化应激的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供降低有需求的受试者的氧化应激的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
在某些实施方案中，炎症介质的产生降低了。
在某些实施方案中，炎症介质的分泌降低了。
根据某些实施方案，炎性介体可以是单核细胞趋化蛋白(MCP-1)或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
在某些实施方案中，脂肪沉积，炎症或氧化应激是在器官中。
该器官可以是胰腺、肝、肾、睾丸、肌肉或脂肪组织。
根据某些实施方案，本发明提供治疗或预防有需求的受试者的一种肝疾病的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
在某些实施方案中，肝疾病与肥胖症相关。
在某些实施方案中，肝疾病与高脂肪的饮食相关。
在某些实施方案中，肝疾病与维生素A缺乏相关。
在某些实施方案中，肝疾病是脂肪肝疾病(FLD，肝纤维化，或肝脂肪变性。
在某些实施方案中，肝疾病是非酒精性FLD(NAFLD)，酒精相关FLD或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
在某些实施方案中，肝疾病与肝中维生素A水平降低相关。
根据某些实施方案，本发明提供降低有需求的受试者的肝星状细胞(HSCs)的激活的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供降低有需求的受试者的肝活性氧物类(ROS)水平的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供降低有需求的受试者的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供增加有需求的受试者的肝中卵磷脂：视黄醇酰基转移酶(LRAT)水平的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供增加有需求的受试者的肝中RARβ水平的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供降低有需求的受试者的肝中SREBP1c水平的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
在某些实施方案中，该受试者患有肝疾病。
在某些实施方案中，该肝疾病是脂肪肝疾病(FLD)，肝纤维化，或肝脂肪变性。
在某些实施方案中，肝疾病是非酒精性FLD(NAFLD)、酒精相关FLD或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
在某些实施方案中，肝疾病与肝中维生素A水平降低相关。
在某些实施方案中，肝疾病与胰腺疾病相关。
根据某些实施方案，本发明提供治疗或预防有需求的受试者的肾疾病的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
在某些实施方案中，肾疾病与肥胖症相关。
在某些实施方案中，肾疾病与高脂肪的饮食相关。
在某些实施方案中，所述肾病是肾纤维化。
在某些实施方案中，肾病是慢性肾疾病。
在某些实施方案中，所述肾病是糖尿病肾病。
在某些实施方案中，肾病与胰腺疾病相关。
在某些实施方案中，肾病与肝疾病相关。
在某些实施方案中，肾疾病与肾中维生素A水平降低相关。
根据某些实施方案，本发明提供增加有需求的受试者的肾中的卵磷脂：视黄醇酰基转移酶(LRAT)水平的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供治疗或预防有需求的受试者的与器官特异性的维生素A缺乏有关的疾病的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
在某些实施方案中，器官特异性的维生素A缺乏与肥胖相关。
在某些实施方案中，器官特异性的维生素A缺乏与高脂肪的饮食有关。
在某些实施方案中，该受试者具有正常血清水平的维生素A或视黄基酯。
在某些实施方案中，该受试者的非血清样品中的维生素A或视黄基酯的水平异常。
该器官可以是胰腺、肝、肾、睾丸、肌肉或脂肪组织。
根据某些实施方案，本发明提供治疗或预防有需求的受试者的纤维化的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供减少有需求的受试者的脂肪累积的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
在某些实施方案中，脂肪累积或纤维化在器官中。
该器官可以是胰腺、肝、肾、睾丸、肌肉或脂肪组织。
根据某些实施方案，维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂每天施用三次。
在某些实施方案中，维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂以每天30-200毫克的量施用。
在某些实施方案中，维生素A或激动剂以每天50-150毫克的量施用。
在某些实施方案中，维生素A或激动剂以每天50-100毫克的量施用。
在某些实施方案中，维生素A或激动剂以每天100-150毫克的量施用。
在某些实施方案中，维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂是口服给予。
在某些实施方案中，维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂是静脉或皮下给予。
在某些实施方案中，维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂不增加受试者血清甘油三酯。
在某些实施方案中，维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂不增加受试者心血管疾病的风险。
在某些实施方案中，给予有疗效量的维生素A或RARβ激动剂。
在某些实施方案中，维生素A和RARβ激动剂两者都施用给受试者。
在某些实施方案中，维生素A和RARβ激动剂两者相伴施用。
在某些实施方案中，维生素A和RARβ激动剂两者依次施用。
根据某些实施方案，本发明提供一个药物组合物，包含维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂的或药学上可接受的盐，其量为约10毫克至约60毫克。
在某些实施方案中，维生素A或激动剂的量为15-约50毫克。
在某些实施方案中，维生素A或激动剂的量为15-约35毫克。
在某些实施方案中，维生素A或激动剂的量为约35-约50毫克。
在某些实施方案中，维生素A或激动剂的量为约30-约200毫克。
在某些实施方案中，维生素A或激动剂的量为约50-约150毫克。
在某些实施方案中，维生素A或激动剂的量为约50-约100毫克。
在某些实施方案中，维生素A或激动剂的量为约100-约150毫克。
根据某些实施方案，本发明提供药物组合物，包含维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂或药学上可接受的盐，其浓度为每100毫升约0.1毫克至约10毫克。
在某些实施方案中，浓度为每100毫升大约0.5毫克至大约5毫克。
在某些实施方案中，浓度为每100毫升大约1毫克至大约3毫克。
在某些实施方案中，其浓度为每100毫升大约1.5毫克至大约2.5毫克。
在某些实施方案中，激动剂是高度特异性的RARβ激动剂。
在某些实施方案中，激动剂是AC261066。
在某些实施方案中，激动剂是AC55649。
在某些实施方案中，药物组合物包含维生素A和RARβ的激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的甘油三酯水平的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的胆固醇水平的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供治疗或预防有需求的受试者的高甘油三酯血症或与高甘油三酯血症相关的病症的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供治疗或预防有需求的受试者的高胆固醇血症或与高胆固醇血症相关的病症的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供减少有需求的受试者的HMG-CoA还原酶(HMG-CoAreductase)的产生的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供减少有需求的受试者的临床上由药物引起的升高血液甘油三酯和/或胆固醇水平的显著副作用的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
在某些实施方案中，器官(例如，胰腺，肝，肾，睾丸，肌肉，或脂肪组织)中的甘油三酯和/或胆固醇水平被控制。
根据某些实施方案，本发明提供调节涉及脂生成和脂质分解代谢基因的表达的方法。
在某些实施方案中，在器官(例如胰腺，肝，肾，睾丸，肌肉，或脂肪组织)中这些基因的表达被调节。此调节可能导致增加脂质氧化或减少脂生成。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的葡萄糖水平的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的葡萄糖不耐受性的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
在某些实施方案中，在器官(例如，胰腺、肝、肾、睾丸、肌肉、或脂肪组织)中的葡萄糖水平被控制。
根据本发明的一个实施方案，有需求的受试者具有代谢综合征相关病况。
有需求的受试者可以具有选自糖尿病，心血管疾病，高血糖症，和高脂血症的病况。
根据某些实施方案，本发明提供控制有需求的受试者的胰岛素抗性的方法，其包括对该受试者施用维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，本发明的维甲酸受体β(RARβ)激动剂可减少受试者中甘油三酯或胆固醇的合成。
根据某些实施方案，维甲酸受体β(RARβ)激动剂可减少受试者中甘油三酯或胆固醇的转运。
根据某些实施方案，维甲酸受体β(RARβ)激动剂是高度特异性的RARβ激动剂。
根据某些实施方案，维甲酸受体β(RARβ)激动剂是高度特异性的RARβ2激动剂。
根据某些实施方案，维甲酸受体β(RARβ)激动剂是AC261066。
根据某些实施方案，维甲酸受体β(RARβ)激动剂是AC55649。
根据某些实施方案，与高甘油三酯血症/高胆固醇血症相关的病况是糖尿病。
根据某些实施方案，与高甘油三酯血症/高胆固醇血症相关的病况是心血管疾病。
根据某些实施方案，与高甘油三酯血症/高胆固醇血症相关的病况是高脂血症。
根据某些实施方案，维甲酸受体β(RARβ)激动剂每天施用三次。
根据某些实施方案，维甲酸受体β(RARβ)激动剂以每天约30-约200毫克的量给予。
根据某些实施方案，维甲酸受体β(RARβ)激动剂以每天约50-约150毫克的量给予。
根据某些实施方案，维甲酸受体β(RARβ)激动剂以每天约50-约100毫克的量给予。
根据某些实施方案，维甲酸受体β(RARβ)激动剂以每天约100-约150毫克的量给予。
根据某些实施方案，维甲酸受体β(RARβ)激动剂是口服给予。
根据某些实施方案，维甲酸受体β(RARβ)激动剂是静脉或皮下给予。
根据某些实施方案，该方法可以进一步包括施用第二种药物。
根据某些实施方案，此第二种药物是用于治疗高甘油三酯血症或与高甘油三酯血症有关的病况的药物。
根据某些实施方案，此第二种药物是用于治疗高胆固醇血症或与高胆固醇血症有关的病况的药物。
根据某些实施方案，此第二种药物是另一种维甲酸受体β(RARβ)激动剂。
根据某些实施方案，受试者的血液中的甘油三酯水平降低至低于150毫克/分升。
根据某些实施方案，受试者的血液中的甘油三酯水平降低至150至199毫克/分升。
根据某些实施方案，受试者的血液中的胆固醇水平降低至200毫克/分升或更小。
根据某些实施方案，受试者的血液中的胆固醇水平降低至201至240毫克/分升。
根据某些实施方案，受试者的HMG-CoA还原酶的mRNA水平被降低。
根据某些实施方案，对有需求的受试者给予激动剂后1至8天，维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂的疗效可以获得。
根据某些实施方案，本发明提供药物组合物，其包含维生素A或对RARβ2的结合亲和力至少达到AC261066的70%的维甲酸受体β(RARβ)激动剂，或药学上可接受的盐，其量为约10毫克至约60毫克。
根据某些实施方案，此药物组合物可以含有量为15-约50毫克的激动剂。
根据某些实施方案，此药物组合物可以含有量为15-约35毫克的激动剂。
根据某些实施方案，此药物组合物可以含有量为约35-约50毫克的激动剂。
根据某些实施方案，此药物组合物可以含有约30-约200毫克的激动剂。
根据某些实施方案，此药物组合物可以含有约50-约150毫克的激动剂。
根据某些实施方案，此药物组合物可以含有约50-约100毫克的激动剂。
根据某些实施方案，此药物组合物可以含有约100-约150毫克的激动剂。
根据某些实施方案，本发明提供一个药物组合物，包含维生素A或维甲酸受体β(RARβ)激动剂的或药学上可接受的盐，其浓度为每100毫升约0.1毫克至约10毫克。
根据某些实施方案，此药物组合物含有浓度为每100毫升约0.5毫克至约5毫克的激动剂。
根据某些实施方案，此药物组合物含有浓度为每100毫升约1毫克至约3毫克的激动剂。
根据某些实施方案，此药物组合物含有浓度为每100毫升约1.5毫克至约2.5毫克的激动剂。
根据某些实施方案，此药物组合物可进一步包含另一RARβ的激动剂。
根据某些实施方案，此药物组合物的维甲酸受体β(RARβ)激动剂是高度特异性的RARβ2激动剂。
根据某些实施方案，此药物组合物的维甲酸受体β(RARβ)激动剂是AC261066。
根据某些实施方案，此药物组合物的维甲酸受体β(RARβ)激动剂是AC55649。
附图简述
图1：胰腺内分泌分化方案及其在分子水平上的影响。(A)从D’Amour等(2006)改编的用于小鼠ES细胞的内分泌分化方案的示意图。简言之，用不同的生长因子处理胚胎干(ES)细胞以连续分化成定形内胚层(definitive endoderm，DE)，胰腺祖细胞(pancreaticprogenitor，PP)，内分泌祖细胞(endocrine progenitor，EP)，和内分泌细胞(endocrinecells, EC)。(B) WT小鼠ES细胞进行17天分化方案。各泳道表示在特定时间点的不同的条件。进行RT-PCR分析以监测胰腺分化标志物，如胰岛素-1(Ins1)、胰高血糖素(Gcg)、促生长素抑制素(Sst)、Neurogenin-3(Ngn3)、Pdx1和SOX17，以及干细胞标志物Nanog和Rex1。HPRT1扩增物被用作对照管家基因。来自C57BL/6野生型小鼠的胰腺提取物被用作阳性对照。
图2：缺失RARβ通过胰腺内分泌分化过程对Pdx1表达的影响。(A)证实RARβ在KO ES细胞中的抑制的RT-PCR分析。Cyp26a1,是RA应答型基因的分析显示在RARβ敲除的细胞中存在通过其它受体的RA信号活性。HPRT1被用作对照管家基因。(B)5，11，14，17天时，在存在或不存在用于分化方案的生长因子（用其处理或不用其处理）的情况下，对WT和RARβKO的Pdx1的间接免疫荧光染色(绿色)。用结合F-肌动蛋白的若丹明缀合的毒伞素(红色)复染色细胞并且细胞核用DAPI染色（蓝色）(标尺= 50µm)。
图3：WT和RARβ敲除(KO)的ES细胞中的胰腺分化标志物的表达。WT和RARβKO ES细胞中(A)早期, (B)中期，和(C)晚期的内分泌胰腺分化标志物的转录表达分析。在分化方案的5，11，14，17天时，在这两种细胞系中进行的(A)Nanog, Ngn3, (B)Pax6, Isl-1, and(C)Ins1, Gcg, and Iapp mRNA的 RT-PCR扩增。在每一种情况下，在这两种细胞系中监测RARβ转录表达，HPRT1被用作对照管家基因。每个标志物针对HPRT1水平标准化的相对量以直方图示出(n=3; *: p≤0.05; **: p≤0.0079; ***: p≤0.0003)。
图4：RARβ缺失对朗格汉斯岛功能和葡萄糖代谢的体外表征。(A) C57BL/6 WT和RARβ KO小鼠胰腺组织切片的C肽(绿色)和胰高血糖素(红色)的间接免疫荧光染色。胰岛相应区域用虚线圈出，细胞核用DAPI(蓝色)标记(标尺= 50微米)。对于每个组，胰岛的大小按关于高分辨率显微照片的表面积单位(cm2)进行定量，并且表示为直方图(n=6; **: p=0.031)。对WT和RARβ KO的小鼠胰腺蛋白提取物进行C-肽和胰高血糖素表达的蛋白免疫印迹分析。INS-1细胞被用作C肽表达的阳性对照，而将肌动蛋白的免疫检测用作上样对照。(B) 禁食15小时后，在WT和RARβ失效，敲除小鼠中血糖浓度（左）(n≥5; p=0.0011)。在2mg/ kg的葡萄糖腹腔内注射后测量WT (♦)和RARβKO (■)小鼠的血糖清除(右)。血糖相对水平在注射后0、15、30、45、60和120分钟时评估(n≥6; *: p=0.0137; **: p≤0.0064; ***:p＜0.0001)。
图5. 在所示治疗后小鼠胰腺的类视色素水平。正常饮食(CFD) (n=5); HFD (n=5). 相比于基于控制的，正常饲料的小鼠，喂食高脂肪饮食的小鼠/肥胖小鼠在胰腺中几乎没有类视色素。它们表现出器官特异性的维生素A缺乏。
图6. 将来自高脂肪饮食与对照饮食的小鼠的血清视黄醇与来自高脂肪与对照饮食的胰腺视黄醇和棕榈酸视黄酯水平比较。HF饮食小鼠血清视黄醇水平是类似的或稍微更高的，但胰腺视黄醇水平在HF饮食的小鼠中要低得多，可见即使血清维生素A水平正常，胰腺中的维生素仍然缺乏。
图7. 氧化应激的一个指标，4-羟基壬烯醛(4-HNE)在胰腺中的水平。胰腺样品固定，石蜡包埋，并切片。然后用抗4- HNE的抗体将组织切片染色(放大, 200×)。对每组两只小鼠的切片拍照和分析。箭头指示胰岛。AC261066减少高脂肪饮食小鼠胰岛中的氧化应激。
图8. AC261066稍微减少HF喂食的小鼠胰岛中的C肽(胰岛素分泌应激标志物)表达。来自喂食嚼对照饮食(Con)、高脂肪(HF )饮食、HF饮食加上AC261066达4个月的野生型(wt)雄性C57/BL6小鼠的代表性免疫染色的胰腺切片。Con饮食(n=5); HF饮食(n=5); HF饮食+AC261066 (n=5)。蓝色，细胞核; 红色，胰高血糖素;绿色，C肽。
图9. Chow对照饮食(Con)、高脂肪(HF)饮食，和HF饮食加上AC261066喂食的野生型(WT)雄性C57/BL6小鼠的胰腺中的INS2、RARB2、CYP26A1和LRAT的基因表达。Cyp26和LRAT，没有可检测的信号。HPRT1被用作上样对照。与对照饮食(Con)相比高脂肪饮食使得RARβ2 mRNA水平降低，这与胰腺中维生素A缺乏一致。AC261066在高脂肪饮食小鼠中增加了RARβ2 mRNA水平。
图10. LRAT-/-维生素A充足(VAS，正常对照饮食)小鼠、LRAT-/-维生素A缺乏(VAD)小鼠以及用AC261066处理8周的LRAT-/-维生素A缺乏(VAD)小鼠的胰腺组织中RARβ2的基因表达。AC261066增加维生素A缺乏的小鼠（LRAT-/-VAD饮食喂食达4周）的RARβ2 mRNA水平。
图11. AC261066减少肝脂肪变性。喂食Chow对照饮食(Con)、高脂肪(HF)饮食、HF饮食加上AC261066或HF饮食加上CD1530(RARγ激动剂)达4个月的野生型（wt）雄性C57/BL6小鼠的代表性的苏木精和伊红染色的肝切片。Con饮食（n=5)、HF饮食（n=5)、HF饮食+AC261066 (n=5)、HF饮食+CD1530 (RARγ激动剂) (n=4)。
图12. 喂食对照饮食、HF饮食的小鼠肝中的基因表达。Chow对照饮食(Con)、高脂肪(HF)饮食、HF饮食加上AC261066或HF饮食加上CD1530(RARγ激动剂)达4个月的野生型（wt）雄性C57/BL6小鼠的肝中的SREBP1c 和α-SMA的基因表达。Con饮食(n=5); HF饮食(n=5); HF饮食+AC261066 (n=5)或HF饮食+CD1530 (RARγ激动剂) (n=4)。
图13. AC261066减少肝星状细胞的激活。喂食Chow对照饮食(Con)、高脂肪(HF)饮食、HF饮食加上AC261066或HF饮食加上CD1530(RARγ激动剂)达4个月的野生型（wt）雄性C57/BL6小鼠的代表性的免疫荧光和油红O染色的肝切片。对照饮食(n=5); HF饮食(n=5);HF饮食+AC261066 (n=5)或HF饮食+CD1530 (RARγ激动剂)。
图14. 喂食LF和HF的小鼠肝中炎症介质的基因表达。喂食Chow对照饮食(Con)、高脂肪(HF)饮食、HF饮食加上AC261066或HF饮食加上CD1530(RARγ激动剂)达4个月的野生型（wt）雄性C57/BL6小鼠的肝中的MCP-1，TNF-α的基因表达。LF饮食（n=5); HF饮食( n=5);HF饮食+AC261066 (n=5)或HF饮食+CD1530 (RARγ激动剂) (n=4)。
图15. 在所述处理之后小鼠血清甘油三酯水平。Con Diet (n=2); HFD (n=3);HFDAC (n=5). Con, 对照饮食; HFD, 高脂肪饮食; HFD+AC, 高脂肪饮食+AC261066。AC261066剂量以使用剂量不提高甘油三酯的水平。
图16. 在所述处理之后小鼠肝中类视色素的水平。Con喂食饮食(CFD）（n=5); HFD（n=5); HFD+AC261066 ( n=5), HFD+CD1530(n=4)。高脂肪饮食引起肝维生素A缺乏的状况，而AC261066可部分逆转此状况。请注意，在左图CFD和HFD的y轴不同。在肝中HFD降低视黄基酯(如棕榈酸视黄酯)，维生素A的一种存储形式达90%(左图)。在肝中HFD也降低视黄醇（维生素A）的水平达90%而导致肝维生素A缺乏。
图17. 在肝中氧化应激的一个指标，4-羟基壬烯醛(4-HNE)。肝样品固定，石蜡包埋，并切片。然后用抗4-HNE的抗体将组织切片染色(放大200×)。对每组两只小鼠的切片拍照和分析。这些数据表明AC261066减少HF饮食喂食的小鼠肝中的氧化应激和ROS（活性氧物类）。氧化应激损伤组织。
图18. AC261066减低肾脂质积聚。喂食Chow对照饮食(Con)、高脂肪(HF)饮食、HF饮食加上AC261066或HF饮食加上CD1530(RARγ激动剂)达4个月的野生型（wt）雄性C57/BL6小鼠的代表性的苏木精和伊红染色的肾切片。Con 饮食（n=5); HF饮食(n=5); HF饮食+AC261066 (n=5)或HF饮食+CD1530 (RARγ激动剂) (n=4)。
图19. AC261066降低产生纤维的蛋白α-SMA的水平。喂食Chow对照饮食(Con)、高脂肪HF饮食或HF饮食加上AC261066达4个月的野生型（wt）雄性C57/BL6小鼠的代表性的免疫荧光和油红O染色的肾切片。Chow饮食 (n=5); HF饮食( n=5); HF饮食+AC261066 (n=5)或HF饮食+CD1530 (RARγ激动剂)。
图20. 在所述处理之后鼠肾中类视色素的水平。对照喂食饮食 (瘦, n=5); HFD(肥胖，n=5). 高脂肪饮食引起肾中的视黄醇和视黄基酯(棕榈酸视黄酯)大量减少，表明肾中维生素A缺乏。
图21. 喂食Control Normal Chow(13%脂肪)和HF的小鼠的肾中炎症介质和RARs的基因表达。喂食Chow对照饮食(Con)、高脂肪(HF)饮食、HF饮食加上AC261066的野生型（wt）雄性C57/BL6小鼠的肾基因表达。AC261066降低了高脂肪饮食喂食的小鼠的TNF-α，一种有效的炎性蛋白，的mRNA的水平。AC261066也恢复高脂肪饮食喂食的小鼠（用HFD喂食4个月）的功能性维生素A的信号传导标志物，RARβ和LRAT，的mRNA水平。HPRT1被用作上样对照。
图22. 氧化应激的一个指标，肾中4-羟基壬烯醛(4-HNE)在肾中的水平。将肾样品固定，石蜡包埋，并切片。然后用抗4-HNE的抗体将组织切片染色(放大200×)。对每组两只小鼠的切片拍照和分析。AC261066减少喂食HF饮食的小鼠肾中的氧化应激（ROS）。
图23. 在所述处理之后小鼠睾丸中类视色素的水平。对照喂食饮食(CFD)（n=5)或HFD(n=5)。高脂肪饮食引起睾丸中的部分维生素A缺乏。
图24. 喂食Chow对照饮食和HF的小鼠睾丸中维生素A的相关基因的基因表达。喂食Chow对照饮食(Con)、高脂肪(HF)饮食、HF饮食加上AC261066的野生（wt）雄性C57/BL6小鼠的睾丸中的基因表达。(每个数字是一只小鼠的数据，每组总共五只小鼠)。
图25. AC261066大大降低血清脂质和肝生成脂质的基因表达。A) 来自对照饮食(Con)（n=4)、高脂肪饮食 (HFD)（n=4)、高脂肪饮食(HFD)加上AC261066（HFD+AC61066[RARγ激动剂]）(n=4), 和高脂肪饮食(HFD)加上CD1530(RARγ激动剂)(n=4)的血清中甘油三酯和胆固醇。B) Con、HFD、HFD+AC261066和HFD+CD1530喂食的小鼠中脂质生成和糖质生成的介质的肝基因表达（mRNA）。
图26. 自Lund等, 2005, J. Med. Chem. 48:7517-7519的模型结构。
图27. 在高脂肪和遗传性糖尿病模型中，维甲酸受体β(RARβ)激动剂减少饮食诱导的体重的增加，葡萄糖耐受不良和胰岛素抗性。A) 喂食标准Chow(13% Kcal/脂肪)饮食(Wt Con, n=4), 高脂肪 (45%Kcal/脂肪)饮食(HFD, n=5)或Con和HFD与在其饮用水中的RARβ激动剂AC261066 (Wt Con + AC261, n=3, Wt HFD + AC261, n=4)或AC55649 (WtCon + AC556, n=3, Wt HFD + AC556, n=4)4个月后野生型C57/B16小鼠的体重。E)各组遗传上的肥胖和糖尿病型Ob/Ob和Db/Db小鼠的体重，所述小鼠喂食如A中所述的标准Chow饮食(n=3/组)、Chow饮食加上其饮用水中的AC261(n=3/组)达8周。B-D)和F-H)A和E中描述的wt和Ob/Ob和Db/Db小鼠的禁食葡萄糖，葡萄糖耐受检验(GTT),和葡萄糖曲线下的面积（AUC）。I-K)经历GTT的Ob/Ob和Db/Db小鼠的禁食胰岛素、胰岛素分泌和AUC胰岛素。L-M) E中描述的Ob/Ob和Db/Db小鼠的胰岛素耐受检验(ITT)。误差条代表±SEM。*=p <0.05, **=p< 0.01,***=p < 0.001,****=p < 0.0001。
图28. 维甲酸受体β(RARβ)激动剂AC261066减少肥胖和糖尿病的Ob/Ob和Db/Db模型中大胰岛的数量和胰腺胰岛素含量。A) 如分别在图1A和图1E中所述喂食实验饮食的Wt和Ob/Ob和Db/Db小鼠中用抗胰岛素的抗体免疫荧光染色(绿色)的胰岛代表性图像。放大400X，标尺=100 μm。B)如分别在图27A和图27中描述喂食含有或不含RARβ激动剂的实验饮食的Wt和Ob/Ob小鼠中极大型胰岛：(面积, Area > 50,000 µm2)、大型胰岛: (面积= 20,000-50,000 µm2)、中型胰岛：(面积=5,000-20,000 µm2)和小型胰岛：(面积=1,000-5000 µm2)的相对百分比。C)如分别在图27A和27E中所述喂食含有或不含RARβ激动剂的实验饮食的Wt Con和Ob/Ob小鼠中胰腺胰岛素含量(ng/µg的胰蛋白)。误差条代表±SEM。***=p <0.0001。
图29. 维甲酸受体β(RARβ)激动剂AC261066在饮食性和遗传性糖尿病模型中降低肝、胰腺、肾、肌肉和脂肪甘油三酯的积累。A) 如图1A和1E所述喂食含有或不含RARβ激动剂的实验饮食的Wt和Ob/Ob小鼠的苏木精和伊红染色的肝(a-e)、胰腺(f-j)、肾（k-o)和脂肪组织(p-t)的代表性图像。放大200X，标尺=50 μm。如在图27A和图27E中所述喂食含有或不含RARβ激动剂的实验饮食的Wt和Ob/Ob小鼠的B)肝脂肪变性和C-F)组织甘油三酯的百分比。G) 如在图27A和27E中所述喂食含有或不含RARβ激动剂的实验饮食的Wt和Ob/Ob小鼠的全部脂肪组织的重量。误差条代表±SEM。*=p <0.05, **=p < 0.01,****=p < 0.0001。
图30. 维甲酸受体β(RARβ)激动剂AC261066改变参与脂质生成和脂质线粒体氧化的基因的组织表达。如图27A和27E中所述喂食含有或不含RARβ激动剂的实验饮食的Wt和Ob/Ob小鼠中参与脂质代谢的基因的肝，胰腺和脂肪组织转录水平的实时PCR测量。A) 涉及脂质的线粒体β氧化的基因的肝mRNA相对水平。B)涉及脂质生成的基因的肝mRNA相对水平。C) 涉及脂质的线粒体β氧化的基因的胰腺mRNA相对水平。D) 涉及脂质代谢的基因的脂肪mRNA相对水平。mRNA相对水平倍数针对Hprt的转录产物水平归一化。误差条代表每个实验组的动物的±SEM(每组n=3-5)。
图31. 急性施用维甲酸受体β(RARβ)激动剂AC261066逆转高脂肪诱发的葡萄糖不耐受和胰岛素抗性。A-C) 喂食3个月的标准Chow（13% Kcal/脂肪）饮食(Wt Con，n=4)，高脂肪（45% Kcal/脂肪）饮食(HFD，n=4)，或喂食3个月HFD加上在其饮用水中以5.4 mg/Kg BW/天的剂量8天给予RARβ激动剂AC261066(n=4)的野生型C57/BL6雄性小鼠的体重、水和食物摄入。第8天检验小鼠的葡萄糖不耐受和胰岛素抗性。D和E) A中描述的小鼠的随机葡萄糖和葡萄糖耐受检验(GTT)。F) A中描述的小鼠的胰岛素耐受检验。
图32. 维甲酸受体β(RARβ)激动剂逆转高脂肪糖尿病模型的饮食诱发的体重上升和葡萄糖不耐受。A) 在喂食标准Chow（13% Kcal/脂肪）饮食(Wt Con，n=4)，高脂肪（45%Kcal/脂肪）饮食(HFD，n=5)，或HFD与在其饮用水中的RARβ激动剂AC261066(HFD+AC261，n=5)或AC55649(Wt HFD+AC556, n=4)3个月之后的野生型C57/BL6雄性小鼠的体重。B和C) A中描述的小鼠的葡萄糖耐受检验(GTT)和葡萄糖曲线下面积(AUC)。D) A中描述的随机检验（喂食）小鼠和禁食16小时的小鼠的血糖水平。误差条代表±SEM。*=p <0.05, **=p <0.01,***=p < 0.001。
图33. 在饮食性和遗传性肥胖和糖尿病模型中，维甲酸受体β(RARβ)激动剂AC261066改变涉及脂质代谢、炎症和纤维化的基因和蛋白质的肾表达。A) 喂食含有或不含RARβ激动剂AC261066的实验饮食的Wt和Ob/Ob和Db/Db小鼠的涉及脂生成以及脂质线粒体β氧化的基因的肾mRNA相对水平。B-D) 涉及炎症的基因(MCP-1和TNF-α)和纤维化的基因(α-SMA)的肾mRNA相对水平。E)TNF-α mRNA转录产物的半定量PCR。所有相对和半定量mRNA水平倍数针对Hprt的转录产物水平归一化。误差条代表±每个实验组的动物的SEM (n=3-5)。F,G) 在其水中给予AC261066达8周的Wt和Db/Db和Db/Db小鼠中用抗波形蛋白(绿色)和α-SMA的抗体双重免疫荧光染色的肾组织切片的代表图像。放大400X，标尺=100 μm。
具体描述
如以上所讨论的，仍存在提供治疗或预防某些代谢综合征相关的病况的备选疗法或管理的需求，所述备选疗法或管理包括控制有需求的受试者的胆固醇，甘油三酯和/或葡萄糖的水平，以及治疗或预防有需求的受试者的由脂肪累积或维生素A缺乏引起的疾病。因此，本发明涉及维生素A和维甲酸受体β(RARβ)激动剂在这方面的用途。
小鼠胚胎干(ES)细胞是来源于胚泡阶段(3.5天)的胚胎中内细胞群的多能细胞(10, 11)。当去除LIF，ES细胞自发分化成所有三个主要胚层：内胚层，中胚层和外胚层(10)。几个研究小组已证明使用广泛种类的生长/分化因子，包括维甲酸(RA)治疗可以实现ES细胞沿内分泌途径定向分化(12-17)。
尽管已知RA对细胞和组织的影响是通过维甲酸受体(RARα、RARβ和RARγ)和它们的同种型的激活而发生(6, 18)，但对指导定形内胚层分化成内分泌祖细胞的RA信号传导的下游发生的事件了解很少(4, 5, 19)。
然而，一系列的体内实验，包括在非洲爪蟾(Xenopus)中的一些实验，表明RA信号传导对内分泌胰腺发育至为关键(20)。例如，含有用于在体内消除维甲酸依耐性过程的主导型阴性RARα403突变的诱导性转基因的小鼠缺失背侧和腹侧胰腺，并在新生阶段死亡(21)。维生素A缺乏模型中，体内还观察到受损的胰岛发育和充血(22, 23)。此外，在体外胰岛新生期间所涉及的发育途径的研究揭示从内分泌分化的“粘附(adherent)”到“膨胀(expanded)”阶段RARβ转录物的3倍诱导(24)。另一项基于CRABP1和RBP4在胰腺分化中的作用的研究证实在早期分化中的RARβ的上调(11)。虽然以前的研究表明RARβ对于胰腺发育而言必不可少，但是关于其在成体中胰腺形成和胰岛维护的功能性作用鲜为人知(25, 26)。
通过其同源物受体，维甲酸受体(RAR)α,β,γ起作用的维生素A代谢物全反式-维甲酸(RA）通过调节涉及能量代谢和脂生成的基因而具有抗肥胖和抗脂生成的性质(75)。
使用动物模型，本发明的发明人发现维甲酸受体β(RARβ)在器官发育，维护和功能中起重要作用。发明人发现，维生素A和RARβ激动剂增加RARβ功能和信号传导;维生素A和这些RARβ激动剂还增加RARβ的水平。
发明人还发现，维生素A和RARβ激动剂可有效治疗和预防胰腺、肝、肾、睾丸、肌肉或脂肪组织和其它器官中与高脂肪饮食有关的疾病。此外，发明人发现，维生素A和所述(RARβ)激动剂可以在显示维生素A缺乏的器官中恢复维生素A的信号传导。
根据本发明的发明人的发现，维生素A和这些RARβ激动剂在多种器官，包括胰腺、肝、肾、睾丸、肌肉或脂肪组织中增加胰岛素信号传导，减少脂肪累积，防止炎症和减少氧化应激。它们还降低α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的水平，但增加卵磷脂：视黄醇酰基转移酶(LRAT)和RARβ的水平。当用于治疗肝疾病时，维生素A和这些RARβ激动剂降低肝星状细胞(HSCs)的激活和肝活性氧物类(ROS)的水平。
本发明的发明人发现维生素A或维甲酸受体β(RARβ)的激动剂不以临床上显著的水平升高血清甘油三酯或增加心血管风险。
如上所述，对人类和啮齿类动物给予类视黄醇激动剂的常见副作用包括升高甘油三酯和胆固醇二者水平。本申请的发明人采用精心设计的动物模型仔细研究不同类型的类视黄醇激动剂。与类视黄醇激动剂提高甘油三酯和胆固醇水平的报道相反，发明人发现，RARβ(例如RARβ2）激动剂可实际上降低动物中血清胆固醇和/或甘油三酯水平。
因此，本发明还提供了包含RARβ2激动剂的药物组合物，以及将所述激动剂用于控制高甘油三酯血症和/或高胆固醇血症，和与它们有关的病况的用途。
维甲酸受体(RAR)是一种被全反式维甲酸和9顺式维甲酸二者激活的核受体。有三种由RARα、RARβ、RARγ基因分别编码的维甲酸受体(RAR)：RARα、RARβ和RARγ。每个受体同种型有几个剪接变体：两个α，四个β，两个γ。
RAR与RXR形成杂二聚体，并当存在配体时，该RAR/RXR二聚体结合与共阻遏蛋白复合的被称为维甲酸响应元件(RAREs)的激素应答元件。激动剂配体结合RAR导致共阻遏蛋白的离解和共激活蛋白的募集，这进而促进下游靶基因转录成mRNA并最终合成蛋白质。
有三种分别由RARα、RARβ、RARγ基因编码的维甲酸受体(RAR), RARα、RARβ和RARγ。每个受体同种型有几个剪接变体：两个α，四个β，两个γ。
RARβ同种型由四种已知同种型RARβ1、RARβ2、RARβ3和RARβ4组成。四个同种型的配体结合结构域是相同的，而同种型之间的变化位于近侧N-末端，它包括配体非依赖性激活结构域(AF-1)（Lund等, 2005, J. Med. Chem. 48:7517-7519）。
已报道给定的RAR同种型的配体结合结构域，即AF-2，以启动子背景方式（in apromoter context manner）与AF-1结构域配合(Lund等, 2005, J. Med. Chem. 48:7517-7519; Nagpal等, 1992, Cell, 70, 1007-1019; Nagpal等, 1993, EMBO J. 12, 2349-2360.)。所述同种型之间AF-2结构域是保守的，而AF-1结构域不是(Lund等, 2005, J.Med. Chem. 48:7517-7519, Gelman等 1999, J. Biol. Chem., 274, 7681-7688;Benecke等 2000, EMBO Rep., 1, 151-157.)。依托RARβ(例如RARβ2)受体-配体的晶体结构，已设计和鉴定多种RARβ激动剂(Lund等, 2005, J. Med. Chem. 48:7517-7519;Germain等, 2004, EMBO reports, 5(9): 877-882)。
根据本发明(例如图26)的实施方案，AC261066和/或AC55649与AF-1和AF-2之间形成的复合物和协作可以用作有效的模型系统用于鉴定和选择另外的可用于控制高甘油三酯血症，高胆固醇血症和与它们相关的病况的化合物。
已知的RARβ激动剂包括但不限于：AC261066、AC55649、他扎罗汀、阿达帕林、9-顺式-维甲酸和TTNPB。AC261066和AC55649是高度特异性的RARβ激动剂。这个术语“高度特异性RARβ激动剂”还包括具有与AC261066或AC55649类似的结合亲和力的其它激动剂，例如至少大于等于50％，优选大于等于75％，更优选大于等于90％的AC261066或AC55649的RARβ结合能力。术语“高特异性RARβ2激动剂”包括具有与AC261066或AC55649类似的结合亲和力的激动剂，例如至少大于等于50％，优选大于等于75％，更优选大于等于90％的AC261066或AC55649的RARβ2结合能力。高度特异的RARβ(例如RARβ2)激动剂对RARβ(例如RARβ2)的亲和力优选大于6.00 pEC50，更优选大于6.50 pEC50，更优选大于7.00 pEC50，更优选大于7.50pEC50，更优选大于7.75 pEC50，甚至更优选大于8.00 pEC50。
RARβ激动剂包括先前描述的氟化烷氧基噻唑（alkoxythiazoles）(65)，例如:
Figure DEST_PATH_IMAGE001
,
4'-辛烷基-[1,1'-联苯基]-4-羧酸(65)、阿达帕林(67)、BMS-231973、BMS-228987、BMS-276393、BMS-209641(66)、BMS-189453{4-[(1E)-2-(5,6-二氢-5,5-二甲基-8-苯基-2-萘基)乙烯基]-苯甲酸} (68), CD2019 (6-[4-甲氧基-3-(1-甲基环己基)苯基]萘-2-羧酸)，在WO2008/064136和WO2007009083中描述的化合物和他扎罗汀（乙基6-[2-(4,4-二甲基-3,4-二氢-2H-1-苯并噻喃-6-基)乙炔基]吡啶-3-羧酸酯)。下面提供一些RARβ激动剂结构：
AC261066：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
AC55649：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
他扎罗汀：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
阿达帕林：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
9-顺式-维甲酸：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
TTNPB:
Figure DEST_PATH_IMAGE012
RARβ激动剂还包括在公布的PCT专利申请WO2008/064136、WO2007/009083和公布的美国专利申请US2009/0176837中公开的那些，其中每个都通过引用以其整体并入本文。高度特异性RARβ激动剂，例如AC261066和AC55649，是如在Lund等人，2005, J. Med.Chem., 48, 7517-7519中描述的针对人RARβ2受体的高度同种型选择性的激动剂，所述文献通过引用以其整体并入本文。
本发明的RARβ2受体激动剂可以选自以下的化合物或其酯(以下表1和2中显示的RARβ2亲合力活性)：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
Figure DEST_PATH_IMAGE014
Figure DEST_PATH_IMAGE015
可按WO2007/009083中描述进行功能性受体测定，受体选择和扩增。例如，技术(R-SAT)可以用于研究可用于本发明的已知的和新颖的RARβ激动剂的药理学性质。R- SAT在下列文件中已被公开，例如，美国专利号5,707,798，5,912,132和5,955,281，Piu等, 2006,Beta Arrestin 2 modulates the activity of Nuclear Receptor RAR beta 2 throughactivation of ERK2 kinase, Oncogen, 25(2):218-29和Burstein等, 2006,Integrative Functional Assays, Chemical Genomics and High ThroughputScreening: Harnessing signal transduction pathways to a common HTS readout,Curr Pharm Des, 12(14): 1717-29。所述文献通过引用以其整体（包括任何附图）并入本文。
WO2007/009083的表1和表2中提供了上述化合物的相应的RARβ2受体调节活性：
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE016
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE017
高度特异性RARβ激动剂，例如AC261066，可以防止肝脂肪变性和HSCs的激活，其以α-SMA的表达减少为标志。AC261066可以显著减少促炎介质的肿瘤坏死因子α(TNFα)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP -1)的基因肝表达。
本文中所使用的术语“受试者”是指动物，优选哺乳动物，最优选人。有需求的受试者可以是如本文所讨论的具有代谢综合征相关病况的患者。例如，受试者可以具有胰岛素抗性，高血压，维生素A缺乏，糖尿病，脂肪肝，高血压、胰岛素抗性、肥胖，异常的(例如升高的)胆固醇，甘油三酯和/或葡萄糖水平，动脉和心脏疾病。可通过测量血清或非血清样品，其包括来自动物，例如人的器官(例如，胰腺、肝、肾、睾丸、肌肉或脂肪组织)的样品，指示维生素A缺乏和异常的(例如升高的)胆固醇，甘油三酯和/或葡萄糖水平。
本文中所使用的术语“维生素A缺乏”指的是血清样品或非血清样品中，其包括来自动物，例如人的器官(例如，胰腺、肝、肾、睾丸、肌肉或脂肪组织)的样品，缺乏维生素A或相关的代谢物，包括反式视黄醇或其水平下降。根据本发明，患有维生素A缺乏的动物当使用血清样品测量时可具有正常的维生素A (或相关的代谢物)水平，但当使用该动物的非血清样品测量时仍显示出维生素A缺乏。
本文中所使用的术语“高血糖症”指的是高血糖的病况，在所述病况中过量的葡萄糖在血浆中循环。这通常是指葡萄糖水平高于11.1毫摩尔/升(200毫克/分升)，但直到甚至更高的值，如15〜20毫摩尔/升(〜250-300毫克/分升)症状可能才开始变得显著。具有在〜5.6和〜7毫摩尔/升(100-126毫克/分升)（美国糖尿病协会指南）之间的恒定范围内的受试者被认为是高血糖的，而高于7毫摩尔/升(126毫克/分升)通常被认为具有糖尿病。超过7毫摩尔/升(125毫克/分升)的慢性水平可产生器官损害。
本文中所使用的术语“高甘油三酯血症”是指这样病况，其中甘油三酯的水平关于通常相同种族背景，年龄和性别的对应的参考受试者的甘油三酯的正常平均水平而言升高。通常情况下，甘油三酯检验是测量血液中的甘油三酯的总量的血液检验。国家胆固醇教育计划(NCEP)设置的禁食甘油三酯水平的指南如下：正常甘油三酯是指低于150 毫克/分升（mg/dL）;临界高甘油三酯是150至199毫克/分升;而高甘油三酯是200〜499毫克/分升和非常高甘油三酯大于等于500毫克/分升(NCEP, Expert Panel on Detection,Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (AdultTreatment Panel III), 2002, Circulation, 106:3143-3421)。举一个非限制性实例，对于人来说，该术语高甘油三酯血症尤其指血液甘油三酯水平高于大约150毫克/分升，尤其高于大约180毫克/分升，或者治疗受试者的医生可认为一个较低的水平会为显著的。对于临界患者，通常建议（prescribe）非药物性措施，例如，生活方式的改变，其包括增加锻炼，低脂肪饮食和戒烟。当甘油三酯水平大于200毫克/升，通常给予药物治疗。
本文中所使用的术语“高胆固醇血症”是指这样的病况，其中胆固醇的水平关于通常相同种族背景、年龄和性别的对应的参考受试者的胆固醇的正常平均水平而言升高。通常，胆固醇检验是测量血液中的胆固醇的总量的血液检验。举一个非限制性的实例，对于人来说，该术语尤其指血液胆固醇水平高于大约200，尤其是高于大约240毫克/分升，或者治疗受试者的医生可认为一个较低的水平会为显著的。
通常，用于胆固醇的检验是在禁食9至12小时后完成，并且它提供了四种不同类型的脂质(脂质组)的结果。
总胆固醇
LDL (低密度脂蛋白)，“坏胆固醇”
HDL(高密度脂蛋白)，“好胆固醇”
甘油三酯，血液中的脂质的另一种形式
一些脂质组提供更详细的信息，这些信息关于血液中各种脂肪颗粒的存在和大小。
作为一个非限制性指南，对总胆固醇而言：小于等于200毫克/分升被认为是正常的。201至240毫克/分升是临界点。大于240毫克/分升被认为是高的。
作为一个非限制性指南，对于HDL（“好胆固醇”)而言，越多越好：大于等于60毫克/分升是好的 - 它可以防止心脏疾病。40和59毫克之间的HDL是可接受的。小于40毫克/分升是低的，其增加心脏疾病的风险。
作为一个非限制性指南，对于LDL（“坏胆固醇”)而言，越低越好：低于100毫克/分升的LDL是最佳的。100至129毫克/分升的LDL是接近最佳的。130至159毫克/分升为高临界。160至189毫克/分升之间的LDL胆固醇为高的。大于等于190毫克/分升的LDL被认为是非常高的。
本文中所使用的术语,“高甘油三酯血症相关的病况”是指可以由升高的血液甘油三酯的水平的症状引起的或者具有升高的血液甘油三酯的水平作为症状的病况，或者其中治疗受试者的医生会认为控制甘油三酯的水平对于治疗或预防该病况为有帮助的病况。与高甘油三酯血症相关的病况包括但不限于高脂血症、动脉粥样硬化、心血管疾病、中风、胰岛素抗性、糖尿病、糖尿病性肾病、特发性胰腺炎、代谢综合征、高血压、肥胖症、高糖饮食、酗酒、慢性肾衰竭、雷特氏综合征(Rett Syndrome)和糖原贮积病等。与高甘油三酯血症有关的病况还包括这样的情况，其中治疗一个不相关的疾病引起的甘油三酯水平升高作为药物副作用。
雷特氏综合征是一个与X染色体相关的综合征，其特征为一系列症状，包括语言的丧失、协调丧失和自闭症类表现。此综合征的一些影响似乎是由于胆固醇和甘油三酯代谢二者的失调导致，可以用他汀类药物进行治疗(Buchovecky等, Nature Genetics, 45(9):1013-20; Justice, MJ, Seminar at Sloan Kettering Institute, May 1, 2014)。
高甘油三酯血症可分类为原发性或获得性(Assmann等, 1991, Am. J.Cardiol., 68: 13A-16A; Mancini等, 1991, Am. J. Cardiol., 68: 17A-21A)。原发性高甘油三酯血症是遗传性疾病，其中包括乳糜微粒血症(Ⅰ型高脂蛋白血症)，V型高脂蛋白血症，Ⅲ型高脂蛋白血症(残余高脂血症（remnant hyperlipidemia）或家族性异常β脂蛋白血症)，家族性高甘油三酯血症，家族性混合型高脂血症，肝脂酶缺乏(Assmann等, 1991)。其症状的严重性部分取决于患者是纯合的还是杂合的。原发性高甘油三酯血症可能早在童年就发生。获得性高甘油三酯血症可以归因于许多因素，其包括代谢失调如二型糖尿病、糖尿病性肾病、代谢综合征、胰岛素抗性、前期糖尿病（pre-diabetes）、X综合征、肥胖症、高尿酸血症、Alström's综合征、雷特氏综合征和一型糖原贮积病(Kreisberg, 1998, Am. J.Cardiol., 82: 67U-73U; Schmidt等, 1996, Metabolism , 45: 699-706; Paisey等,2004, Clin. Endocrinol., 60: 228-231; Greene等, 1991, J Pediatr., 119: 398-403)。这些症状也可出现在童年。同样，激素紊乱可引起高甘油三酯血症。除了胰岛素，甘油三酯的水平可因甲状腺机能减退或多囊卵巢综合征所致而升高(Kvetny等, 2004, Clin.Endocrinol., 61: 232-238; Pirwany等, 2001, Clin. Endocrinol., 54: 447-453)。
后天性高甘油三酯血症可以因生活方式因素如饮食(高糖或碳水化合物的摄入)或饮酒所致(Coughlan等, 2000, Postgrad. Med., 108: 77-84)。慢性疾病状态如肾疾病(其包括肾病综合征和肾衰竭)或病变蛋白血症(paraproteinemia)也可引起甘油三酯升高(Attman等, 1997, Contrib. Nephrol., 120:1-10; Oda等, 1998, Nephrol. Dial.Transplant., 13:45-49; Matteucci等, 1996, Clin. Rheumatol., 15:20-24.)。这些疾病也可在童年出现。
本文中所使用的术语“高胆固醇血症相关的病况”是指可以由升高的血液胆固醇的水平的症状引起的或者具有升高的血液胆固醇的水平作为症状的病况，或者其中治疗受试者的医生会认为控制受试者的胆固醇的水平对于治疗或预防该病况是有帮助的病况。高胆固醇血症相关的病况包括，但不限于高脂血症、动脉粥样硬化、心血管疾病、心肌梗塞、中风、心绞痛、缺血性结肠炎、短暂性缺血发作(transient ischemic attacks)、雷特氏综合征和外周动脉疾病。与高胆固醇血症有关的病况还包括这样的情况，其中治疗不相关的疾病引起胆固醇水平升高作为药物副作用。
引起高胆固醇血症相关病况的原因可以是例如，糖尿病、糖尿病性肾病、肾病综合征、超重、痛风、酗酒、甲状腺机能减退、神经性厌食症、齐维氏综合征(Zieve's syndrome)、妊娠、雷特氏综合征和代谢综合征。也存在导致家族性高胆固醇血症的遗传形式的这种代谢扰乱。此外，高胆固醇血症直接促进很多形式的病况的病理学，所述病况例如动脉粥样硬化、心血管疾病、心肌梗塞、中风、心绞痛、缺血性结肠炎、短暂性缺血发作和/或外周动脉疾病。
某些类型的高胆固醇血症导致具体的身体发现（physical findings）。例如，家族性高胆固醇血症(IIa型高血脂蛋白症)可与睑黄瘤(眼睑周围的皮肤下面的黄色斑痕)、老年环(角膜周边部的白色或灰色变色)和肌腱黄色瘤(xanthomata) (微黄色富含胆固醇的物质的沉积)，尤其是手指的。III型高脂血症与可与手掌，膝盖和手肘的黄色瘤相关。
血清胆固醇水平长期升高可导致动脉粥样硬化。几十年中血清胆固醇慢性升高有助于在动脉中形成动脉粥样硬化斑块(atheromatous plaques)。这可导致受累动脉中渐进狭窄(变窄)或甚至完全闭塞(阻塞)。或者更小的斑块可能破裂并导致形成凝块，阻碍血液流动。冠状动脉突然闭塞导致心肌梗塞或心脏病发作。供应大脑的动脉的闭塞可导致中风。如果狭窄或闭塞的发展是渐进的，对组织和器官的供血慢慢减少，直到器官功能受损。此时，组织缺血(血液供应受限)可能表现为具体的症状。例如，脑临时缺血(通常被称为一个短暂性缺血发作)可能表现为暂时视觉丧失，头晕和平衡受损，失语(说话困难)，麻痹性痴呆(虚弱)和感觉异常(麻木或刺痛)，其通常在身体的一侧。心脏供血不足可表现为胸痛，眼睛的缺血可以表现为一只眼的短暂的视力丧失。腿部供血不足可表现为行走时小腿肚疼痛，而小肠供血不足可能表现为吃饭后腹痛。
高脂血症是指异常的血脂/脂蛋白水平的病况。与血管疾病相关的高脂血症的具体类型包括IIb型和IV型高脂血症。IV型高脂血症的特征在于血浆中极低密度脂蛋白的水平(VLDL)升高。IIb型高脂血症的特征在于VLDL和低密度脂蛋白(LDL)的水平升高。动脉粥样硬化和相关疾病，冠状动脉心脏疾病(CHD)，外周动脉疾病(PAD)和脑血管疾病的主要起因之一是血脂障碍。血脂障碍是每个脂质组分的失衡，所述脂质组分包括总胆固醇(TC)，高密度脂蛋白(HDL)胆固醇，低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和血清甘油三酯。因为它们与血管疾病相关联，已经开发了许多控制高脂血症的方法。这些方法包括生活方式的改变，例如饮食，运动之类，以及药物疗法。在管理血浆脂质分布型中发现用途的药物包括：胆汁酸结合树脂;烟酸;HMG-CoA还原酶抑制剂;纤维酸衍生物，例如吉非贝齐等。
脂蛋白由它们的密度分类为:极低密度脂蛋白(VLDL)，中间密度脂蛋白(IDL)，低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。所有脂蛋白都携带胆固醇，但除了HDL外的脂蛋白(称为非HDL胆固醇)，尤其是低密度脂蛋白胆固醇的水平升高，与动脉粥样硬化和冠状心脏疾病的风险增加相关。与此相反，HDL(“好”胆固醇)帮助从身体组织移除胆固醇并携带胆固醇回肝处理。高水平的HDL胆固醇可减少人患心脏疾病或中风的机会。LDL(“坏的”胆固醇)从肝将大部分脂肪和少量蛋白质携带到身体的其它部分。血液中一定水平的LDL是正常和健康的，因为LDL移动胆固醇到身体需要它的部分。但是它有时被称为“坏的胆固醇”，因为高水平可能增加人们发生心脏疾病的风险。VLDL含有非常少的蛋白质，它分配肝产生的甘油三酯。高VLDL胆固醇水平(例如如在高胆固醇血症中的)可能导致胆固醇在动脉中的积累并增加心脏病和中风的风险。增加血浆甘油三酯水平导致HDL水平降低。
血液中非HDL胆固醇和LDL (“坏”胆固醇)水平的升高可能因饮食，肥胖，继承(遗传性)疾病(如家族性高胆固醇血症中的LDL受体突变)，或其它疾病，如糖尿病和活性不够的甲状腺所致。
本申请的发明人已发现并鉴定了特定RARβ(例如RARβ2)激动剂显著降低循环中甘油三酯和胆固醇水平。因此，本发明确立了RARβ(例如RARβ2)激动剂在降低动物胆固醇和甘油三酯中的新的特异的功能。本发明提供了包括RARβ(例如RARβ2)激动剂的药物组合物，以及这些RARβ(例如RARβ2)激动剂用以控制有需求的受试者的甘油三酯和/或胆固醇的水平的用途。此外，发明人发现，特异RARβ(例如RARβ2)激动剂降低HMG-CoA还原酶和转录因子的产生，例如通过降低HMG-CoA还原酶的mRNA或蛋白水平。本发明中的特异RARβ(例如RARβ2)激动剂也降低了固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)的产生(例如在mRNA和蛋白水平)，所述SREBP-2是调节胆固醇代谢的多个基因的转录因子。SREBP-2增加HMG-CoA还原酶基因的mRNA。
HMG-CoA还原酶(3-羟基-3-甲基-戊二酰CoA还原酶或HMGCR)是导致胆固醇，类异戊二烯和相关分子的产生的甲羟戊酸途径的速度控制酶。HMG-CoA还原酶是他汀类药物的靶标，所述他汀类药物是一类开方用以限制胆固醇产生，由此治疗心脏病的药物。HMG-CoA还原酶的产生减少可以导致胆固醇生产量的减少。
本文中所使用的术语“控制”指的是降低，减少或维持受试者中分子，例如，甘油三酯、胆固醇或葡萄糖的水平。可在血清样品或非血清样品，包括来自器官(例如，胰腺、肝、肾、睾丸、肌肉或脂肪组织)的样品，中测量水平。该控制可以发生在甘油三酯或胆固醇的合成，运输或功能的阶段。如本文所用，术语“减少”和“降低”可以互换使用，是指分子，细胞或器官的水平，活性或功能的负向变化。它是指当与对照相比时，该特定的水平，活性或功能降低大约25％、大约50％、大约75％、大约90％、大约1倍、大约2倍、大约5倍、大约10倍、大约25倍、大约50倍，或大约100倍，或更低。
本文中所使用的术语“提高”，“增加”，“改善”和“增强”可互换使用，是指在分子，细胞或器官的水平，活性或功能的正向变化。它是指当与对照相比时，该特定的水平，活性或功能升高大约25％、大约50％、大约75％、大约90％、大约1倍、大约2倍、大约5倍、大约10倍、约大25倍、大约50倍，或大约100倍，或更高。
表述“治疗有效”或“治疗效果”指的是这样的益处，其包括但不限于，本文所讨论的病况的症状的治疗或改善。应理解的是，治疗有效剂量或提供疗效所需的剂的量会根据意图的应用(体外或者体内)，或被治疗的受试者和疾况(例如，待治疗的病况的严重度的性质，特定抑制剂，给予途径，个体患者的年龄、体重、一般健康和反应)而不同，这可以通过专业人员容易地确定。例如，维生素A或RARβ的激动剂的量就是有疗效的如果它足以实施治疗或缓解本文所讨论的病况的症状。
在本文中使用的术语“临床上显著的副作用”是指由任何药物或药物组合物的给予引起的治疗受试者的医生会认为严重的不期望的副作用的水平。这样的副作用可以是升高的甘油三酯和/或胆固醇水平(例如，在血清样品或非血清样品中，其包括来自器官(例如，胰腺、肝、肾、睾丸、肌肉或脂肪组织)的样品)中的水平，或增加心血管风险。在本文中使用的术语“临床上显著的水平”指的是由药物组合物(例如，维生素A或RARβ激动剂)的给予引起的治疗受试者的医生会认为严重的不期望的副作用例如心血管风险的水平。
在本文中使用的术语“大约”的意思是大致，在一个范围内，大概或周围。当术语“大约”与一个数值范围一起使用时，通过将边界延伸到高于和低于所列举的数值而修改该范围。一般情况下，术语“大约”在本文中用于修改数值高于或低于所述值达到30％的差距，优选20％，更优选10％。
在本文中术语“包含”是指“包括，但不限于”。
在本文中术语“药学上可接受的盐”是指这样的盐，其在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的利益/风险比相称。
如果维生素A或RARβ的激动剂的药学上可接受的盐用于药物组合物中，所述盐优选由无机或有机酸或碱衍生的。对于合适的盐的综述，参见例如，Berge等, J. Pharm.Sci. 66: 1-19 (1977) wad Remington: The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed., ed. A. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000。
在本文中使用的术语“药学上可接受的载体”是指与接受人受试者(优选哺乳动物，更优选人)相容的材料，并适合于递送活性剂到靶位点而不终结该剂的活性。与该载体有关的毒性或副作用，如果有的话，优选与该活性剂的所意图的用途的合理的风险/利益比相称。
术语“载体”在本文中可互换使用，按适合于所需的特定剂型。其包括任何和所有溶剂，稀释剂和其它液体载体，分散剂或悬浮助剂，表面活性剂，等渗剂，增稠剂或乳化剂，防腐剂，固体粘合剂，润滑剂等，。Remington: The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed. , ed. A. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体和用于该制备的已知技术。
本发明的药物组合物可以通过在本领域中公知的方法来制造，如常规的粒化、混合、溶解、包囊、冻干或乳化方法等。组合物可以以各种形式制造，所述形式包括颗粒、沉淀物或颗粒、粉末，其包括冷冻干燥的，旋转式干燥的或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、片剂、胶囊剂、糖浆、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂(elixirs)、悬浮液或溶液。按适合于所需的特定剂形，制剂可任选含有溶剂，稀释剂和其它液体载体，分散剂或悬浮助剂，表面活性剂，pH修饰剂，等渗剂，增稠剂或乳化剂，稳定剂和防腐剂，固体粘合剂，润滑剂等。
维生素A或RARβ激动剂可以通过本领域技术人员已知的任何方法给予。例如，RARβ的维生素A或激动剂可以口服或肠胃外给予。
本文所使用的术语“肠胃外”包括皮下，静脉内，肌内，关节内，滑膜内，胸骨内（intrasternal），鞘内，肝内，病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，组合物经口服，静脉内，或皮下给予。本发明的制剂可以设计为短效、速释或长效。再进一步，化合物可以局部而非全身性的方式给予，例如在肿瘤部位给予(例如通过注射)。
用于口服给予的液体剂型包括，但不限于,药学上可接受的乳剂，微乳，溶液，悬浮液，糖浆和酏剂。除了活性化合物外，液体剂型可以含有本领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂。除了惰性稀释剂，口服组合物还可以包括辅助物如润湿剂，乳化剂和悬浮剂，甜味剂，调味剂和芳香剂。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液可以根据已知的使用适合的分散或湿润剂和悬浮剂技术配制。无菌可注射制剂还可以是在肠胃外可接受的无毒的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如，在1,3-丁二醇中的溶液。在可以接受的载体和溶剂中，可以使用的是水，林格氏溶液(Ringer's solution)，U.S.P和等渗氯化钠溶液。此外，无菌，不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以采用任何温和的不挥发性油，其包括合成的单或二甘油脂。此外，脂肪酸类如油酸在注射剂的制备中使用。
用于口服给予的固体剂型包括胶囊，片剂，丸剂，粉剂和颗粒剂。在这类固体剂型中，活性化合物与至少一种药学上可接受的惰性的赋形剂或载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，b)粘合剂，例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，例如甘油，d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂如石蜡，f)吸收加速剂如季铵化合物，g)润湿剂，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油脂，h)吸收剂，例如高岭土和膨润土，和i)润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠以及它们的混合物。在胶囊，片剂和丸剂的情况下，该剂型也可以包含缓冲剂例如磷酸盐或碳酸盐。
相似类型的固体组合物也可以作为填充剂在软和硬填充明胶胶囊中使用，其使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。片剂，锭剂，胶囊，丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和壳如肠溶包衣和药物配制领域周知的其它包衣来制备。
由本发明中的维生素A和RARβ的激动剂与另外一种或多种其它治疗剂组合的组合治疗可用于，例如：1)提高本发明的方法和/或一种或多种其它治疗剂的治疗效果; 2)减少本发明的方法和/或一种或多种其它治疗剂的副作用；和/或3)降低本发明中的维生素A或RARβ的激动剂和／或一种或多种其它治疗剂的有效剂量。
本发明的RARβ(例如，RARβ2)激动剂可以与第二药物组合使用以治疗高甘油三酯血以及高甘油三酯血症相关的病况。第二药物的非限制性实例可以是可以是通过在肠内抑制胰甘油三酯脂酶的脂肪吸收抑制剂，如奥利司他；增加基础代谢率和“脂肪燃烧”的产热剂，如甲状腺激素和β3肾上腺素能激动剂; 或食欲抑制性药物(食物摄入抑制)，如血清素激动剂，拟交感神经剂和来普汀(leptin)。
本发明的RARβ(例如，RARβ2)激动剂可以和第二种药物组合使用用于治疗高胆固醇血症和高胆固醇血症相关的病况。第二药物的非限制性实例可以是HMG-CoA还原酶抑制剂(胆固醇的生物合成抑制剂;所谓的“他汀类药物”)；胆固醇吸收抑制剂(诸如依泽替米贝）;胆汁酸螯合剂(如消胆胺和考来替泊)；纤维酸衍生物(如非诺贝特和吉非贝齐)；高剂量(3-6克/天)的烟酸；载脂蛋白抑制剂(如单克隆抗体和反义寡核苷酸mipomersen和ISIS-APOCIII)；蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/可心（kexin）9型(PCSK9)抑制剂(例如单克隆抗体alirocumab，evolocumab，bococizumab，RG- 7652和LY3015014，以及反义寡核苷酸ALN-PCS02和SPC5001)。
本发明的一个具体的实施方案中，用于本发明的药物组合物可与身体锻炼，饮食和/或饮食治疗方法相结合来减少或防止高甘油三酯血症和/或高胆固醇血症。这类饮食或饮食治疗方法涉及例如减少热量摄入，脂肪摄入和/或胆固醇的摄入。此外，根据本发明，可建议在有需求的受试者中减少饱和饮食脂肪摄入以降低血中总胆固醇和LDL。如果需要的话，可进行其它的治疗，例如LDL血浆分离置换法或甚至手术(针对家族性高胆固醇血症的特别严重的亚型)。
可用于治疗疾病的许多药物都已报道在患者中提高甘油三酯或胆固醇水平。本发明所述RARβ(例如RARβ2)的激动剂可以与用于治疗不相关的病况的第二药物组合，其中所述第二药物通过在所述受试者中增加甘油三酯和/或胆固醇水平而引起临床显著水平的副作用。第二种药物包括，但不限于选自以下的一种：利尿剂(包括噻嗪类)和髓袢利尿剂;β受体阻滞剂(例如阿替洛尔，比索洛尔，美托洛尔，纳多洛尔，心得安);蛋白酶抑制剂;血管紧张素转化酶抑制剂;雌激素替代疗法;口服避孕药与第二代和第三代孕激素;雌激素受体调节剂; 泼尼松(prednisones)，胺碘酮(amiodarones);环孢素;孕激素; 蛋白同化类固醇(anabolic steroids);类视色素A;和阿昔曲丁;免疫抑制药物(如雷帕霉素);蛋白酶抑制剂(例如利托那韦);茚地那韦;和奈非那韦;和抗精神病药(例如氯氮平)。
维生素A或RARβ的激动剂合适剂量或量取决于许多因素，其包括待治疗病况的严重度的性质，给予途径，和个体受试者的年龄，体重，一般健康以及反应。在某些实施方案中，合适的剂量水平是实现这种治疗效果并也最小化与该给予相关的任何副作用的剂量水平。例如，维生素A或RARβ的激动剂可以以以下剂量给予：每天大约30毫克到大约200毫克，例如，每天大约50毫克到大约150毫克，每天大约50至约大100毫克，每天大约100毫克至大约150毫克。
维生素A或RARβ激动剂可以单一剂量或分开的剂量或多剂量给予。应当理解的是合适剂量的维生素A或RARβ激动剂可在白天或夜晚的任何时候，在进食或非进食时，给予。在一些实施方案中，在给予剂的治疗时期之后接着特定时间长度的非治疗期，在所述非治疗期期间不将治疗剂给予患者。在该非治疗期后可以接着一系列相同或不同频率的后续治疗和非治疗时期，其持续相同或不同时长。根据本发明，一个或多个这类基因（下面的表5中列出）的表达分布型可以为治疗效果指标，其可以用于指导在治疗方法和剂量。
维生素A或维甲酸受体β（RARβ）激动剂的疗效可以在将其给予有需要的受试者后约1天至约8天（例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天）相对快速地实现，它可需要更长时间。
本发明中使用的药物组合物可以在受试者的甘油三酯，胆固醇和/或葡萄糖水平已经升高时给予，但如果预计甘油三酯，胆固醇和/或葡萄糖水平在近期内上升，或如果任何可能的甘油三酯，胆固醇或葡萄糖水平的上升会损害患者的健康/或状态，也可以预先给予。在后一种情况下(损害效果)，本发明中使用的药物组合物尤其给予以预测和防止甘油三酯，胆固醇和/或葡萄糖水平的峰值。
在以下说明中参考组成该说明的一部分的附图进行，并且所述说明通过说明性具体实施方案而示出，这些实施方案可为经实践的。这些实施方案经详细描述以使本领域的技术人员能够实践本发明，并且应理解的是，可以利用其它实施方案并且其在不背离本发明的范围的情况下可以进行逻辑改变。因此，实施例的实施方案的以下描述不应以限制性意义理解，并且本发明的范围由所附的权利要求所限定。
实施例
本说明书进一步通过下列实施例来说明，这些实施例不应被解释为以任何方式具有限制性。所有引用的参考文献(其包括在整个本申请中引用的文献参考，出版的专利，公开的专利申请)的内容通过过引用明确地并入本文中。
实施例1 - 材料和方法
RARβ纯合ES细胞系的分离和细胞培养。小鼠J1野生型ES细胞如前所述培养(27)。C57BL/6RARβ杂合小鼠由Dr. Pierre Chambon (Strasbourg-Cedex, France)提供(26).纯合RARβ无效小鼠在让RARβ杂合小鼠交配后获得。如先前所述，收获的E3.5天的胚泡，并在ES细胞培养液中单独培养(28)。
胰腺内分泌分化方法。使用对由Borowiak (14)和D’Amour (15)发表的已建立的方案的稍微修改版本实施从小鼠ESCs分化表达激素的内分泌细胞。在分化之前，将ESCs以5×105接种在30毫米的明胶包被的培养皿中。过夜培养后，将细胞暴露于含有250 nM BIO-丙酮肟(EMD Bioscience, San Diego, CA)，+ 50ng/ml激活素A( R&D Systems,Minneapolis, MN),补充有1X的L-Glu和0.2％FBS(GIBCO)的高级的RPMI(GIBCO, GrandIsland, NY)1天，然后转入只含有激活素A的相同培养液中。然后培养细胞4天以诱导内胚层分化。为了诱导胰腺祖细胞，将细胞转移至补充有1X的L-Glu，1XPen/Strep和1X B27(Invitrogen, Grand Island, NY)，含有50ng/ml FGF10(R&D Systems)，7.5μM环王巴明(Calbiochem, San Diego, CA)的DMEM维持2天。在第7天，将细胞转移到含有FGF10，环王巴明和2μM全反式RA(Sigma, St. Louis, MO)，补充有1X的L-Glu，1XPen/Strep和1X B27(Invitrogen)的DMEM维持4天。在第11天时，细胞培养在存在补充有1X的L-Glu，1XPen/Strep和1X B27 的DMEM的情况下维持3天。在第14天时，加入CMRL(Invitrogen)培养基，并补充有1X的L-Glu、1XPen/Strep、1×B27，50ng/ml的IGF-1(R&D Systems)、50ng/ml的HGF(R&D Systems)和10mM烟酰胺(Sigma)维持3天。所有储备化合物制备于PBS或乙醇中。
RT-PCR分析。通过半定量RT-PCR分析J1野生型和RARβ KO ESCs中的内胚层(第5天)，胰祖细胞(第11天)，内分泌祖细胞(14天)和内分泌(第17天)分化的各种标志物。所用的特异性引物和扩增条件在表3中列出。引物设计尽可能在内含子附近。在表1中没有设计在内含子附近的引物以星号(*)示出。总RNA提取，半定量和定量PCR反应如先前所描述的(18)进行。在1.5 ％琼脂糖凝胶上解析扩增的PCR产物并通过溴化乙锭染色而可视化。将PCR条带测序以验证正确的扩增子。来自三个实验生物重复的半定量凝胶使用ImageJ软件(国立卫生研究院)进行定量。
表3：用于RT -PCR的引物序列
除了那些标有*，RT-PCR的所有引物设计在内含子附近。
Figure DEST_PATH_IMAGE018
间接免疫荧光。如前所述对细胞和组织切片进行免疫荧光测定法(29)。简言之，将用4％(w/v)的低聚甲醛固定分化的样品，和用0.3％(w/v)的Triton -X 100(Sigma)进行膜透化(只对于细胞)。用2％ BSA封闭非特异性位点30分钟，然后用以下一抗孵育：兔多克隆抗–PDX1 (Millipore, 06-1379, 1:1000)、兔抗C-肽(Cell Signaling, 4593, 1:500,Danvers, MA)和小鼠单克隆抗胰高血糖素(Abcam, ab10988, 1:200)。毒伞素-TRITC(Millipore, FAK100, 1:1000, Billerica, MA)用于染色肌动蛋白应力纤维网络(F-肌动蛋白)。用Vectashield®封固剂(Vector labs, Burlingame, CA)中含有的用于荧光的DAPI染色细胞核。使用NIS-Elements Advanced Research软件(Nikon)对C-肽阳性染色的细胞和胰岛表面积进行定量。
Western blot蛋白分析。如前所述(30, 31)，将蛋白从小鼠胰腺提出，通过SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜上。在含有5％脱脂乳和0.1％TWEEN 20（BioRad,Hercules,CA)的PBS中封闭膜。将兔抗C-肽(Cell Signaling, 4593, 1:500)、小鼠单克隆抗胰高血糖素(Abcam, ab10988, 1:500)和抗肌动蛋白(Millipore, MAB1501, 1:2000)等第一抗体与膜在4℃下孵育过夜。
小鼠血糖测定。按照先前所述(26)，将C57BL/6WT和RARβ KO小鼠用于该实验。简言之，小鼠禁食15小时过夜，然后腹膜内注射50％的葡萄糖溶液(2克/公斤体重)。用OneTouch Blood Glucose Monitoring System (LifeScan))(32)在0、15、30、60和120分钟从尾静脉测量血糖水平。
统计分析。所有实验都至少进行3次（n>3），其使用独立的三个生物实验。结果表示为平均值±SEM。所有的统计检验使用GraphPad InStat软件版本3.10进行。≤0.05的p值表示统计学显著。
实施例2 - WT小鼠ES细胞的胰腺分化和胰腺标志物评估。
选择这个内分泌分化的方案，因为它包括了在第7天时的RA处理，并且也使用人ES细胞显示晚期内分泌标志物的表达。D’Amour 等(2006)的胰分化方案经稍微修改而用于通过使用特定生长因子在培养基中生成胰腺内分泌细胞(图 1A)。第一个修改是用BIO-丙酮肟(BIO)替换Wnt3a。有报道说Wnt3a对中内胚层的特化十分重要，BIO-丙酮肟是GSK-3β的选择性抑制剂，其在细胞分化期间间接地充当Wnt3a的激动剂(33, 34)。第二，在分化的最后阶段包含入烟酰胺，因为大量已发表的方案中包含了此试剂，原因是它在胰腺分化中的功效的强有力证据(35, 36)。
为了表征该分化方案对WT ES细胞的胰腺内分泌特化的作用，在整个步骤期间的不同时间点收获细胞提取物(图1B)。针对不同的实验条件下通过RT-PCR评估各种分化标志物的mRNA水平。与未处理和RA处理的ES细胞(图1B，泳道1到4)相比，培养系统中撤走LIF与添加BIO和激活素A的组合引起ES细胞标志物Nanog和Rex1的水平的急剧减少(图1B，泳道6)。在整个分化方案的后续阶段(图1B，泳道7-12)中观察到这种现象。在第14天时观察到α-细胞的功能标志物，胰高血糖素(37)的稳健的表达(图1B，泳道8)，而促生长素抑制素，由δ型细胞分泌的一种激素(37)，早在第5天就可检测到(图1B，泳道6)。该分化方案的第11天检测到胰岛素-1(β细胞标志物)(37)，但其表达水平随着在内分泌细胞分化阶段中HGF，IGF1的使用，或是这两个因子一同使用而浮动(图1B，泳道9至11)。在第14至17天中，通过将HGF和IGF-1与烟酰胺组合观察到所有3种检验的胰腺内分泌分化标志物的最一致的表达(图1B，泳道12)。尽管处于汇合下并且在没有LIF的情况下将ES细胞维持在培养基中达到17天引起Nanog和Rex1表达的下降，但是这样的条件不能诱导出任何检验的分化标志物。
这些观测确认了依据先前描述的方法(15)，将ES细胞转化为能够表达胰激素编码基因的内分泌细胞。这样的生物模型代表了研究RARβ在胰腺内分泌分化的特定阶段中的作用的有力的工具。
实施例3 – RARβ敲除延迟胰腺内分泌分化中Pdx1的表达。
如前面提到的，RA信号传导，其包括RARβ的参与，被认为对胰腺内分泌分化的发生是至关重要的(11, 20, 21, 24)。为了研究在这样一个过程中RARβ的具体作用，对WT和RARβ KO的小鼠ES细胞实施上述的内分泌分化方案。RT-PCR分析证实了在KO细胞中没有RARβ转录物(图2A)。如同CYP26A1, RARβ2同种型代表RA诱导的基因(38)。这就解释了为什么野生型细胞中，与未处理的情况下相比，在存在RA的情况下RARβ信号更强(图2A)。WT和RARβ KOES细胞二者中都观察到的RA-依赖性Cyp26a1表达，这表明KO细胞仍响应于RA刺激(图2A)。使用RARβ缺失的这个模型，发明人试图确定这种维甲酸受体对Pdx1的表达的影响，其表现为（consist in）胰腺细胞命运的主调节蛋白(39-41)。
如图1中所示，野生型(Wt)和RARβ KO的ES细胞分化成胰腺内分泌细胞，并且在该方案的不同阶段中进行了对Pdx1的间接免疫荧光染色(图2B)。第5天时在WT分化细胞中观察到Pdx1的表达，并且仍然以不均一的模式存在于所检验的所有其它阶段中(图2B)。相反，在RARβ无效细胞中，在第5和11天时PDX1不存在于分化细胞的细胞核，并仅在该方案的第14天之前检测到(图2B)。
这些观察表明，在此正在经历胰腺分化细胞培养系统中缺乏RARβ造成了Pdx1诱导的延迟，其可潜在地影响内分泌特化的后续关键步骤。
实施例4- RARβ表达缺乏损害了全面的胰腺内分泌分化过程
考虑到ES细胞的RARβ的缺失的发现延迟在其向胰腺内分泌细胞特化的过程中Pdx1的表达，发明人决定进一步调查这种现象对整个分化过程中早期，中期和晚期的分子遗传事件的影响。正如许多关于重新编程的研究所报道(42)，ES细胞的多能性因子，包括Nanog，的表达下降是正确分化必不可少的。先前示出在胰腺内分泌分化方案期间第5天左右Nanog的水平降低(图1B)。在WT和RARβ KO分化细胞中Nanog转录物水平的比较，显示在KO细胞中此多能性因子的持续的表达，而其在WT对照中严重受抑制(图3A)。另一方面，在胰腺内分泌细胞系的发生期间一个主要的转录因子，Neurogenin-3(Ngn3)的表达在WT细胞中表现出阶段性诱导模式，但在RARβ敲除中不被诱导RARβ敲除(图3A)。
类似Ngn3，配对盒6(Pax6)和岛-1 (Islet1)是胰岛细胞分化中两个重要的转录因子，其表达在中间(“中”)到最终分化(“晚”)阶段之间表达(39, 40, 44, 45)。与WT相比在RARβ KO细胞中，虽然对于Pax6的表达模式没有观察到任何差异，Isl-1表现出了延迟的表达峰(第14天与第11天)(图3B)。
最后，在RARβ KO和Wt分化细胞中分析不同的功能性内分泌分化标志物如，胰高血糖(Gcg; α细胞)、胰岛素-1(Ins1; β细胞)和胰岛淀粉样多肽(IAPP; β细胞)(15，46，47)的表达(图3C)。在所有的情况下，相对于WT，RARβ KO细胞都显示出那些功能标志物的削弱的表达(图3C)。具体来说，到第17天时，WT分化细胞中的Gcg，Ins1和Iapp的比RARβKO分别显示大约5倍(p值= 0.04)，大约120倍(p值= 0.013)，和大约7倍(p值= 0.0002)的增加(图3C)。在RARβ缺乏型细胞中促生长素抑制素(Sst)，δ细胞的功能性标志物(37)，也显示降低的表达(结果未示出)。
总之，这些观察结果表明，通过调节在特化过程的早期阶段和中期阶段的某些主要基因的表达，RARβ和类视黄醇信号传导在胰腺内分泌分化中起到关键作用，这由此削弱了胰岛细胞的功能性标志物的表达。
实施例5- RARβ的缺失影响体内糖代谢及胰岛功能性
用于研究胰腺内分泌分化的不同步骤的组织培养系统提供了有关RARβ在这个生理过程中发挥的作用的重要见解。具体地讲，RARβ表达的缺失导致了参与胰岛细胞分化的关键转录因子表达的降低或延迟，以及功能分化标志物的表达的降低(图2和3)。因此，发明人用体内模型寻求验证这一发现的相关性。应用小鼠的RARβ双等位基因的经典敲除(26)，其由Ghyselinck等建立和表征，来研究这种删除对胰腺内分泌功能的影响。通过从Wt和RARβ缺乏小鼠提取胰腺，并针对C肽（胰岛素生物合成的副产物）和胰高血糖素进行间接面应荧光染色，发明人观察到与WT相比KO小鼠胰岛的大小减小（约75％，p<0.0001）(图4A)。蛋白免疫印迹分析证实了相比于WT对照, RARβ KO小鼠胰腺提取物中的C-肽和胰高血糖素的表达减少(图4A)。这些观察表明，RARβ KO小鼠显示降低的胰腺内分泌岛细胞产生和/或维护，其可能对葡萄糖代谢有主要有害影响。
为了评估RARβ缺失对胰岛素和胰高血糖素产生降低的细胞的全身效应，两组小鼠禁食15小时并测量血糖浓度。当WT的血糖水平正常(在70和105 mg/dL之间)时(49),发现RARβ KO动物处于略低于正常水平的低血糖状态(61±4.7 mg/dL)(图4B)(50)。为了在两组小鼠组中检验β-细胞的功能性，进行了时间进程的血糖读数实验，所述实验在“0”时间点向腹膜内注射2 mg/Kg（体重）葡萄糖。然后，在WT和RARβ KO小鼠中在0、15、30、45、60和120分钟时监测血糖清除。我们观察到WT小鼠的血糖代谢比KO的更快(图4B)。此外，在注射葡萄糖后120分钟在RARβ KO小鼠的平均血糖水平比WT组的显著更高(大约30％，p值= 0.014)，这表明在缺乏此类视黄醇受体的动物中葡萄糖耐受更低(图4B)。
如实施例中所述，通过应用基于ES细胞的定向分化系统(实施例2-4)和体内基因敲除模型(实施例5)，发明人证明了RARβ在正常的胰腺内分泌细胞的分化中的关键作用。在这两种情况下，RARβ缺乏导致终末分化不和功能性标志物，如胰岛素和胰高血糖素，的产生的降低。在小鼠中，RARβ缺失导致葡萄糖代谢受损，其特征在于低血糖和葡萄糖耐受不良。总之，这些发现表明，降低的RARβ和维甲酸信号传导是葡萄糖代谢紊乱，诸如I型和II糖尿病的关键因子。因此，RARβ受体激动剂可预防或治疗这些疾病。
实施例2中描述的研究得出这样的结论：在胰腺分化过程中，在没有RARβ的情况下，Pdx1的表达被延迟(图2)。这种转录因子代表了胰腺祖细胞和胰芽扩展的早期定型的关键作用因子(39, 40, 51, 52)。先前的一份研究报道，RA直接诱导ES细胞中Pdx1的表达(51)。对于F9畸胎瘤细胞进行的ChIP-chip分析显示位于Pdx1的转录起始位点上游大约3kb处存在推定的维甲酸应答元件(RARE)(结果未示出)，强化了这个观点。在RARβ失效的细胞中Pdx1的表达延迟，而并未完全抑制为通过其它的RARs实现的可能的代偿机制打开了一扇门。先前已经报道RARβ转录产物水平是在内分泌分化阶段增加，而RARα表达的峰值与晚期分化阶段相关联(24)。正如Soria所综述，很可能RARα和β共同参与Pdx1的双相表达模式（39）。因此，抑制RARβ将专有地导致如在RARβ KO细胞中观察到的Pdx1的延迟表达(图2)。
以前有报道说（previously），Pdx1的错误表达与严重的β细胞功能障碍和增加的细胞死亡相关(53)。因此，RARβKO在细胞培养系统中引起β细胞终末分化标志物，如Ins1和Iapp的表达降低(图3)，以及RARβ失效的小鼠腺岛中表达C-肽的细胞的数量减少(图4)。Dalgin等人最近的研究结果(54)也把RA信号传导和内分泌细胞的命运联系起来。虽然作者声称在RA下游靶mnx1 morphant中β细胞的祖细胞分化为α细胞，这里所报告的数据表明，RARβKO导致α-细胞分化的降低，其表征为在细胞培养系统中(图3)和RARβ失效的小鼠中(图4)的胰高糖素的表达降低。因此，在没有RARβ的胰岛细胞中观察到的效果可以归因于RA信号传导在早期胰腺分化事件中，而不是种系特异性（lineage-specific）终末分化中的作用。
类似Pdx1，bHLH转录因子Neurogenin3 (Ngn3)构成了由内胚层向胰腺前体定型的另一关键作用因子(40, 43, 47)。在一系列参与胰腺发育的转录因子中，在内分泌分化通路中Ngn3是最早表达的(40, 55)。尽管没有文献报道RA信号传导和Ngn3的表达之间的关联，RARβ KO细胞显示在胰腺分化期间此转录因子的水平降低(图3)。因此，RARβ删除对Ngn3的影响可能是间接的，并涉及中间因子的参与。
Pax6和ISL-1代表胰芽形成后在内分泌细胞谱系特化中起作用的两个主要转录因子(45, 56)。考虑到RARβ KO不影响Pax6的表达，而且这样的缺失仅延迟ISL -1的表达峰值，似乎表明通过RARβ 的RA信号传导的缺失不足以完全消除内分泌分化，但可能导致胰岛细胞功能的显著缺陷。
报道的观察结果表明，没有RARβ表达损害体内胰岛的发育和维持(图4)。在哺乳动物中，葡萄糖耐受不良的特征是在至少两小时内持续的高血糖水平(高于140毫克/分升)，而当血浓度低于70毫克/分升时判定为低血糖(50, 57)。1)禁食15小时后和2)在葡萄糖注射后的血糖评估结果导致我们提出RARβ失效小鼠具有禁食低血糖和增加的葡萄糖耐受不良的倾向，这两种病况与糖尿病相关(58)。
已经得出饮食习惯和糖尿病，特别是对于II型之间的密切相关性(59)。考虑RARβ在胰腺内分泌细胞分化中的作用，以及RARβ基因本身受维甲酸上调，持续的维生素A缺乏的食物可能导致胰岛细胞更新不足，并最终引发糖尿病。RARβ表达还已知取决于表观遗传调控(60, 61)。例如，在不同的胰腺疾病，例如癌症，糖尿病和慢性胰腺炎中报道了多种启动子元件的异常高甲基化(62-64)。因此，RARβ或其它有关的效应因子的表观遗传沉默可以在糖尿病的某些病例的发作中起作用。
应用基于RA的方案从ES细胞产生分泌胰岛素的内分泌细胞被提出作为糖尿病治疗的有前途的工具(9)。然而，确保正确的维生素A食用以及正常的通过RARβ的RA信号传导代表了预防或治疗糖尿病的新途径。特别是，RARβ激动剂的给予将是提高此RARβ信号传导来预防或治疗糖尿病病症的特异性靶向方法。总的来说，这些发现阐明RARβ在胰腺内分泌分化中的作用，其最终影响体内的血糖代谢。
实施例6 - RARβ激动剂治疗制备。
制备AC261066(来自Tocris的RARβ激动剂)溶液。AC261066溶解于二甲基亚砜(DMSO)，其浓度为1.5毫克/毫升和3.0毫克/毫升，然后稀释在小鼠的饮用水中，达到终浓度为1.5毫克/100毫升和3.0毫克/100毫升。
小鼠、食物、和药物处理。用具有13% kcal脂肪的标准的实验室Chow喂食饮食(CFD) (diet# 5053, Lab Diet, Inc, St. Louis, MO)或具有60% kcal脂肪的高脂肪西式饮食(HFD) (diet #58126, Lab Diet, Inc., St. Louis, MO)喂食Wt雄性C57/BL6小鼠4个月。高脂肪饮食处理开始一个月后，将高脂肪饮食组进一步分成2组，维持3个月：i) 高脂肪饮食，并且饮用水含有1％ DMSO; ii)高脂肪的饮食，并且饮用水含有1.5毫克/ 100毫升特定RARβ激动剂AC261066。然后小鼠通过颈脱位法处死。收获了血液和各种组织样本。
实施例 7 –胰腺
半定量PCR。使用TRIzol试剂(Life technologies) 从小鼠组织提取总RNA，并将1微克RNA用于合成cDNA。使用qScript(Quanta, MD) 以20微升的终体积在42℃下1小时合成cDNA。应用Taq DNA聚合酶(Invitrogen, CA)进行半定量PCR。三步骤PCR如下进行：94℃ 30秒，58-64℃ 45秒用于引物退火，和72℃ 1分钟用于引物延伸。通过实验确定用于扩增的每个引物对在线性范围内的扩增循环数目。PCR产物在2％琼脂糖凝胶中解析，并通过溴化乙锭染色而可视化。使用的针对基因表达的引物如下：RARβ2，F：5'-TGGCATTGTTTGCACGCTGA-3'(序列号25)中，R：5'-CCCCCCTTTGGCAAAGAATAGA-3'(序列号26)，CYP26A1，F：5'-CTTTATAAGGCCGCCCAGGTTAC-3'(序列号27)中，R：5'-CCCGATCCGCAATTAAAGATGA-3'(序列号28)，LRAT，F：5'-TCTGGCATCTCTCCTACGCTG-3'(序列号29)，R：5'-GTTCCAAGTCCTTCAGTCTCTTGC-3'(序列号30)，INS2，F：5'-TGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCT-3'(序列号31)中，R：5'-CAGCTCCAGTTGTGCCACTTGT-3'(序列号32)，HPRT，F：5'-TGCTCGAGTGTGATGAAGG-3'(序列号33)中，R：5'-TCCCTGTTGACTGGTCATT-3'(序列号34)。
胰腺类视色素的分析。将冷冻的胰腺组织样品(约100毫克)在500微升冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中匀浆。此外，将100微升血清用冷PBS稀释至500微升的总体积。在类视色素的提取之前将乙酸视黄酯加入到各样品中用于计算提取效率。避光将类视色素萃取到350微升有机溶液(乙腈/丁醇，50:50，v/v)中。使用Waters Millennium系统(Waters)进行高效液相色谱(HPLC)。将每个样品(350微升中的100微升)加载到5微米反相C18分析柱(Vydac,Hesperia, CA)，并以1.5毫升/分钟的流速洗脱。使用两个流动相梯度系统。类视色素基于两个标准通过HPLC鉴定：通过使用光电二极管阵列检测器在HPLC期间可信的类视色素的标准品的光谱与未知样品的相同UV光光谱（220-400 nm），和未知峰的滞留时间与可信的类视色素的标准品的滞留时间的精确匹配。类视色素的量是由在325纳米波长处所检测到的峰下的面积来计算。视黄醇和视黄基酯的水平针对组织的重量归一化。
4-羟基壬烯醛(4-HNE)的染色。将石蜡包埋切片(其来自每组的两到四只小鼠)脱石蜡和再水化，并使用抗原暴露溶液（Vector Laboratories, H-3300)进行抗原恢复。用3％过氧化氢猝灭内源性过氧化物酶后，用封闭试剂(来自Vector Laboratories的M.O.M.试剂盒)封闭组织切片。然后，组织切片用4-HNE抗体(1:400; 小鼠单克隆抗体; Abcam,ab48506)在4℃下孵育过夜。然后用第二抗体孵育切片(1:200, 抗小鼠IgG，来自M.O.M试剂盒)。将没有用一抗孵育的切片染色作为阴性对照。基于过氧化物酶检测机制使用用作底物的3,3-二氨基联苯胺(DAB)将该信号可视化。
胰腺组织中类视色素的水平。我们的HPLC分析结果显示与CF（对照饮食)对照相比，来自HF喂食的肥胖小鼠的胰腺视黄醇(VA, 维生素A)的水平急剧减少。HD喂食小鼠的胰腺组织中检测不到棕榈酸视黄酯(图5)，显示出严重的胰腺维生素A缺乏。
将来自高脂肪饮食vs.对照饮食的小鼠的血清视黄醇与来自高脂肪vs.对照饮食的小鼠的胰腺视黄醇和棕榈酸视黄酯的水平比较。血清视黄醇水平在HF饮食小鼠中类似或稍微较高，但胰腺视黄醇水平在HF饮食小鼠中要低得多，这表明在胰腺中缺乏维生素A，即使在存在正常血清维生素A的情况下(图6)。
AC261066降低HF喂食的小鼠胰腺中的氧化应激水平。高脂肪饮食导致在很多组织中触发炎症反应和后续损伤的过多的活性氧类别(ROS)的产生。因此，我们检查了4-羟基壬烯醛，一种α,β不饱和的hydroxyalkenal的水平，其在氧化应激期间在细胞中通过脂质过氧化产生，并且是胰腺中由活性氧类别(ROS)引起的氧化应激的标志物。与正常Chow喂食的对照相比，来自HF喂食的小鼠的胰岛显示4-HNE水平的增加（图7）。与HF-溶媒处理的小鼠相比，来自高脂肪饮食加上AC261066组的胰岛样品表现出显著较低的4-HNE染色强度水平（图7）。
AC261066的确降低胰岛的胰岛素的表达。随后我们检查了CF，HF，和HF+AC261066喂食的小鼠中胰腺内分泌激素的表达变化。针对胰岛素原C肽(绿色)和胰高血糖素(红色)染色的胰岛揭示，来自HF和HF+AC261066喂食的小鼠的胰岛与对照饮食对照相比显示C肽信号明显增加(图8)。AC261066略微降低HF饮食小鼠的C肽水平。
AC2621066增加肥胖和维生素A缺乏小鼠中RARβ的胰腺mRNA表达。与我们的HPLC数据一致，这证明来自HF喂食的肥胖小鼠的胰腺组织具有显著降低的VA（维生素A）水平，和显著降低的VA应答基因和VA信号传导转录因子，RARβ的mRNA水平。与对照饮食喂食的小鼠相比，HF喂食的肥胖小鼠的胰腺的RARβmRNA减少(图9)。与HF-溶媒处理的小鼠相比HF-AC261066处理小鼠的RARβ的mRNA水平增加（图9），并且接近在非肥胖对照中观察到的水平，这说明AC261066可以防止或逆转VA耗尽的组织中的VA信号传导的丧失。在维生素A缺乏的小鼠中结果类似(图10)。
实施例 8 – 肝
苏木精和伊红染色。在处死时，将新鲜小鼠肝样品固定在4％甲醛溶液中24小时，并包埋入石蜡块中。将肝石蜡切片切成5微米厚，并固定在载玻片上，并使用标准的方案用苏木精和伊红(H&E)染色。
将油红O和免疫荧光染色组合。将新鲜小鼠肝样品嵌入最佳切削温度(OCT)介质中，并立即冷冻到-70℃。随后在室温下将冷冻切片在4％甲醛中固定1小时。然后将载玻片用去离子水(dH2O)漂洗三次，每次30秒，随后用含有0.5％ Triton X-100的PBS处理5分钟。然后将切片用PBS洗涤3次，每次5分钟。室温下用2％牛血清白蛋白(BSA)孵育样品30分钟以封闭非特异性抗体结合。在封闭后，切片在PBS中洗涤三次，用抗α-SMA的小鼠单克隆抗体(1:500,Dako, Inc)在4℃下孵育24小时。24小时后，切片在PB中洗涤三次，与Alexa-Flour-488抗小鼠第二抗体(1:500，Invitrogen, Inc)在室温下孵育30分钟。然后将切片在PBS中洗涤三次，并与工作强度油红O溶液一起在室温下孵育30分钟。然后在流动的自来水下漂洗切片30分钟，再用Vectashield hard mount plus DAPI(Vector Labs, Inc)封片。
半定量PCR (RT-PCR) (肝)。使用TRIzol试剂(Life technologies) 从小鼠组织提取总RNA，并将（1微克）用于合成cDNA。cDNA合成使用qScript(Quanta, MD)在42℃下以20微升的最终体积进行1小时。用Taq DNA聚合酶(Invitrogen, CA)进行半定量PCR。三步骤PCR反应如下进行：94℃ 30秒，58-64℃ 45秒用于引物退火，和72℃ 1分钟用于引物延伸。经实验确定在线性范围内的用于扩增的每个引物对的循环数目。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上解析，并通过用溴化乙锭染色而可视化。使用的针对基因表达的引物如下：RARβ2，F： 5'-TGGCATTGTTTGCACGCTGA -3'(序列号25)中，R ：5'- CCCCCCTTTGGCAAAGAATAGA -3'(序列号26)，CYP26A1 ，F： 5'- CTTTATAAGGCCGCCCAGGTTAC -3 '(序列编号27)，R ：5'-CCCGATCCGCAATTAAAGATGA -3'(序列号28)，LRAT，F：5'- TCTGGCATCTCTCCTACGCTG -3' (序列号29)，R ：5'- GTTCCAAGTCCTTCAGTCTCTTGC -3' (序列号30) ， INS2 ，F： 5'-TGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCT -3' (序列号31)，R ：5'- CAGCTCCAGTTGTGCCACTTGT -3'(序列号32)，TNF-α，F：5' -CCTGTAGCCCACGTCGTAG -3' (序列号35)，R ：5'-GGGAGTAGACAAGGTACAACCC -3' (序列号36)， MCP1 ，F： 5'- TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA -3' (序列号37)，R ：5'- GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT -3'(序列号38)， HPRT ，F： 5'-TGCTCGAGTGTGATGAAGG -3'(序列号33)，R ：5'- TCCCTGTTGACTGGTCATT -3'(序列号34 )。
血清甘油三酯水平的测量。血清甘油三酯水平的分析在Memorial Sloan-Kettering Cancer Center的比较病理学实验室用双色测定（bichromatic assay）进行。Chow-喂食的饮食(CFD) n = 2; 高脂肪饮食(HFD)n = 3;高脂肪饮食+AC261066 (HFDAC)n = 5。
血清和肝中类视色素的分析。将冷冻的肝组织样品(约100毫克)在500微升冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中匀浆。此外，用冷PBS将100微升血清稀释至500微升总体积。为了计算提取效率，在提取类视色素之前将乙酸视黄酯加入到各样品中。在避光的条件下将类视色素萃取到350微升有机溶液(乙腈/丁醇，50:50，v/v)中。使用Waters Millennium系统(Waters)进行高效液相色谱(HPLC)。每个样品(350微升中的100微升)加载到一个 5微米反相C18分析柱(Vydac, Hesperia, CA)，并以1.5 ml/分钟的流速洗脱。使用两个流动相梯度系统。类视色素基于两个标准通过HPLC鉴定：通过使用光电二极管阵列检测器在HPLC期间可信的类视色素的标准品的光谱与未知样品的相同UV光光谱（220-400 nm），和未知峰的滞留时间与可信的类视色素的标准品的滞留时间的精确匹配。类视色素的量是由在325纳米波长处所检测到的峰下的面积来计算。视黄醇和视黄基酯的水平针对组织的重量归一化。
4-羟基壬烯醛(4-HNE)的染色。将石蜡包埋切片(其来自每组的两到四只小鼠)脱石蜡和再水化，并使用抗原暴露溶液（Vector Laboratories, H-3300)进行抗原恢复。用3％过氧化氢猝灭内源性过氧化物酶后，用封闭试剂(来自Vector Laboratories的M.O.M.试剂盒)封闭组织切片。然后，组织切片用4-HNE抗体(1:400; 小鼠单克隆抗体; Abcam,ab48506)在4℃下孵育过夜。然后用第二抗体孵育切片(1:200, 抗小鼠IgG，来自M.O.M试剂盒)。将没有用一抗孵育的切片染色作为阴性对照。基于过氧化物酶检测机制使用用作底物的3,3-二氨基联苯胺(DAB)将该信号可视化。
血清和肝类视色素的分析。将冷冻的肝组织样品(约100毫克)在500微升冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中匀浆。此外，用冷PBS将100微升血清稀释至500微升总体积。为了计算提取效率，在提取类视色素之前将乙酸视黄酯加入到各样品中。在避光的条件下将类视色素萃取到350微升有机溶液(乙腈/丁醇，50:50，v/v)中。使用Waters Millennium系统(Waters)进行高效液相色谱(HPLC)。每个样品(350微升中的100微升)加载到一个 5微米反相C18分析柱(Vydac, Hesperia, CA)，并以1.5 ml/分钟的流速洗脱。使用两个流动相梯度系统。类视色素基于两个标准通过HPLC鉴定：通过使用光电二极管阵列检测器在HPLC期间可信的类视色素的标准品的光谱与未知样品的相同UV光光谱（220-400 nm），和未知峰的滞留时间与可信的类视色素的标准品的滞留时间的精确匹配。类视色素的量是由在325纳米波长处所检测到的峰下的面积来计算。视黄醇和视黄基酯的水平针对组织的重量归一化。
AC261066减少肝脂肪变性。来自处理小鼠的肝切片的H&E染色显示，与CFD喂食的小鼠相比，4个月的HF西方饮食导致HF-喂食的小鼠肝细胞脂质累积增加(图11)。与HF-溶媒处理的小鼠相比，用AC261066处理的HF-喂食的小鼠表现出显著降低的肝细胞脂质浸润(图11)。用RARγ配体(CD1530)处理的HF-喂食的小鼠并不在肝脂质积聚方面显示出降低(图11)。
AC261066减少α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白)和SREBP1c的基因肝表达。与我们的免疫荧光显微术结果一致，显示与HF-溶媒对照相比，HF-AC261011喂食的小鼠中α-SMA蛋白减少，α-SMA的肝mRNA水平也在HF-AC261011喂食的小鼠的肝中降低，但不在HF-CD1530处理的小鼠的肝中降低（图12）。我们也测量了SREBP1-c的mRNA表达，其编码负责甘油三酯的更新合成的转录因子并且常常在具有实验诱导的NAFLD的动物的肝中过表达。我们的分析揭示SREBP1-c的mRNA水平在HF喂食和HF-喂食CD1530处理的小鼠的肝中，而非在HF-AC261011处理的小鼠的肝中，明显更高（图12）。
AC261066降低肝星状细胞(HSC)激活。用中性脂质染色剂（neutral lipid）红油O共染色的肝切片与H&E染色一致，表明与CF对照相比，HF-喂食的肥胖小鼠具有异常的肝脂质积累(红色)(图13)。与HF溶媒-喂食的小鼠相比，HF-AC261066喂食的小鼠的肝具有显著减少的肝脂质积累（图13）。此作用并未在HF-喂食的用CD1530(RARγ激动剂)处理的小鼠的肝中观察到。
活化的HSCs促进正常肝组织的修复过程，但未达成的（unresolved）HSC活化可导致纤维化损害的形成和脂肪变性进展到晚期的NAFLD，如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。我们用α-SMA抗体染色肝切片以检查HF-喂食的肥胖小鼠是否表现出HSCs的活化增加的证据。该分析揭示HF-喂食的小鼠的肝与瘦的，CF对照相比具有增加的α-SMA阳性(绿色)染色。α-SMA阳性区域趋于簇集在具有肝细胞脂肪浸润的区域(图13)。与HF-喂食的小鼠相比，HF-喂食的AC261066处理的小鼠具有降低的α-SMA阳性染色强度和区域（图13）。此外，在HF-AC261066处理的小鼠的肝中并未观察到在脂质阳性染色(红色)区域簇集α-SMA。HF-喂食的CD1530处理的小鼠的肝与HF喂食-溶媒处理的小鼠相比不具有脂质积累或α-SMA表达密度或模式减少的证据。
AC261066降低促炎症介质的基因肝表达。NAFLD通常与促炎细胞因子和介质，例如单核细胞趋化因子MCP-1和细胞因子TNF-α的肝表达的增加有关。我们检查了CF和HF-喂食的小鼠的肝中这些基因的表达。我们的分析显示，在HF喂食的小鼠和HF喂食的CD1530处理的小鼠的肝中MCP-1和TNF-α二者的mRNA水平显著升高，但是在HF喂食的AC261066处理的小鼠的肝没有此现象(图14)。
AC261066不增加血清甘油三酯水平。因为升高的甘油三酯是心血管疾病的风险因素，所以我们检查了小鼠血清样品中的甘油三酯水平。如图15所示，与CF对照相比，HF或HF+AC261066喂食并不影响血清甘油三酯水平。这表明AC261066不增加心血管疾病的风险，并表明AC261066的肝的脂质降低效果不与肝脂质输出的增加有关。
AC261066部分逆转HF-喂食的肥胖小鼠的肝中VA的枯竭。肝储藏全身VA的约80-90％，因此我们进行了HPLC以测定瘦的CF，HF和HF+AC261066喂食的小鼠中VA的主要储存形式，棕榈酸视黄酯和全反视黄醇的组织水平。我们的分析表明与瘦的，CF对照相比，在HF-喂食的，肥胖小鼠中肝的棕榈酸视黄酯和视黄醇的水平减少97%和92% (图16)。VA的主要循环形式，全反式视黄醇的血清水平在CF，HF和HF+AC261066喂食的小鼠之间没有差异，表明HF-引起的肥胖导致组织中VA耗尽，其不通过血清VA水平体现。
HF+AC261066和CD1530喂食的小鼠的肝与对照相比也具有显著降低的棕榈酸视黄酯和视黄醇，但相比于HF-溶媒处理的小鼠，我们观察到与HF-溶媒处理的小鼠相比，在HF-AC261066喂食的小鼠的肝中棕榈酸视黄酯的水平增加了55％，而在HF+CD1530处理的小鼠的肝中棕榈酸视黄酯的水平降低了几乎48% (图16)。这表明，更长期地将AC261066给予HF-喂食的肥胖小鼠可以显著地逆转HF-肥胖引起的肝VA枯竭。
与在高脂肪饮食组中的相比，氧化应激水平，如通过4-羟基壬烯醛（4-HNE）评定的，在高脂饮食加上AC261066组的肝中更低。高脂肪饮食导致在很多组织中触发炎症反应和后续损伤的过多的活性氧类别(ROS)的产生。因此，我们检查了4-羟基壬烯醛(4-HNE)，一种α,β不饱和的hydroxyalkenal的水平，其在氧化应激期间在细胞中通过脂质过氧化产生，并且是肝中由活性氧类别(ROS)引起的氧化应激的标志物。与对照脂肪饮食组相比，来自高脂肪饮食组的肝显示4-HNE水平的大的增加，而与来自高脂肪饮食组的那些相比，来自高脂肪饮食加上AC261066组的肝样品表现出较低的4-HNE水平（图17）。
实施例 9 – 肾
苏木精和伊红染色。在处死时，将新鲜小鼠肝样品固定在4％甲醛溶液中24小时，并包埋入石蜡块中。将肾石蜡切片切成5微米厚，并固定在载玻片上，并使用标准的方案用苏木精和伊红(H&E)染色。
将油红O和免疫荧光染色组合。将新鲜小鼠肾样品嵌入最佳切削温度(OCT)介质中，并立即冷冻到-70℃。随后在室温下将冷冻切片在4％甲醛中固定1小时。然后将载玻片用去离子水(dH2O)漂洗三次，每次30秒，随后用含有0.5％ Triton X-100的PBS处理5分钟。然后将切片用PBS洗涤3次，每次5分钟。室温下用2％牛血清白蛋白(BSA)孵育样品30分钟以封闭非特异性抗体结合。在封闭后，切片在PBS中洗涤三次，用抗α-SMA的小鼠单克隆抗体(1:500,Dako, Inc)在4℃下孵育24小时。24小时后，切片在PB中洗涤三次，与Alexa-Flour-488抗小鼠第二抗体(1:500，Invitrogen, Inc)在室温下孵育30分钟。然后将切片在PBS中洗涤三次，并与工作强度油红O溶液一起在室温下孵育30分钟。然后在流动的自来水下漂洗切片30分钟，再用Vectashield hard mount plus DAPI(Vector Labs, Inc)封片。
半定量PCR (RT-PCR)。使用TRIzol试剂(Life technologies) 从小鼠组织提取总RNA，并将（1微克）用于合成cDNA。cDNA合成使用qScript(Quanta, MD)在42℃下以20微升的最终体积进行1小时。用Taq DNA聚合酶(Invitrogen, CA)进行半定量PCR。三步骤PCR反应如下进行：94℃ 30秒，58-64℃ 45秒用于引物退火，和72℃ 1分钟用于引物延伸。经实验确定在线性范围内的用于扩增的每个引物对的循环数目。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上解析，并通过用溴化乙锭染色而可视化。使用的针对基因表达的引物如下：RARβ2，F： 5'-TGGCATTGTTTGCACGCTGA -3'(序列号25)，R ：5'- CCCCCCTTTGGCAAAGAATAGA -3'(序列号26)，CYP26A1，F： 5'- CTTTATAAGGCCGCCCAGGTTAC -3 '(序列编号27)，R ：5'-CCCGATCCGCAATTAAAGATGA -3'(序列号28)，TNF-α，F：5' -CCTGTAGCCCACGTCGTAG -3' (序列号35)，R ：5'- GGGAGTAGACAAGGTACAACCC -3' (序列号36)，HPRT，F： 5'-TGCTCGAGTGTGATGAAGG -3'(序列号33)，R ：5'- TCCCTGTTGACTGGTCATT -3'(序列号34 )。
肾的类视色素的分析。将冷冻的肾组织样品(约100毫克)在500微升冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中匀浆。此外，用冷PBS将100微升血清稀释至500微升总体积。为了计算提取效率，在提取类视色素之前将乙酸视黄酯加入到各样品中。在避光的条件下将类视色素萃取到350微升有机溶液(乙腈/丁醇，50:50，v/v)中。使用Waters Millennium系统(Waters)进行高效液相色谱(HPLC)。每个样品(350微升中的100微升)加载到一个5微米反相C18分析柱(Vydac, Hesperia, CA)，并以1.5 ml/分钟的流速洗脱。使用两个流动相梯度系统。类视色素基于两个标准通过HPLC鉴定：通过使用光电二极管阵列检测器在HPLC期间可信的类视色素的标准品的光谱与未知样品的相同UV光光谱（220-400 nm），和未知峰的滞留时间与可信的类视色素的标准品的滞留时间的精确匹配。类视色素的量是由在325纳米波长处所检测到的峰下的面积来计算。视黄醇和视黄基酯的水平针对组织的重量归一化。
4-羟基壬烯醛(4-HNE)的染色。将石蜡包埋切片(其来自每组的两到四只小鼠)脱石蜡和再水化，并使用抗原暴露溶液（Vector Laboratories, H-3300)进行抗原恢复。用3％过氧化氢猝灭内源性过氧化物酶后，用封闭试剂(来自Vector Laboratories的M.O.M.试剂盒)封闭组织切片。然后，组织切片用4-HNE抗体(1:400; 小鼠单克隆抗体; Abcam,ab48506)在4℃下孵育过夜。然后用第二抗体孵育切片(1:200, 抗小鼠IgG，来自M.O.M试剂盒)。将没有用一抗孵育的切片染色作为阴性对照。基于过氧化物酶检测机制使用用作底物的3,3-二氨基联苯胺(DAB)将该信号可视化。
AC261066减少肾脂质积累。来自处理小鼠的肾切片的H&E染色显示，与CFD喂食的小鼠相比，4个月的HF西方饮食导致HF-喂食的小鼠肾脂质累积增加(图18)。与HF-溶媒处理的小鼠相比，用AC261066处理的HF-喂食的小鼠表现出显著降低的肾脂质浸润(图18)。用RARγ配体(CD1530)处理的HF-喂食的小鼠并不在肾脂质积聚方面显示出降低(图18)。
AC261066减少α-SMA的肾表达。用中性脂质染色剂红油O共染色的肾切片与H&E染色一致，表明与CF对照相比，HF-喂食的肥胖小鼠具有异常的肾脂质积累(红色)(图18)。与HF溶媒-喂食的小鼠相比，HF-AC261066喂食的小鼠的肾具有显著减少的肾脂质积累（图19）。α-SMA对于肾组织修复过程为必须的，但是未经检查的α-SMA分泌可导致纤维化损害和晚期肾病的进展。如预料，与对照喂食的小鼠相比，HF喂食的小鼠的肾的肾脂质小滴明显增加。与H&E组织学分析一致，来自HF+AC261066处理的小鼠的肾切片具有相对较少的红油O阳性区域。α-SMA（绿色）也揭示，与对照喂食的小鼠相比，HF-喂食的小鼠的肾具有增加的α-SMA阳性区域（图19）。α-SMA阳性区域的这种增加在HF+AC261066处理的小鼠的肾中并未观察到。
肾中的类视色素的水平。我们对肾组织的HPLC分析表明HF-喂食的肥胖小鼠与chow喂食的对照相比具有显著降低的肾棕榈酸视黄酯和视黄醇水平(图20)。
AC261066降低促炎症介质的肾基因表达。纤维化与促炎细胞因子和介质的肾表达增加有关。我们检查了HF喂食的小鼠的肾是否有炎症的证据，所述炎症以诸如TNF-α等炎症细胞因子的增加表达为标志。我们的分析显示TNF-α的mRNA水平在HF-喂食的小鼠肝中显著升高，但在HF-喂食的AC261066处理的小鼠的肝中并非如此(图21)。
AC261066增加RARβ2的基因肾表达。与HPLC数据一致，表明VA水平在HF-喂食的小鼠的肾中减少，我们的基因肾表达分析表明，RARβ2 mRNA在HF-喂食的小鼠的肾中显著减少（图21）。而来自HF-AC261066的肾并不具有降低的RARβ2 mRNA水平(图21)。
与在高脂肪饮食组中的相比，氧化应激水平，如通过4-羟基壬烯醛（4-HNE）评定的，在高脂饮食加上AC261066组的肾中更低。高脂肪饮食导致在很多组织中触发炎症反应和后续损伤的过多的活性氧类别(ROS)的产生。因此，我们检查了4-羟基壬烯醛（4-HNE），一种α,β不饱和的hydroxyalkenal的水平，其在氧化应激期间在细胞中通过脂质过氧化产生，并且是肾中由活性氧类别(ROS)引起的氧化应激的标志物。与对照脂肪饮食组相比，来自高脂肪饮食组的肾显示4-HNE水平的大的增加，而与来自高脂肪饮食组的那些相比，来自高脂肪饮食加上AC261066组的肾表现出较低的4-HNE水平（图17）。
实施例 10 - 睾丸
半定量PCR (RT-PCR)。使用TRIzol试剂(Life technologies)从小鼠组织提取总RNA，并将（1微克）用于合成cDNA。cDNA合成使用qScript(Quanta, MD)在42℃下以20微升的最终体积进行1小时。用Taq DNA聚合酶(Invitrogen, CA)进行半定量PCR。三步骤PCR反应如下进行：94℃ 30秒，58-64℃ 45秒用于引物退火，和72℃ 1分钟用于引物延伸。经实验确定在线性范围内的用于扩增的每个引物对的循环数目。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上解析，并通过用溴化乙锭染色而可视化。使用的针对基因表达的引物如下：RARβ2，F： 5'-TGGCATTGTTTGCACGCTGA -3'(序列号25)，R ：5'- CCCCCCTTTGGCAAAGAATAGA -3'(序列号26)，CYP26A1，F： 5'- CTTTATAAGGCCGCCCAGGTTAC -3 '(序列编号27)，R ：5'-CCCGATCCGCAATTAAAGATGA -3'(序列号28)，HPRT，F： 5'- TGCTCGAGTGTGATGAAGG -3'(序列号33)，R ：5'- TCCCTGTTGACTGGTCATT -3'(序列号34 )。
睾丸类视色素的分析。将冷冻的肾组织样品(约100毫克)在500微升冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中匀浆。此外，将100微升血清用冷PBS稀释至500微升的总体积。在类视色素的提取之前将乙酸视黄酯加入到各样品中用于计算提取效率。避光将类视色素提取到350微升有机溶液(乙腈/丁醇，50:50，v/v)中。使用Waters Millennium系统(Waters)进行高效液相色谱(HPLC)。将每个样品(350微升中的100微升)加载到5微米反相C18分析柱(Vydac,Hesperia, CA)，并以1.5毫升/分钟的流速洗脱。使用两个流动相梯度系统。类视色素基于两个标准通过HPLC鉴定：通过使用光电二极管阵列检测器在HPLC期间可信的类视色素的标准品的光谱与未知样品的相同UV光光谱（220-400 nm），和未知峰的滞留时间与可信的类视色素的标准品的滞留时间的精确匹配。类视色素的量是由在325纳米波长处所检测到的峰下的面积来计算。视黄醇和视黄基酯的水平针对组织的重量归一化。
睾丸中的类视色素水平。我们对睾丸的HPLC分析表明HF-喂食的肥胖小鼠与chow喂食的对照相比具有显著减少水平的肾棕榈酸视黄酯（VA的主要储存形式）和减少的视黄醇(图23)。
HF-喂食的小鼠的睾丸具有VA相关基因表达的减少的表达。与HPLC数据一致，这证明VA水平在HF-喂食的小鼠的肾中减少，我们的基因睾丸表达分析揭示在HF-喂食的小鼠的睾丸中RARβ2，CYP26A1，和RAR gamma2的mRNA显著减少(图24)。
RARβ2激动剂AC55649是在1％DMSO中以3.0mg/100ml的浓度制备，并用于处理小鼠，如实施例6-10所描述。
实施例11 - 方法. AC261066(来自Tocris的RARβ激动剂)溶液的配制。AC261066(Lund等, Discovery of a potent, orally available, and isoform-selectiveretinoic acid beta2 receptor agonist. J Med Chem. 2005;48(24):7517-9) andCD1530 (Thacher等，Therapeutic applications for ligands of retinoid receptors.Curr Pharm Des. 2000;6(1):25-58)分别以1.5 毫克/毫升(AC261066)和2.5毫克/毫升(CD1530)的浓度溶解在二甲亚砜(DMSO)中，并在分别在小鼠的饮用水中稀释至最终浓度为1.5毫克/100毫升和2.5毫克/100毫升。
实施例12 - 小鼠、食物和药物处理。WT雄性C57/BL6雄性小鼠用具有13% kcal脂肪的标准实验室chow喂食饮食（Con）(diet# 5053, Lab Diet, Inc, St. Louis, MO)，或具有45% kcal脂肪的高脂肪，西方类型饮食（HFD）(diet #58126, Lab Diet, Inc., St.Louis, MO)喂养4个月。在开始HFD处理后一个月，HFD组进一步分为3组达到3个月：i) HFD和含有1%DMSO的饮用水；ii) 高脂肪饮食（HFD）和含有在1% DMSO中的1.5 mg/100mlAC261066，一种特异性RARβ激动剂的饮用水；iii) HFD和含有在1% DMSO中的1.5 mg/100mlCD1530，一种特异性RARγ激动剂的饮用水。然后小鼠通过颈脱位法处死。收获血液和各种组织样本。
实施例13 - 血清甘油三酯和胆固醇水平的测量。血清甘油三酯的分析在Memorial Sloan-Kettering Cancer Center的比较病理学实验室用双色测定法完成。Chow喂食饮食(Con) n=4；高脂肪饮食(HFD) n=4；高脂肪饮食（HFD）+AC261066 n=4；高脂肪饮食（HFD）+CD530 n=4。
实施例14 –实时定量PCR (Q-RT-PCR)。使用TRIzol试剂(Life technologies)从小鼠组织提取总RNA，并将（1微克）用于合成cDNA。cDNA合成使用qScript(Quanta, MD)在42℃下以20微升的最终体积进行1小时。如先前描述进行半定量Q-RTPCR(15)。使用的针对基因表达的引物如下：
SREBP1C F：5'-CAAGGCCATCGACTACATCCG-3'(序列号39)，
R：5'-CACCACTTCGGGTTTCATG-3'(序列号40)，
FAS F：5'-GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT-3'(序列号41)，
R：5'-TGGGTAATCCATAGAGCCCAG-3'(序列号42)，
DGAT1 F：5'-ATGATGGCTCAGGTCCCACT-3'(序列号43)，
R：5'-CACTGGGGCATCGTAGTTGA-3'(序列号44)，
SIRT1 F：5'-TCTCCTGTGGGATTCCTGAC-3'(序列号45)，
R：5'-CTCCACGAACAGCTTCACAA-3'(序列号46)，
PPARα F：5'-AGAGCCCCATCTGTCCTCTC-3'(序列号47)，
R：5'-ACTGGTAGTCTGCAAAACCAAA-3'(序列号48)，
PPARγ F：5'-CTCCAAGAATACCAAAGTGCGA-3'(序列号49)，
R：5'-GCCTGATGCTTTATCCCCACA-3'(序列号50)，
SREBP2 F：5'-GCAGCAACGGGACCATTCT-3'(序列号51)，
R：5'-CCCCATGACTAAGTCCTTCAACT-3'(序列号52)，
HMGCR F：5'-AGCTTGCCCGAATTGTATGTG-3'(序列号53)，
R: 5'-TCTGTTGTGAACCATGTGACTTC-3'(序列号54)，
PEPCK F：5'-TGCCCAAGGCAACTTAAGGG-3'(序列号55)，
R：5'-CAGTAAACACCCCCATCGCT-3'(序列号56)，
FGF21 F：5'GTGTCAAAGCCTCTAGGTTTCTT-3'(序列号57)，
R：5'GGTACACATTGTAACCGTCCTC-3'(序列号58)，
HPRT F：5'-TGCTCGAGTGTGATGAAGG-3'(序列号59)，
R：5'-TCCCTGTTGACTGGTCATT-3'(序列号60)。
实施例15–选择性RARβ(例如，RARβ2)激动剂有效地控制和减少血清甘油三酯和胆固醇水平。以1.5毫克/100毫升在饮用水中提供的高选择性RARβ2激动剂，AC261066，可在喂食高脂肪饮食（HFD）达4个月的小鼠中显著降低血清胆固醇和甘油三酯(图25A)。与此相反，用RARγ激动剂，CD1530，处理的HFD-喂食的小鼠在血清胆固醇和甘油三酯的水平上并不显示降低(图25A)。使用定量实时PCR(Q-RT-PCR)我们也测量涉及脂肪酸，胆固醇和葡萄糖重新合成的基因的肝mRNA水平。我们证明了AC261066在HFD-喂食的小鼠中显著降低了脂生成蛋白质srebp1-c，fas，dgat1，fgf21和ppar-γ的肝mRNA水平(图25B)。我们还证明AC261066处理防止了参与脂肪酸的β-氧化的两种蛋白质，sirt1与ppar-α，的肝mRNA水平大幅度下降(图1B)。我们的基因表达分析还显示，AC261066处理显著降低srebp-2和hmgcr的肝mRNA水平(图25B)。Srebp-2是增加hmgcr(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，或HMG-CoA还原酶)，在胆固醇重新合成中的限速酶的mRNA水平的转录因子。在CD1530(RARγ激动剂)处理的HFD-喂食的小鼠的肝中并未观察到此效果，这说明了AC261066对RARβ2的特异性(图1B)。pepck(其为糖异生的限速酶)的基因表达并不受AC261066或CD1530任一种的影响(图25B)。总之，这些结果表明，特异性激动剂激活转录因子RARβ2导致高脂肪饮食喂食的小鼠的血清甘油三酯和总胆固醇水平二者的显著减少，这与支持抑制甘油三酯和胆固醇重新合成的肝转录变化相符合。总的来说，这些数据强烈表明，合成的RARβ2激动剂是新的降胆固醇的药物。
表4基因ID和缩写
Figure DEST_PATH_IMAGE019
实施例16-维甲酸受体β(RARβ)激动剂在高脂肪和遗传性糖尿病模型中减少体重，饮食诱导的葡萄糖不耐受性和胰岛素抗性。我们的代谢研究表明，两种RARβ激动剂AC261066和AC55649显著降低肥胖，高脂肪（HF）-喂食的小鼠(图27A)，以及遗传上肥胖和糖尿病Ob/Ob和Db/Db小鼠(图27E)的体重。我们的代谢研究还表明，这两个RARβ激动剂的给予都导致糖尿病HF-喂食的肥胖小鼠(图27C，D)，以及遗传上肥胖和糖尿病小鼠中的高血糖症(图27F，G，H)的逆转。鉴于RARβ激动剂处理的小鼠具有降低的血糖水平，我们随后试图确定是否RARβ激动剂能提高胰岛素分泌和全身胰岛素代谢，这二者通常都在患有2型糖尿病(T2D)的个体中被改变。我们的胰岛素代谢研究表明给予遗传上肥胖糖尿病Ob/Ob和Db/Db小鼠RARβ激动剂导致改善的胰岛素代谢(图27L，M)。我们还发现，用RARβ AC261066处理Ob/Ob小鼠降低胰腺胰岛素分泌，其为胰腺功能改善的一个指标。
实施例17-维甲酸受体β(RARβ)激动剂降低肥胖和糖尿病的Ob/Ob和Db/Db模型的大胰岛的数目以及胰腺胰岛素含量。T2D的早期阶段始于改变的胰岛素代谢，其被称为胰岛素抗性(IR)，其导致胰腺的产胰岛素的细胞（称为β-细胞）的增大，过度产生胰岛素以代偿IR。我们的代谢研究显示，RARβ激动剂可以改善IR，并由此减少胰腺胰岛素分泌。因此，我们随后试图确定RARβ激动剂是否减少HF-喂食的，以及遗传性糖尿病小鼠的β-细胞的增大。使用免疫组织化学和胰岛素抗体，我们检查了胰腺切片，并发现RARβ激动剂导致胰腺β-细胞（也称为胰岛）减少和降低胰腺胰岛素含量(图28A，B)。总之，我们的代谢和胰腺研究表明，RARβ激动剂i)降低少HF-喂食的遗传性肥胖的Ob/Ob和Db/Db小鼠的肥胖，ii)改善饮食性和遗传性肥胖和糖尿病模型中葡萄糖不耐受性和外周组织胰岛素抗性。
实施例18 - 维甲酸受体β(RARβ)激动剂减轻饮食性和遗传性糖尿病模型中肝，胰，肾，肌肉和脂肪甘油三酯的积累。肥胖导致脂质在诸如肝，肾和脂肪组织等器官中的积累。器官中过多的脂类可以改变它们的功能，并导致IR和促进T2D的进展。鉴于用RARβ激动剂处理的小鼠中体重降低和代谢分布型改善，我们针对脂质的存在检查了HF和遗传性肥胖糖尿病小鼠的器官。我们对苏木精和伊红染色的肝，胰，肾，脂肪组织的分析显示用RARβ激动剂处理的HF喂食的和遗传性肥胖小鼠在其肝(图29A[a-e] B, C)，胰腺(图29A[f-j],D)，肾(图29A[k-o], E)，肌肉(图29F)，和脂肪组织(图29A[p-t], G)中脂质（甘油三酯）具有显著降低。
实施例19 - 维甲酸受体β(RARβ)激动剂AC261066改变涉及脂生成和脂质线粒体氧化的基因的组织表达。组织脂质可以通过增加的脂质降解(分解代谢)和/或通过减少脂质合成而改变。除肝外，大部分器官不合成脂质而是利用通过血液递送的脂质。2型糖尿病(T2D)与诸如肌肉等器官分解代谢脂质的能力下降，由此导致过量脂质的积累有关。我们检查肝、胰和脂肪组织中涉及被称为β氧化的脂质分解代谢过程以及脂质合成的基因的表达。我们的基因表达分析表明，用RARβ激动剂处理的HFD-喂食的和遗传性肥胖小鼠的肝、胰和脂肪组织的刺激脂质的β氧化的基因显著增加，所述基因包括转录因子PPARα，转运蛋白CPT1-α和CPT2，和脂质分解酶乙酰辅酶A乙酰转移酶1(ACAT1)(图30A，C和D)。在肝和胰腺中，我们还检测到涉及抑制β-氧化和刺激脂生成的基因表达的显著减少，所述基因包括脂肪酸重新合成中的限速酶，脂肪酸合酶(FASN)，脂生成转录因子SREBP1和乙酰-CoA乙酰转移酶1(ACC1)(图30B和C)。与体重和脂肪组织重量的减少一致，RARβ激动剂治疗也导致负责脂肪细胞脂解作用的基因，例如激素敏感脂肪酶(HSL)和围脂滴蛋白(PLIN)(图30D)显著增加。基因脂连蛋白(ADIPOQ)的脂肪组织表达在RARβ激动剂处理的HFD喂食的和遗传性糖尿病小鼠中显著增加，所述基因脂连蛋白(ADIPOQ)的脂肪组织表达在患有T2D的个体中减少并显示在外周组织中刺激脂质的氧化。(图30D)。总而言之，我们的基因表达研究有力地表明，RARβ激动剂能够调节肝，胰和脂肪组织中导致增加脂质的β氧化和降低脂生成的途径。AC261066增加器官中对于葡萄糖-能量代谢和T2D的发病机理至关重要的脂质能量代谢的能力说明此RARβ激动剂葡糖糖降低和胰岛素敏化作用很可能和脂质能量代谢调节相关。
实施例20-急性施用维甲酸受体β(RARβ)激动剂逆转高脂肪诱导的葡萄糖不耐受性和胰岛素抗性。我们检验了急性施用(8天)RARβ激动剂AC261066是否能缓解糖尿病的HFD喂食的小鼠的高血糖症和胰岛素抗性。急性施用AC261066对HF喂食的小鼠的体重、食物和水的摄入没有影响(图31A，B和C)。我们的急性研究显示在给予AC261066后24小时，HDF喂食的小鼠的随机血糖水平显著减少(图31D)，并且在给予AC261066后8天HDF喂食的小鼠显著降低高血糖症和胰岛素抗性(图31E和F)。我们对AC261066的急性代谢研究表明，该RARβ激动剂能急性地改善高血糖症和胰岛素，其与长期施用RARβ激动剂所观察到的那些一样有效。一个或多个这类基因(例如在下面的表5中列出的)的表达分布型可为可用于指导本发明的治疗方案和剂量的疗效果指标。
实施例21-某些实施例的方法。
小鼠、饮食和药物处理。饮食性肥胖研究：野生型（wt）雄性C57/BL6雄性小鼠用具有13% kcal脂肪的标准实验室chow喂食饮食（Con）(diet# 5053, Lab Diet, Inc, St.Louis, MO)，或具有45% kcal脂肪的高脂肪，西方类型饮食（HFD）(diet #58126, LabDiet, Inc., St. Louis, MO)喂养4个月。在开始HFD处理后一个月，HFD组进一步分为3个额外的组达4个月：i) 用Con或HFD和含有1%DMSO的饮用水喂养；ii) Con或HFD和含有在1%DMSO中的3.0 mg/100ml AC261066，一种特异性RARβ激动剂的饮用水；iii) Con或HFD和含有在1% DMSO中的3.0 mg/100ml AC55649，另一种特异性RARβ激动剂的饮用水。所有小鼠用它们的饮食喂养4个月。在4个月后，小鼠经历代谢研究并随后通过颈脱位法处死组织在-70℃快速冷冻用于未来的RNA分离和组织学研究。
遗传性肥胖小鼠的研究：Lep-ob和Lepr-db小鼠通常被分别称为ob/ob (stock #000632, Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) 和db/db (stock #000642, JacksonLabs, Bar Harbor, Maine)小鼠。ob/ob和db/db小鼠是来普汀(leptin，ob)或来普汀受体(leptin receptor，db)基因的纯合敲除小鼠。ob/ob和db/db小鼠二者都是在C57BL/6J背景种类中发展，这两个遗传改变导致，在当喂食标准实验室chow饮食时，在4-5周龄时自发的肥胖发展。
5周龄雄性ob/ob (n=6)和db/db (n=6)小鼠使用12小时的光暗周期圈养，并自由取食标准的实验室chow-喂食饮食(Con，其中13％kcal脂肪) (diet# 5053, Lab Diet,Inc, St. Louis, MO) 和饮用水。一周后ob/ob和db/db小鼠被随机分组，接受：i)对照饮食及含1％DMSO饮用水(n=3)；或ii)对照饮食用及含有3.0毫克/100毫升AC261066的饮用水。所有小鼠用其饮食喂养8周。8周后对所有小鼠进行代谢研究，然后通过颈椎脱位处死，组织在-70℃快速冷冻用于将来RNA分离和组织学研究。
代谢的测量 - 如前所述使用腹腔注射葡萄糖耐受检验(GTT)进行葡萄糖耐受(Trasino等, Vitamin A Deficiency Causes Hyperglycemia and Loss of Pancreaticβ-Cell Mass, J Biol Chem. 2014 Dec 1. pii: jbc.M114.616763)。小鼠禁食过夜后腹膜内注射含有50％葡萄糖的PBS(每组n=3-5，2.0g葡萄糖/kg体重)。注射后15，30，45，60，和120分钟收集尾静脉血液，用于用FreeStyle Lite血糖监测系统(Abbott Diabetes Care,Inc. Alameda, CA)测量葡萄糖。如前所述进行胰岛素耐量检验(ITT)(Trasino等,Vitamin A Deficiency Causes Hyperglycemia and Loss of Pancreatic β-Cell Mass,J Biol Chem. 2014 Dec 1. pii: jbc.M114.616763)。将小鼠禁食4小时，接着腹膜内注射胰岛素(Humulin R; Eli Lilly, 2U/kg 体重)。注射后20，40，60，和120分钟用FreeStyleLite血糖监测系统(Abbott Diabetes Care, Inc. Alameda, CA)测量尾静脉血液葡萄糖。为了确定对葡萄糖的胰岛素分泌应答，在葡萄糖注射后0－60分钟内分离血清部分并使用超灵敏胰岛素ELISA试剂盒测量胰岛素浓度(Alpco, Inc. Salem, NH)。随机血糖的测量在每天的2-3个随机时间点从每组4只小鼠的尾静脉采集，并表述为平均值±平均值的标准误差（S.E.M），P值用单因素方差分析接着Bonferroni事后分析（Bonferroni post-hocanalysis）来计算。
免疫荧光和免疫染色显微术 - 石蜡包埋的胰腺组织切片与抗胰岛素抗体一起孵育(小鼠单克隆1：300，＃1061，Beta Cell Biology Consortium)。我们利用Alexa-fluor488缀合的抗小鼠二抗(1:500) (Invitrogen, Carlsbad, CA)来免疫荧光标记胰岛素，随后使用Nikon TE2000倒置荧光显微镜(Nikon, Inc)可视化。
胰腺胰岛素测量 - 胰腺胰岛素水平使用超灵敏胰岛素ELISA试剂盒(Alpco,Inc. Salem, NH)在胰腺组织裂解物中测量。胰岛素浓度针对按制造商说明书使用DC蛋白测定法(Bio-Rad, Inc. Hercules, CA)测定的胰腺蛋白浓度标准化。内分泌激素的水平表述为平均值±平均值的标准误差(S.E.M)，P值用单因素方差分析接着Bonferroni多重比较检验事后分析来计算。
RNA分离和cDNA合成 – 使用RNeasy mini kits (Qiagen, Valencia, CA)从整个胰腺和小肠匀浆液中分离总RNA，用Nano Drop 2000分光光度计(Thermo Scientific,Wilmington, DE)定量。使用总RNA(2微克)用随机引物使用qScript cDNA 合成试剂盒(Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD)合成cDNA。
胰腺内分泌细胞质量（cell mass）的测量 – 如前所述使用直接点计数法测定胰腺内分泌细胞质量。使用Nikon TE2000倒置荧光显微镜(Nikon, Inc.)对每只小鼠的100-200胰岛素阳性区域拍照，并通过使用以下公式分析β-细胞，前述公式为：β-细胞质量(毫克)=总胰岛素阳性胰岛面积(平方微米)/总的胰腺组织面积(平方微米)×胰腺组织重量(毫克)。内分泌细胞质量报告为平均值±平均值的标准误差(S.E.M.)，并且P值用单因素方差分析接着Bonferroni多重比较检验事后分析来计算。
组织甘油三酯分析：用Folch法提取组织总脂质。简而言之，用氯仿：甲醇(2:1)从组织匀浆液的等分试样中提取总脂质，并使用dH2O分配。在氮气下蒸发含脂质的有机相溶剂，并重新悬浮在0.5％(v/v) Triton X-100水溶液中。组织甘油三酯按照制造商说明用甘油三酯试剂盒(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)经酶测定。组织甘油三酯针对组织蛋白浓度标准化并报告为平均值±平均值的标准误差(S.E.M)，并且P值用单因素方差分析接着Bonferroni多重比较检验事后分析来计算。
定量RT-PCR (Q-PCR) –Q-PCR使用SYBR Green PCR master mix在Bio-Rad MyiQ2Real Time PCR iCycler (Bio-Rad，Inc. Hercules, CA)上进行。用基因特异性引物(表5)扩增mRNA靶基因，其针对Hprt内部对照基因标准化。分析来自每个实验组的3-5只小鼠的cDNA的相对mRNA变化倍数，其使用Pfaffl方法计算(Pfaffl MW, A new mathematicalmodel for relative quantification in real-time RT-PCR, Nucleic Acids Res.2001 May 1;29(9):e45)。相对基因表达值报道为平均值±平均值的标准误差(S.E.M)，并且P值用单因素方差分析接着Bonferroni多重比较检验事后分析来计算。
表 5. 基因表达的引物
Figure DEST_PATH_IMAGE020
Figure DEST_PATH_IMAGE021
实施例22-维甲酸受体β(RARβ)激动剂减少高脂肪糖尿病模型中饮食诱导体重增加和葡萄糖不耐受。三个月的HF脂肪(45%Kcal/脂肪)喂食导致与对照喂食的小鼠相比体重显著增加(图32A)。然而与HF-喂食的小鼠相比，用AC261066或AC55649处理3个月的HF-喂食的小鼠的体重减少大约10%(图32A)。代谢研究表明，RARβ激动剂AC261066和AC55649的水给予在HF-喂食的小鼠中导致改善的葡萄糖耐受和在葡萄糖曲线下的面积(图32B，C)。相比于对照喂食的小鼠，HF喂食的小鼠的血糖水平在过夜禁食后没有变化，这暗示受损的胰岛素信号通路和外周胰岛素抗性(图32D)。用AC261066或AC55649处理的HD喂食的小鼠过夜禁食的葡萄糖水平显著降低(图32D)。总的来说，这些数据表明，在HF-喂食的小鼠中给予特异性RARβ激动剂AC261066和AC55649达3个月可以降低体重和缓解受损的葡萄糖耐受。这些研究表明AC261066或AC55649可基于在喂食至禁食过夜的血糖水平的显著减少导致改善的肝和过多的肝葡萄糖和胰岛素代谢
方法。RARβ 激动剂溶液的制备。AC261066和AC55649以3.0毫克/毫升的浓度溶解于二甲基亚砜(DMSO)，并在小鼠的饮用水中稀释至3.0毫克/100毫升的最终浓度。小鼠、饮食和药物处理。Wt雄性C57/BL6雄性小鼠用具有13% kcal脂肪的标准实验室chow喂食饮食（Con）(diet# 5053, Lab Diet, Inc, St. Louis, MO, [n=4])，或具有45% kcal脂肪的高脂肪，西方类型饮食（HFD）(diet #58126, Lab Diet, Inc., St. Louis, MO)喂养3个月。在开始HFD处理后两周，HFD组进一步分为3组达3个月：i) HFD和含有1%DMSO的饮用水（n=5）；ii) 高脂肪饮食（HFD）和含有3.0 mg/100ml AC261066，一种特异性RARβ激动剂的饮用水（n=5）；iii) HFD和含有3.0 mg/100ml AC55649，一种特异性RARβ激动剂的饮用水（n=4）。在3个月后用腹膜内葡萄糖耐受检验(GTT)测试小鼠的葡萄糖不耐受。小鼠随后通过颈脱位法处死。收集血液和多种组织样本。
葡萄糖耐受检验(GTT)。葡萄糖耐受使用腹膜内葡萄糖耐受检验(GTT)进行。小鼠禁食过夜(大约16小时)接着腹膜内注射含有50％葡萄糖的PBS(每组n=3-5，2.0g葡萄糖/kg体重)。注射后15，30，45，60，和120分钟收集尾静脉血液，用于用FreeStyle Lite血糖监测系统(Abbott Diabetes Care, Inc. Alameda, CA)测量葡萄糖。随机和禁食血糖的测量在每天的2-3个随机时间点或刚好在GTT之前从每组4只小鼠的尾静脉采集，并表述为平均值±平均值的标准误差（S.E.M），P值用单因素方差分析接着Bonferroni事后分析来计算。使用Grubbs’最大正常残余检验检测一个或多个离群值。
实施例23 - 维甲酸受体β(RARβ)激动剂AC261066改变肥胖和糖尿病模型中涉及脂质代谢和炎症的基因肾表达。糖尿病性肾病(又名糖尿病肾病，diabetic nephropathy(DN))在患有2型糖尿的个体中经常发生。DN的原因未知，但胰岛素抗性，高脂血症和肥胖症与之有关，因为这些状态可损害肾脂质代谢，导致游离脂肪酸(FFA)的累积，其可促进肾炎症，纤维化和受损的肾功能。有证据表明，涉及脂质重新合成的转录因子，例如srebp1，促进DN的病理发展。因此，我们测量了参与脂质重新合成的基因(SREBP1，FASN)和脂质β氧化(分解代谢)的基因(PPAR-α和CPT1-α)的肾mRNA转录水平，并发现与wt对照喂食的小鼠相比，HFD-喂食的小鼠的SREBP1和FASN的肾mRNA水平上升了4-5倍(图33A)。用AC261066处理的HF-喂食的小鼠的SREBP1和FASN的肾mRNA转录产物并没增加(图33A)。我们还发现，与HFD-喂食的小鼠相比，PPAR-α和CPT1-αmRNA转录产物在用AC261066处理的HF-喂食的小鼠中增加大约2倍 (图33A)。
我们还测量了HFD喂食的小鼠和两种遗传性肥胖和患糖尿病小鼠模型，Ob/Ob和Db/Db小鼠中促炎性和形成纤维的介质MCP-1(又名CCL2)、TNF-α和α-SMA的肾mRNA水平。MCP-1、TNF-α和α-SMA与DN中的炎症和纤维化有关，这些基因的表达在DN模型中常常升高。我们的PCR分析的结果显示，与wt con小鼠相比，HFD-喂食的，Ob/Ob和Db/Db小鼠在MCP-1(图33B)和TNF-α(图33C，E)的mRNA水平上分别具有4-8倍和20-30倍的增加(图33B，33C)。与HFD，Ob/Ob和Db/Db小鼠相比，我们发现用AC261066处理的HFD，Ob/Ob和Db/Db小鼠的MCP-1(图33B)和TNF-α(图33C，E)的肾mRNA转录产物分别降低40-50%。与wt con相比，HFD Ob/Ob和Db/Db小鼠的α-SMA的肾mRNA转录产物，其促进DN纤维化，增加5-6倍(图33D)。用AC261066处理的HFD Ob/Ob和Db/Db小鼠相对于其各自的HFD和遗传对照，α-SMA的转录产物降低40-50%(图33D)。
维甲酸受体β(RARβ)激动剂降低产生纤维的肾星状细胞的激活。尽管我们观察到α-SMA的mRNA转录产物显著增加，我们测量了在产生纤维的肾星状细胞中α-SMA的肾蛋白表达。肾星状细胞（RSCs）为定居肾的成纤维细胞，其响应于炎症，经历分化以“激活”分泌收缩性蛋白例如α-SMA的成肌纤维细胞。休眠的RSCs不表达α-SMA，但未经检查的RSCs激活和α-SMA分泌促进肾纤维化和DN的病理发生。RSCs表达间充质蛋白标志物波形蛋白。我们使用双免疫荧光标记RSCs并确定表达产生纤维的蛋白α-SMA的激活的RSCs的百分比。使用以类似人类的方式自发产生糖尿病和DN的Db/Db小鼠，我们检测到与wt con小鼠相比，激活的α-SMA阳性RSCs增加超过4倍(图33F，G)。用AC261066处理4周的Db/Db小鼠的α-SMA阳性RSCs下降了超过50％(图33F，G)。
与我们对参与脂质代谢，炎症和纤维产生的基因的PCR分析结合，我们的免疫荧光研究表明在三种饮食性和遗传性肥胖和2型糖尿病模型中，用RARβ激动剂AC261066处理导致肾基因和蛋白表达模式与肾脂毒性，炎症和纤维化，以及发生DN的风险的降低一致。
方法。免疫荧光和免疫染色显微术 - 石蜡包埋的胰腺组织切片与抗胰岛素抗体(小鼠单克隆1：300，＃1061，Beta Cell Biology Consortium)、抗波形蛋白抗体(兔多克隆1：500，Santa Cruz)或抗α-SMA抗体(小鼠单克隆，1:1000, Dako, Inc)一起孵育。
我们利用Alexa-fluor 488缀合的抗小鼠二抗(1:500) (Invitrogen, Carlsbad,CA)免疫荧光标记胰岛素，随后使用Nikon TE2000倒置荧光显微镜(Nikon, Inc)可视化。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似或等同于本文描述的方法和材料的任何方法和材料可以用于本发明的实践或检验，但是优选的方法，设备和材料是本文所描述的。本文提及的所有出版物藉此通过引用以其整体并入此文，目的是描述和公开在这些文献中报道的可与本发明联合使用的材料和方法。
参考文献
1. Guariguata L, Whiting D, Weil C, Unwin N. The InternationalDiabetes Federation diabetes atlas methodology for estimating global andnational prevalence of diabetes in adults. Diabetes research and clinicalpractice2011 Dec;94(3):322-32.
2. Whiting DR, Guariguata L, Weil C, Shaw J. IDF diabetes atlas:global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetesresearch and clinical practice. [Research Support, Non-U.S. Gov't]. 2011 Dec;94(3):311-21.
3. Huang ES, Basu A, O'Grady M, Capretta JC. Projecting the futurediabetes population size and related costs for the U.S. Diabetes Care.[Research Support, N.I.H., Extramural Research Support, Non-U.S. Gov't]. 2009Dec;32(12):2225-9.
4. Oliver-Krasinski JM, Stoffers DA. On the origin of the beta cell.Genes & development. [Research Support, N.I.H., Extramural Review]. 2008 Aug1;22(15):1998-2021.
5. Waldron-Lynch F, Herold KC. Immunomodulatory therapy to preservepancreatic beta-cell function in type 1 diabetes. Nature reviews Drugdiscovery. [Review]. 2011 Jun;10(6):439-52.
6. Waldron-Lynch F, von Herrath M, Herold KC. Towards a curativetherapy in type 1 diabetes: remission of autoimmunity, maintenance andaugmentation of beta cell mass. Novartis Foundation symposium2008;292:146-55;discussion 55-8, 202-3.
7. Charbonnel B, Penfornis A, Varroud-Vial M, Kusnik-Joinville O,Detournay B. Insulin therapy for diabetes mellitus: Treatment regimens andassociated costs. Diabetes & metabolism2011 Dec 13.
8. Soria B, Andreu E, Berná G, Fuentes E, Gil A, León-Quinto T, Martín F, Montanya E, Nadal A, Reig JA, Ripoll C, Roche E, Sanchez-Andrés JV,Segura J. Engineering pancreatic islets. Pflügers Archiv - European Journalof Physiology2000;440(1):1-18.
9. Zaret KS, Grompe M. Generation and regeneration of cells of theliver and pancreas. Science. [Research Support, N.I.H., Extramural ResearchSupport, Non-U.S. Gov't Review]. 2008 Dec 5;322(5907):1490-4.
10. Weir GC, Cavelti-Weder C, Bonner-Weir S. Stem cell approaches fordiabetes: towards beta cell replacement. Genome medicine2011;3(9):61.
11. Sui J, Mehta M, Shi B, Morahan G, Jiang FX. DirectedDifferentiation of Embryonic Stem Cells Allows Exploration of NovelTranscription Factor Genes for Pancreas Development. Stem cell reviews2012Jan 26;1(1):1-10.
12. Ben-Yehudah A, White C, Navara CS, Castro CA, Ize-Ludlow D,Shaffer B, Sukhwani M, Mathews CE, Chaillet JR, Witchel SF. Evaluatingprotocols for embryonic stem cell differentiation into insulin-secretingbeta-cells using insulin II-GFP as a specific and noninvasive reporter.Cloning Stem Cells2009 Jun;11(2):245-57.
13. Blyszczuk P, Czyz J, Kania G, Wagner M, Roll U, St-Onge L, WobusAM. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation ofnestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci US A. [Research Support, Non-U.S. Gov't]. 2003 Feb 4;100(3):998-1003.
14. Borowiak M, Maehr R, Chen S, Chen AE, Tang W, Fox JL, SchreiberSL, Melton DA. small molecules efficiently direct endodermal differentiationof mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell2009 Apr 3;4(4):348-58.
15. D'Amour KA, Bang AG, Eliazer S, Kelly OG, Agulnick AD, smart NG,Moorman MA, Kroon E, Carpenter MK, Baetge EE. Production of pancreatichormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. NatBiotechnol. [Research Support, Non-U.S. Gov't]. 2006 Nov;24(11):1392-401.
16. Kroon E, Martinson LA, Kadoya K, Bang AG, Kelly OG, Eliazer S,Young H, Richardson M, smart NG, Cunningham J, Agulnick AD, D'Amour KA,Carpenter MK, Baetge EE. Pancreatic endoderm derived from human embryonicstem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. NatBiotechnol2008 Apr;26(4):443-52.
17. Micallef SJ, Janes ME, Knezevic K, Davis RP, Elefanty AG, StanleyEG. Retinoic acid induces Pdx1-positive endoderm in differentiating mouseembryonic stem cells. Diabetes2005 Feb;54(2):301-5.
18. Laursen KB, Wong PM, Gudas LJ. Epigenetic regulation by RARalphamaintains ligand-independent transcriptional activity. Nucleic acidsresearch2012 Jan;40(1):102-15.
19. Jaramillo M, Banerjee I. Endothelial cell co-culture mediatesmaturation of human embryonic stem cell to pancreatic insulin producing cellsin a directed differentiation approach. J Vis Exp2012(61).
20. Chen Y, Pan FC, Brandes N, Afelik S, Solter M, Pieler T. Retinoicacid signaling is essential for pancreas development and promotes endocrineat the expense of exocrine cell differentiation in Xenopus. Developmentalbiology. [Comparative Study Research Support, Non-U.S. Gov't]. 2004 Jul 1;271(1):144-60.
21. Ostrom M, Loffler KA, Edfalk S, Selander L, Dahl U, Ricordi C,Jeon J, Correa-Medina M, Diez J, Edlund H. Retinoic acid promotes thegeneration of pancreatic endocrine progenitor cells and their furtherdifferentiation into beta-cells. PLoS One. [Research Support, Non-U.S. Gov't]. 2008;3(7):e2841.
22. Matthews KA, Rhoten WB, Driscoll HK, Chertow BS. Vitamin Adeficiency impairs fetal islet development and causes subsequent glucoseintolerance in adult rats. The Journal of nutrition. [Research Support, U.S.Gov't, P.H.S.]. 2004 Aug;134(8):1958-63.
23. Chertow BS, Blaner WS, Baranetsky NG, Sivitz WI, Cordle MB,Thompson D, Meda P. Effects of vitamin A deficiency and repletion on ratinsulin secretion in vivo and in vitro from isolated islets. J Clin Invest.[In Vitro Research Support, Non-U.S. Gov't Research Support, U.S. Gov't,P.H.S.]. 1987 Jan;79(1):163-9.
24. Dodge R, Loomans C, Sharma A, Bonner-Weir S. Developmentalpathways during in vitro progression of human islet neogenesis.Differentiation. [Research Support, N.I.H., Extramural Research Support, Non-U.S. Gov't]. 2009 Feb;77(2):135-47.
25. Dolle P, Ruberte E, Leroy P, Morriss-Kay G, Chambon P. Retinoicacid receptors and cellular retinoid binding proteins. I. A systematic studyof their differential pattern of transcription during mouse organogenesis.Development. [Research Support, Non-U.S. Gov't]. 1990 Dec;110(4):1133-51.
26. Ghyselinck NB, Dupe V, Dierich A, Messaddeq N, Garnier JM,Rochette-Egly C, Chambon P, Mark M. Role of the retinoic acid receptor beta(RARβ) during mouse development. The International journal of developmentalbiology. [Research Support, Non-U.S. Gov't Research Support, U.S. Gov't,P.H.S.]. 1997 Jun;41(3):425-47.
27. Martinez-Ceballos E, Gudas LJ. Hoxa1 is required for the retinoicacid-induced differentiation of embryonic stem cells into neurons. Journal ofneuroscience research. [Research Support, N.I.H., Extramural]. 2008 Oct;86(13):2809-19.
28. Martinez-Ceballos E, Chambon P, Gudas LJ. Differences in geneexpression between wild type and Hoxa1 knockout embryonic stem cells afterretinoic acid treatment or leukemia inhibitory factor (LIF) removal. TheJournal of biological chemistry. [Research Support, N.I.H., ExtramuralResearch Support, U.S. Gov't, P.H.S.]. 2005 Apr 22;280(16):16484-98.
29. Benoit YD, Lussier C, Ducharme PA, Sivret S, Schnapp LM, BasoraN, Beaulieu JF. Integrin alpha8beta1 regulates adhesion, migration andproliferation of human intestinal crypt cells via a predominant RhoA/ROCK-dependent mechanism. Biology of the cell / under the auspices of the EuropeanCell Biology Organization. [Research Support, Non-U.S. Gov't]. 2009 Dec;101(12):695-708.
30.30. Benoit YD, Pare F, Francoeur C, Jean D, Tremblay E, BoudreauF, Escaffit F, Beaulieu JF. Cooperation between HNF-1alpha, Cdx2, and GATA-4in initiating an enterocytic differentiation program in a normal humanintestinal epithelial progenitor cell line. American journal of physiologyGastrointestinal and liver physiology. [Research Support, Non-U.S. Gov't].2010 Apr;298(4):G504-17.
31. Auclair BA, Benoit YD, Rivard N, Mishina Y, Perreault N. Bonemorphogenetic protein signaling is essential for terminal differentiation ofthe intestinal secretory cell lineage. Gastroenterology2007 Sep;133(3):887-96.
32. Yoshino J, Mills KF, Yoon MJ, Imai S. Nicotinamidemononucleotide, a key NAD(+) intermediate, treats the pathophysiology ofdiet- and age-induced diabetes in mice. Cell Metab2011 Oct 5;14(4):528-36.
33. Spokoini R, Kfir-Erenfeld S, Yefenof E, Sionov RV. Glycogensynthase kinase-3 plays a central role in mediating glucocorticoid-inducedapoptosis. Mol Endocrinol2010 Jun;24(6):1136-50.
34. Yamaguchi TP, Takada S, Yoshikawa Y, Wu N, McMahon AP. T(Brachyury) is a direct target of Wnt3a during paraxial mesodermspecification. Genes & development1999 Dec 15;13(24):3185-90.
35. Otonkoski T, Beattie GM, Mally MI, Ricordi C, Hayek A.Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in culturedhuman fetal pancreatic cells. J Clin Invest1993 Sep;92(3):1459-66.
36. Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, Velasco I, Ravin R, McKay R.Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structuressimilar to pancreatic islets. Science. [Research Support, Non-U.S. Gov't].2001 May 18;292(5520):1389-94.
37. Marchand M, Schroeder IS, Markossian S, Skoudy A, Negre D, CossetFL, Real P, Kaiser C, Wobus AM, Savatier P. Mouse ES cells over-expressingthe transcription factor NeuroD1 show increased differentiation towardsendocrine lineages and insulin-expressing cells. The International journal ofdevelopmental biology. [Research Support, Non-U.S. Gov't]. 2009;53(4):569-78.
38. Langton S, Gudas LJ. CYP26A1 knockout embryonic stem cellsexhibit reduced differentiation and growth arrest in response to retinoicacid. Developmental biology. [Research Support, N.I.H., Extramural ResearchSupport, U.S. Gov't, Non-P.H.S.]. 2008 Mar 15;315(2):331-54.
39. Soria B. In-vitro differentiation of pancreatic beta-cells.Differentiation2001 Oct;68(4-5):205-19.
40. Van Hoof D, D'Amour KA, German MS. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem cell research.[Research Support, Non-U.S. Gov't
Review]. 2009 Sep-Nov;3(2-3):73-87.
41. Bernardo AS, Hay CW, Docherty K. Pancreatic transcription factorsand their role in the birth, life and survival of the pancreatic beta cell.Mol Cell Endocrinol2008 Nov 6;294(1-2):1-9.
42. Kashyap V, Rezende NC, Scotland KB, Shaffer SM, Persson JL, GudasLJ, Mongan NP. Regulation of stem cell pluripotency and differentiationinvolves a mutual regulatory circuit of the NANOG, OCT4, and SOX2pluripotency transcription factors with polycomb repressive complexes andstem cell microRNAs. Stem cells and development2009 Sep;18(7):1093-108.
43. Rukstalis JM, Habener JF. Neurogenin3: a master regulator ofpancreatic islet differentiation and regeneration. Islets2009 Nov-Dec;1(3):177-84.
44. Gosmain Y, Katz LS, Masson MH, Cheyssac C, Poisson C, Philippe J.Pax6 is crucial for beta-cell function, insulin biosynthesis, and glucose-induced insulin secretion. Mol Endocrinol. [Research Support, Non-U.S. Gov't]. 2012 Apr;26(4):696-709.
45. Ahlgren U, Pfaff SL, Jessell TM, Edlund T, Edlund H. Independentrequirement for ISL1 in formation of pancreatic mesenchyme and islet cells.Nature. [Research Support, Non-U.S. Gov't]. 1997 Jan 16;385(6613):257-60.
46. Naujok O, Francini F, Picton S, Bailey CJ, Lenzen S, Jorns A.Changes in gene expression and morphology of mouse embryonic stem cells ondifferentiation into insulin-producing cells in vitro and in vivo. DiabetesMetab Res Rev2009 Jul;25(5):464-76.
47. Gasa R, Mrejen C, Leachman N, Otten M, Barnes M, Wang J,Chakrabarti S, Mirmira R, German M. Proendocrine genes coordinate thepancreatic islet differentiation program in vitro. Proc Natl Acad Sci U SA2004 Sep 7;101(36):13245-50.
48. Steiner DF, Cunningham D, Spigelman L, Aten B. Insulinbiosynthesis: evidence for a precursor. Science1967 Aug 11;157(3789):697-700.
49. Daly ME, Vale C, Walker M, Littlefield A, Alberti KG, Mathers JC.Acute effects on insulin sensitivity and diurnal metabolic profiles of ahigh-sucrose compared with a high-starch diet. Am J Clin Nutr1998 Jun;67(6):1186-96.
50. Cryer PE, Axelrod L, Grossman AB, Heller SR, Montori VM, SeaquistER, Service FJ. Evaluation and management of adult hypoglycemic disorders: anEndocrine Society Clinical Practice Guideline. The Journal of clinicalendocrinology and metabolism2009 Mar;94(3):709-28.
51. Cai J, Yu C, Liu Y, Chen S, Guo Y, Yong J, Lu W, Ding M, Deng H.Generation of homogeneous PDX1(+) pancreatic progenitors from human ES cell-derived endoderm cells. J Mol Cell Biol. [Research Support, Non-U.S. Gov't].2010 Feb;2(1):50-60.
52. Jonsson J, Carlsson L, Edlund T, Edlund H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature1994 Oct 13;371(6498):606-9.
53. Fujimoto K, Polonsky KS. Pdx1 and other factors that regulatepancreatic beta-cell survival. Diabetes, obesity & metabolism2009 Nov;11Suppl 4:30-7.
54. Dalgin G, Ward AB, Hao le T, Beattie CE, Nechiporuk A, Prince VE.Zebrafish mnx1 controls cell fate choice in the developing endocrinepancreas. Development2011 Nov;138(21):4597-608.
55. Vetere A, Marsich E, Di Piazza M, Koncan R, Micali F, Paoletti S.Neurogenin3 triggers beta-cell differentiation of retinoic acid-derivedendoderm cells. The Biochemical journal2003 May 1;371(Pt 3):831-41.
56. Dohrmann C, Gruss P, Lemaire L. Pax genes and the differentiationof hormone producing endocrine cells in the pancreas. Mech Dev2000 Mar 15;92(1):47-54.
57. American Diabetes A. Diagnosis and classification of diabetesmellitus. Diabetes Care2005 Jan;28 Suppl 1:S37-42.
58.58. Del Prato S, Marchetti P. Beta- and alpha-cell dysfunction intype 2 diabetes. Horm Metab Res2004 Nov-Dec;36(11-12):775-81.
59. Riserus U, Willett WC, Hu FB. Dietary fats and prevention of type2 diabetes. Prog Lipid Res2009 Jan;48(1):44-51.
60. Sirchia SM, Ren M, Pili R, Sironi E, Somenzi G, Ghidoni R, TomaS, Nicolo G, Sacchi N. Endogenous reactivation of the RARβ2 tumor suppressorgene epigenetically silenced in breast cancer. Cancer research2002 May 1;62(9):2455-61.
61. Youssef EM, Estecio MR, Issa JP. Methylation and regulation ofexpression of different retinoic acid receptor beta isoforms in human coloncancer. Cancer Biol Ther2004 Jan;3(1):82-6.
62. House MG, Herman JG, Guo MZ, Hooker CM, Schulick RD, Lillemoe KD,Cameron JL, Hruban RH, Maitra A, Yeo CJ. Aberrant hypermethylation of tumorsuppressor genes in pancreatic endocrine neoplasms. Ann Surg2003 Sep;238(3):423-31; discussion 31-2.
63. Sato N, Fukushima N, Hruban RH, Goggins M. CpG island methylationprofile of pancreatic intraepithelial neoplasia. Mod Pathol2008 Mar;21(3):238-44.
64. Volkmar M, Dedeurwaerder S, Cunha DA, Ndlovu MN, Defrance M,Deplus R, Calonne E, Volkmar U, Igoillo-Esteve M, Naamane N, Del Guerra S,Masini M, Bugliani M, Marchetti P, Cnop M, Eizirik DL, Fuks F. DNAmethylation profiling identifies epigenetic dysregulation in pancreaticislets from type 2 diabetic patients. EMBO J2012 Mar 21;31(6):1405-26.
65.65. Lund, B. W.; Piu, F.; Gauthier, N. K.; Eeg, A.; Currier, E.;Sherbukhin,V.; Brann, M. R.; Hacksell, U.; Olsson, R. Discovery of a Potent,Orally Available, and Isoform-Selective Retinoic Acid beta2 Receptor Agonist.J. Med. Chem. 2005, 48, 7517–7519
66. Vivat-Hannah V et al, Synergistic Cytotoxicity Exhibited byCombination Treatment of Selective Retinoid Ligands with Taxol (Paclitaxel).Cancer Res. 2001, 61, 8703-8711.
67. Millikan LE, Adapalene: an update on newer comparative studiesbetween the various retinoids. Int.J.Dermatol..2000, 39, 784-88.
68. Chen JY et al (1995) RAR-specific agonist/antagonists whichdissociate transactivation and AP1 transrepression inhibit anchorage-independent cell proliferation. EMBO J. 1995, 14, 1187-97.
69. Lazo M, Hernaez R, Eberhardt MS, Bonekamp S, Kamel I, Guallar E,Koteish A, Brancati FL, Clark JM.Prevalence of nonalcoholic fatty liverdisease in the United States: the Third National Health and NutritionExamination Survey, 1988-1994. Am J Epidemiol. 2013; 1:38-45.
70. Loomba R, Sanyal AJ. The global NAFLD epidemic. Nat RevGastroenterol Hepatol. 2013; 11:686-90.
71. Baffy G, Brunt EM, Caldwell SH.Hepatocellular carcinoma in non-alcoholic fatty liver disease: an emerging menace. J Hepatol. 2012;6:1384-91.
72. Reeves HL, Friedman SL. Activation of hepatic stellate cells--akey issue in liver fibrosis. Front Biosci. 2002;7:808-26
73. Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Hepatic stellate cells and liverfibrosis. Compr Physiol. 2013;4):1473-92.
74. Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, andfunctions of quiescent hepatic stellate cells. Semin. Liver Dis. 2001;21:311–335
75. Brun PJ, Yang KJ, Lee SA, Yuen JJ, Blaner WS. Retinoids: Potentregulators of metabolism. Biofactors. 2013 2):151-63.
76. (CDC) CfDCaP. Vital signs: prevalence, treatment, and control ofhigh levels of low-density lipoprotein cholesterol--United States, 1999-2002and 2005-200. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2011;60(4):109-14. PubMed PMID:21293326.
77. Martin SS, Abd TT, Jones SR, Michos ED, Blumenthal RS, Blaha MJ.2013 American Cholesterol Treatment Guideline: What Was Done Well and WhatCould Be Done Better. J Am Coll Cardiol. 2014. doi: 10.1016/j.jacc.2014.02.578. PubMed PMID: 24681146.
78. Mampuya WM, Frid D, Rocco M, Huang J, Brennan DM, Hazen SL, ChoL. Treatment strategies in patients with statin intolerance: the ClevelandClinic experience. Am Heart J. 2013;166(3):597-603. doi: 10.1016/j.ahj.2013.06.004. PubMed PMID: 24016512.
79. Brun PJ, Yang KJ, Lee SA, Yuen JJ, Blaner WS. Retinoids: Potentregulators of metabolism. Biofactors. 2013;39(2):151-63. doi: 10.1002/biof.1056. PubMed PMID: 23281051; PubMed Central PMCID: PMCPMC3620893.
80. Tang XH, Gudas LJ. Retinoids, retinoic acid receptors, andcancer. Annu Rev Pathol. 2011;6:345-64. doi: 10.1146/annurev-pathol-011110-130303. PubMed PMID: 21073338.
81. Baldwin HE, Nighland M, Kendall C, Mays DA, Grossman R, NewburgerJ. 40 years of topical tretinoin use in review. J Drugs Dermatol. 2013;12(6):638-42. PubMed PMID: 23839179.
82. Ellis CN, Swanson NA, Grekin RC, Goldstein NG, Bassett DR,Anderson TF, Voorhees JJ. Etretinate therapy causes increases in lipid levelsin patients with psoriasis. Arch Dermatol. 1982;118(8):559-62. PubMed PMID:7103524.
83. Lyons F, Laker MF, Marsden JR, Manuel R, Shuster S. Effect oforal 13-cis-retinoic acid on serum lipids. Br J Dermatol. 1982;107(5):591-5.PubMed PMID: 6215057.
84. Marsden J. Hyperlipidaemia due to isotretinoin and etretinate:possible mechanisms and consequences. Br J Dermatol. 1986;114(4):401-7.PubMed PMID: 3516195.
85. Barth JH, Macdonald-Hull SP, Mark J, Jones RG, Cunliffe WJ.Isotretinoin therapy for acne vulgaris: a re-evaluation of the need formeasurements of plasma lipids and liver function tests. Br J Dermatol. 1993;129(6):704-7. PubMed PMID: 8286255.
86. Amengual J, Ribot J, Bonet ML, Palou A. Retinoic acid treatmentenhances lipid oxidation and inhibits lipid biosynthesis capacities in theliver of mice. Cell Physiol Biochem. 2010;25(6):657-66. doi: 10.1159/000315085. PubMed PMID: 20511711.
87. Kim SC, Kim CK, Axe D, Cook A, Lee M, Li T, smallwood N, ChiangJY, Hardwick JP, Moore DD, Lee YK. All-trans-retinoic acid ameliorateshepatic steatosis in mice by a novel transcriptional cascade. Hepatology.2013. doi: 10.1002/hep.26699. PubMed PMID: 24038081.
88. Lund BW, Piu F, Gauthier NK, Eeg A, Currier E, Sherbukhin V,Brann MR, Hacksell U, Olsson R. Discovery of a potent, orally available, andisoform-selective retinoic acid beta2 receptor agonist. J Med Chem. 2005;48(24):7517-9. doi: 10.1021/jm050891r. PubMed PMID: 16302793.
89. Thacher SM, Vasudevan J, Chandraratna RA. Therapeuticapplications for ligands of retinoid receptors. Curr Pharm Des. 2000;6(1):25-58. PubMed PMID: 10637371.
90. Laursen KB, Mongan NP, Zhuang Y, Ng MM, Benoit YD, Gudas LJ.Polycomb recruitment attenuates retinoic acid-induced transcription of thebivalent NR2F1 gene. Nucleic Acids Res. 2013;41(13):6430-43. doi: 10.1093/nar/gkt367. PubMed PMID: 23666625.
91. Buchovercky CM, Turley SD, Brown HM, Kyle SM, McDonald JG, Liu B,Pieper AA, Huang W, Katz DB, Russell DW, Shendure J, Justice MY. A suppressorscreen in Mecp2 mutant mice implicates cholesterol metabolism in Rettsyndrome. Nature Genetics. Sep;45(9):1013-20; Epub 2013 Jul 28.
92. Justice, MJ, Public Research Seminar (A genetic suppressor screenin mice reveals that lipid metabolism is a therapeutic target for RettSyndrome) at Sloan Kettering Institute, May 1, 2014.
Figure IDA0001110955190000011
Figure IDA0001110955190000021
Figure IDA0001110955190000031
Figure IDA0001110955190000041
Figure IDA0001110955190000051
Figure IDA0001110955190000061
Figure IDA0001110955190000071
Figure IDA0001110955190000081
Figure IDA0001110955190000091
Figure IDA0001110955190000101
Figure IDA0001110955190000111
Figure IDA0001110955190000121
Figure IDA0001110955190000131
Figure IDA0001110955190000141
Figure IDA0001110955190000151
Figure IDA0001110955190000161
Figure IDA0001110955190000171
Figure IDA0001110955190000181
Figure IDA0001110955190000191
Figure IDA0001110955190000201
Figure IDA0001110955190000211
Figure IDA0001110955190000221
Figure IDA0001110955190000231
Figure IDA0001110955190000241
Figure IDA0001110955190000251
Figure IDA0001110955190000261
Figure IDA0001110955190000271
Figure IDA0001110955190000281
Figure IDA0001110955190000291
Figure IDA0001110955190000301

Claims (4)

1.维甲酸受体-β(RARβ)激动剂在制备用于降低对其有需要的受试者的胆固醇或甘油三酯水平的药物中的用途，其中所述维甲酸受体-β(RARβ)激动剂为下式表示的AC261066
Figure FDA0002308911530000011
2.权利要求1的用途，其中所述维甲酸受体-β(RARβ)激动剂治疗高脂血症或高甘油三酯血症。
3.权利要求1-2中任一项的用途，其中所述维甲酸受体-β(RARβ)激动剂经口服，静脉或皮下给予。
4.权利要求1-2中任一项的用途，其中给予所述受试者第二药物，其中所述第二药物为另一维甲酸受体-β(RARβ)激动剂。
CN201580012615.9A 2014-01-17 2015-01-16 使用维甲酸受体激动剂治疗代谢综合征相关病况的方法 Active CN106211757B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2014/012083 WO2014113695A1 (en) 2013-01-18 2014-01-17 Methods of treating diseases associated with high fat diet and vitamin a deficiency using retinoic acid receptor agonists
USPCT/US14/12083 2014-01-17
US201461990808P 2014-05-09 2014-05-09
US61/990808 2014-05-09
PCT/US2015/011820 WO2015109231A1 (en) 2014-01-17 2015-01-16 Methods of treating metabolic syndrome related conditions using retinoic acid receptor agonists

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106211757A CN106211757A (zh) 2016-12-07
CN106211757B true CN106211757B (zh) 2022-06-07

Family

ID=53543499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580012615.9A Active CN106211757B (zh) 2014-01-17 2015-01-16 使用维甲酸受体激动剂治疗代谢综合征相关病况的方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US11160769B2 (zh)
EP (1) EP3094380B1 (zh)
CN (1) CN106211757B (zh)
CA (1) CA2937107C (zh)
WO (1) WO2015109231A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2937107C (en) 2014-01-17 2020-12-22 Cornell University Methods of treating metabolic syndrome related conditions using retinoic acid receptor agonists
EP3806839B1 (en) * 2018-06-14 2024-08-07 Cornell University Cornell Center For Technology, Enterprise & Commercialization ("CCTEC") Retinoic acid receptor-beta2 agonist with cardioprotective effects
CN109359833B (zh) * 2018-09-27 2022-05-27 中国石油大学(华东) 一种基于abc-brann模型的海洋平台燃爆风险分析方法
EP4401829A1 (en) * 2021-09-15 2024-07-24 Cornell University Compositions and methods for mitigating alcohol liver disease
CN114392266B (zh) * 2022-01-22 2022-11-15 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院） 包含PPARγ抑制剂的药物组合物及其应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5707798A (en) 1993-07-13 1998-01-13 Novo Nordisk A/S Identification of ligands by selective amplification of cells transfected with receptors
FR2723315B1 (fr) 1994-08-02 1996-10-25 Cird Galderma Procede et composition pour stimuler la differenciation des cellules preadipocytaires et traitements therapeutiques associes
WO1998042340A1 (en) 1997-03-24 1998-10-01 Galderma Research & Development, S.N.C. Retinoid related molecules for the treatment of non-insulin dependent diabetes mellitus
EP0977892A1 (en) * 1997-04-24 2000-02-09 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and compositions for use in modulating expression of matrix metalloproteinase genes
TW558554B (en) 1999-10-29 2003-10-21 Takeda Chemical Industries Ltd Crystals of oxyiminoalkanoic acid derivative
WO2005094333A2 (en) 2004-03-29 2005-10-13 Wyeth Multi-vitamin and mineral nutritional supplements
CN105394748A (zh) * 2005-04-06 2016-03-16 雀巢产品技术援助有限公司 从营养方面改善葡萄糖控制和胰岛素作用的方法和组合物
US20090176837A1 (en) 2005-07-12 2009-07-09 Sony Corporation Compounds with activity at retinoic acid receptors
JP2008081427A (ja) * 2006-09-27 2008-04-10 R&R Inc 分泌障害性疾患の予防及び／又は治療のための医薬
WO2008064136A2 (en) 2006-11-17 2008-05-29 Acadia Pharmaceuticals Inc. Compounds with activity at retinoic acid receptors
US8236855B2 (en) * 2007-05-17 2012-08-07 Case Western Reserve University Methods of treating metabolic disorders
EP2397039A1 (en) 2010-06-21 2011-12-21 Abbott Laboratories Compositions for delaying progression of diabetes using Salacia oblonga extract
WO2012162698A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods and compositions for the treatment of immune disorders
EP3616701A1 (en) * 2011-06-24 2020-03-04 GRI Bio, Inc. Prevention and treatment of inflammatory conditions
CA2935334C (en) 2013-01-18 2021-05-25 Cornell University Methods of treating diseases associated with high fat diet and vitamin a deficiency using retinoic acid receptor agonists
US11191755B2 (en) 2014-01-17 2021-12-07 Cornell University Compositions and methods for providing cardioprotective effects
CA2937107C (en) 2014-01-17 2020-12-22 Cornell University Methods of treating metabolic syndrome related conditions using retinoic acid receptor agonists

Also Published As

Publication number Publication date
US11160769B2 (en) 2021-11-02
CN106211757A (zh) 2016-12-07
EP3094380A1 (en) 2016-11-23
CA2937107A1 (en) 2015-07-23
EP3094380B1 (en) 2021-04-28
US20220304945A1 (en) 2022-09-29
WO2015109231A1 (en) 2015-07-23
US20180263924A1 (en) 2018-09-20
CA2937107C (en) 2020-12-22
EP3094380A4 (en) 2017-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220304945A1 (en) Methods of treating metabolic syndrome related conditions using retinoic acid receptor agonists
Su et al. Icariin alleviates murine lupus nephritis via inhibiting NF-κB activation pathway and NLRP3 inflammasome
Inoue et al. Astaxanthin functions differently as a selective peroxisome proliferator-activated receptor γ modulator in adipocytes and macrophages
Huang et al. Curcumin ameliorates diabetic nephropathy by inhibiting the activation of the SphK1-S1P signaling pathway
Yu et al. Fucoidan ameliorates pancreatic β‐cell death and impaired insulin synthesis in streptozotocin‐treated β cells and mice via a Sirt‐1‐dependent manner
Wu et al. Epigallocatechin-3-gallate inhibits adipogenesis through down-regulation of PPARγ and FAS expression mediated by PI3K-AKT signaling in 3T3-L1 cells
Song et al. Glucose-dependent insulinotropic polypeptide enhances adipocyte development and glucose uptake in part through Akt activation
Nejabati et al. Nicotinamide and its metabolite N1-Methylnicotinamide alleviate endocrine and metabolic abnormalities in adipose and ovarian tissues in rat model of Polycystic Ovary Syndrome
Li et al. Quercetin preserves β‐cell mass and function in fructose‐induced hyperinsulinemia through modulating pancreatic Akt/FoxO1 activation
Liu et al. Effect of pioglitazone on insulin resistance in fructose-drinking rats correlates with AGEs/RAGE inhibition and block of NAPDH oxidase and NF kappa B activation
Nie et al. The complex role of Wnt ligands in type 2 diabetes mellitus and related complications
US11207277B2 (en) Methods of treating diseases associated with high-fat diet and vitamin a deficiency using retinoic acid receptor agonists
Mrazek et al. Apigenin inhibits pancreatic stellate cell activity in pancreatitis
Liu et al. Glucagon-like peptide 1 protects microvascular endothelial cells by inactivating the PARP-1/iNOS/NO pathway
Zhou et al. Rosiglitazone inhibits hepatic insulin resistance induced by chronic pancreatitis and IKK-β/NF-κB expression in liver
Shyni et al. Chebulagic acid from Terminalia chebula enhances insulin mediated glucose uptake in 3T3‐L1 adipocytes via PPARγ signaling pathway
Peng et al. The protective effect of beraprost sodium on diabetic nephropathy by inhibiting inflammation and p38 MAPK signaling pathway in high‐fat diet/streptozotocin‐induced diabetic rats
Bu et al. SENP2 alleviates CCl4-induced liver fibrosis by promoting activated hepatic stellate cell apoptosis and reversion
Wang et al. Puerarin ameliorates hyperglycemia in HFD diabetic mice by promoting β-cell neogenesis via GLP-1R signaling activation
Zhu et al. Acetylation of Hsp90 reverses dexamethasone-mediated inhibition of insulin secretion
Camer et al. Bardoxolone methyl prevents the development and progression of cardiac and renal pathophysiologies in mice fed a high-fat diet
Lu et al. LncRNA MEG3 aggravates adipocyte inflammation and insulin resistance by targeting IGF2BP2 to activate TLR4/NF-κB signaling pathway
Wang et al. Co-regulation of SREBP-1 and mTOR ameliorates lipid accumulation in kidney of diabetic mice
Lei et al. Histone deacetylase 3-selective inhibitor RGFP966 ameliorates impaired glucose tolerance through β-cell protection
Nakatsuka et al. Cell cycle abnormality in metabolic syndrome and nuclear receptors as an emerging therapeutic target

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant