CN106177723A

CN106177723A - 一种三文鱼饲料添加剂及其制备方法

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Publication number: CN106177723A
Application number: CN201610620897.7A
Authority: CN
Inventors: 燕磊; 吕明斌; 黄河
Original assignee: Shandong New Hope Liuhe Group Co Ltd
Current assignee: Shandong New Hope Liuhe Group Co Ltd
Priority date: 2016-08-02
Filing date: 2016-08-02
Publication date: 2016-12-07

Abstract

本发明提供一种三文鱼饲料添加剂，所述添加剂包括以下原料组分：小球藻、豆油、栀子、茭白、苋菜、苦瓜、柳橙、连翘、金银花、砂仁花、甘草、青叶丹、狗蚁草、黄连蜜和油菜花粉。本发明的有益效果是：其成分为兼有药用和食用双重作用，可提高三文鱼的免疫力，同时有效治疗及预防三文鱼烂鳍病。食用本发明添加剂后的三文鱼抗病力强，生长速度快、肉质营养丰富，极大增加了养殖户的经济效益，具有配方简单、科学、合理，纯天然绿色无残留，实用性强，无毒副作用，效果显著的优点。

Description

一种三文鱼饲料添加剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及饲料添加剂技术领域，特别涉及一种三文鱼饲料添加剂及其制备方法。

背景技术

三文鱼属于硬骨鱼纲，鲑形目。鲑亚目，鲑科的种类，被誉为“鱼中至尊”“水中珍品”，属于冷水性的高度洄游鱼类。其肉质鲜美，口感颇佳，肉色红色或鲜橘红色，富含深海鱼油(不饱和脂肪酸Omega-3)、脑黄金(DHA)、二甲氨基乙醇(DMAE)等主要成分，能降低血液里的胆固醇含量，有效防治心、脑血管疾病及减轻因风湿、牛皮癣等疾病带来的痛苦，还可预防慢性疾病、糖尿病和某些类似的疾病，是有益健康的鱼肉食品之一。

三文鱼味美肉嫩，营养价值高，已成为人们最好的水产品之一。烂鳍病是三文鱼最常见的疾病。病鱼先是背鳍、尾鳍或胸鳍外缘的上皮增生变白，逐渐向基部扩展，最后崩溃、鳍条露出。目前市面上销售的饲料都是一般的三文鱼饲料，没有治疗三文鱼的烂鳍病的饲料，更没有增强其免疫力的饲料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种三文鱼饲料添加剂及制备方法，能提高三文鱼的免疫力，同时有效治疗烂鳍病。食用本发明添加剂后的三文鱼抗病力强，生长速度快、肉质营养丰富，极大增加了养殖户的经济效益，具有配方简单、科学、合理，纯天然绿色无残留，实用性强，无毒副作用，效果显著的优点。

为解决上述技术问题，本发明提供一种三文鱼饲料添加剂，所述添加剂包括以下组分：小球藻、豆油、栀子、茭白、苋菜、苦瓜、柳橙、连翘、金银花、砂仁花、甘草、青叶丹、狗蚁草、黄连蜜和油菜花粉。

所述添加剂中各原料的重量份数为：小球藻11-23份、豆油4-9份、栀子8-18份、茭白12-23份、苋菜15-26份、苦瓜13-24份、柳橙15-28份、连翘4-15份、金银花5-14份、砂仁花0.4-1.1份、甘草6-11份、青叶丹0.4-1.3份、狗蚁草0.5-1.2份、黄连蜜17-28份和油菜花粉10-23份。

所述添加剂中各原料的重量份数为：小球藻14-20份、豆油5-8份、栀子10-15份、茭白15-20份、苋菜18-23份、苦瓜16-21份、柳橙18-24份、连翘6-11份、金银花7-12份、砂仁花0.4-1.0份、甘草6-10份、青叶丹0.4-0.9份、狗蚁草0.5-1.0份、黄连蜜20-24份和油菜花粉14-20份。

所述添加剂中各原料的重量份数为：小球藻20份、豆油7份、栀子10份、茭白20份、苋菜21份、苦瓜18份、柳橙24份、连翘6份、金银花12份、砂仁花1.0份、甘草9份、青叶丹0.4份、狗蚁草0.7份、黄连蜜24份和油菜花粉14份。

所述添加剂中各原料的重量份数为：小球藻17份、豆油5份、栀子15份、茭白15份、苋菜18份、苦瓜21份、柳橙22份、连翘11份、金银花7份、砂仁花0.4份、甘草10份、青叶丹0.9份、狗蚁草0.5份、黄连蜜22份和油菜花粉20份。

所述添加剂中各原料的重量份数为：小球藻14份、豆油8份、栀子13份、茭白18份、苋菜23份、苦瓜16份、柳橙18份、连翘8份、金银花10份、砂仁花0.7份、甘草6份、青叶丹0.8份、狗蚁草1.0份、黄连蜜20份和油菜花粉17份。

为解决上述技术问题，本发明还提供一种三文鱼饲料添加剂的制备方法，其制备方法包括以下步骤：

(1)将茭白、苦瓜和柳橙投入粉碎机粉碎，按所述质量份数取小球藻、粉碎后的茭白、苦瓜和柳橙,混合均匀后得混合物一；

(2)按所述质量份数比例取栀子、苋菜、连翘、砂仁花、甘草、青叶丹、狗蚁草和金银花混合，加入相对于混合物10～12倍的醇体积浓度为90％～95％的乙醇，加热至沸腾回流3～5小时，过滤，收集滤液，随后在真空度0.05～0.08Mpa下减压浓缩至40～50℃时相对密度为1.00～1.04的膏体，喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度160～175℃、出风温度80～85℃，随后粉碎成粉末，制成干膏粉；

(3)取所述质量份豆油、黄连蜜、油菜花粉，与步骤(1)得到的混合物一，步骤(2)得到的干膏粉混合均匀得到三文鱼饲料添加剂。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：其成分为兼有药用和食用双重作用，可提高三文鱼的免疫力，同时有效治疗及预防三文鱼烂鳍病。食用本发明添加剂后的三文鱼抗病力强，生长速度快、肉质营养丰富，极大增加了养殖户的经济效益，具有配方简单、科学、合理，纯天然绿色无残留，实用性强，无毒副作用，效果显著的优点。

具体实施方式

本发明提供了一种三文鱼饲料添加剂及制备方法，包括原料有：小球藻、豆油、栀子、茭白、苋菜、苦瓜、柳橙、连翘、金银花、砂仁花、甘草、青叶丹、狗蚁草、黄连蜜和油菜花粉。

小球藻：为小球藻科植物蛋白核小球藻及小球藻的藻体。蛋白质含量高达60％以上，还含有一些特殊成分，如酸性多糖和小球藻生长因子(CGF)，它可激活具有免疫功能的巨噬细胞、T细胞和B细胞。

豆油：提供能量。

栀子：别名黄栀子、黄果树、山栀子、红枝子。本品为茜草科植物栀子的干燥成熟果实。苦，寒。心、肺、三焦经。果实：泻火除烦，清热利尿，凉血解毒。用于热病心烦，黄疸尿赤，血淋涩痛，血热吐衄，目赤肿痛，火毒疮疡；外治扭挫伤痛。此处用果实。

茭白：别名出隧、蘧蔬，绿节，菰菜、茭首，菰首，菰笋、菰手、茭笋，茭粑，茭瓜、茭耳菜。为禾本科植物菰的花茎经茭白黑粉的刺激而形成的纺锤形肥大的菌瘿。入肝、脾二经。解热毒，除烦渴，利二便。

苋菜：别名雁来红、老少年、老来少、三色苋，苋科、苋属一年生草本，茎粗壮，绿色或红色，常分枝，幼时有毛或无毛。苋菜菜身软滑而菜味浓，入口甘香，有润肠胃清热功效。

苦瓜：味苦、性寒，归心、脾、胃经。清热利湿，解毒明目。

柳橙：又名：印子柑，拉丁文名：Citrus sinensis(L.)Osbeck cv.Liu Cheng芸香科、柑橘属植物，原产于广东新会及广州近郊，主产广东、广西、福建和台湾，四川、重庆、浙江等省(市)也有栽培。含有丰富的维生素C还有苹果酸，柠檬酸的物质。可以清热排毒，也可以清痰降气。

连翘：别名连壳、黄花条、黄链条花、黄奇丹、青翘、落翘。本品为木犀科植物连翘的干燥果实。秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称“青翘”；果实熟透时采收,晒干，除去杂质，习称“老翘”。苦，微寒。归肺、心、小肠经。清热解毒，消肿散结。

金银花：别名银花、双花、二花、二宝花。本品为忍冬科植物忍冬、红腺忍冬、山银花(毛萼忍冬)或毛花柱忍冬的干燥花蕾或带初开的花。夏初花开放前采收，干燥。甘，寒。归肺、心、胃经。清热解毒，凉散风热。

砂仁花：为姜科植物阳春砂、绿壳砂或海南砂的干燥花。味辛，性温。归脾、胃、肾经。化湿开胃，温脾止泻，理气安胎。用于脾胃气滞、脘腹胀满，呕恶。

甘草：甘，平。归心、肺、脾、胃经。补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。

青叶丹：别名思茅獐牙菜。为龙胆科植物粤北獐牙菜的全草。夏、秋采集。晒干。性寒，味苦。清热解毒，舒肝健胃，消炎杀菌。治急性黄疸型肝炎，咽喉炎，扁桃体炎，膀胱炎，尿道炎，流感，感冒，疟疾。

狗蚁草：别名链夹豆、练夹豆、小号野花生、山花生。豆科狗蚁草，以全草、根、叶入药。味甘、苦，性平。活血通络，清热化湿，驳骨消肿，去腐生肌。

黄连蜜：采自我国中草药自然保护区中黄连的花蜜，它继承了蜂蜜的特点及黄连的药性，因此不仅有天然蜂蜜的保健营养价值，尤其具有这种名贵中药的医疗效果。黄连蜜色泽微黄，香味特别，甜中微苦，甜而不腻，真可谓良药并不苦口，疗效却依然。基于特有清热祛湿、泻火解毒、抗菌消炎之功效和镇静、降温、去火的效果

油菜花粉：是浓缩的"完全营养库",含有丰富的各类维生素，微量元素se、fe、mo、mn等和常量元素mg、ca等等。

以下采用实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1添加剂1

一种三文鱼饲料添加剂，其中添加剂包括：小球藻20g、豆油7g、栀子10g、茭白20g、苋菜21g、苦瓜18g、柳橙24g、连翘6g、金银花12g、砂仁花1.0g、甘草9g、青叶丹0.4g、狗蚁草0.7g、黄连蜜24g和油菜花粉14g。

添加剂的制备方法包括以下步骤：

(2)按所述质量份数比例取栀子、苋菜、连翘、砂仁花、甘草、青叶丹、狗蚁草和金银花混合，加入相对于混合物12倍的醇体积浓度为90％的乙醇，加热至沸腾回流5小时，过滤，收集滤液，随后在真空度0.05Mpa下减压浓缩至50℃时相对密度为1.04的膏体，喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度160℃、出风温度80℃，随后粉碎成粉末，制成干膏粉；

(4)取所述质量份豆油、黄连蜜、油菜花粉，与步骤(1)得到的混合物一，步骤(2)得到的干膏粉混合均匀得到三文鱼饲料添加剂。

实施例2添加剂2

一种三文鱼饲料添加剂，其中添加剂包括：小球藻17g、豆油5g、栀子15g、茭白15g、苋菜18g、苦瓜21g、柳橙22g、连翘11g、金银花7g、砂仁花0.4g、甘草10g、青叶丹0.9g、狗蚁草0.5g、黄连蜜22g和油菜花粉20g。

添加剂的制备方法包括以下步骤：

(1)将所述质量份数的茭白、苦瓜和柳橙投入粉碎机粉碎，按所述质量份数取小球藻，与粉碎后的茭白、苦瓜和柳橙,混合均匀后得混合物一；

(2)按所述质量份数比例取栀子、苋菜、连翘、砂仁花、甘草、青叶丹、狗蚁草和金银花混合，加入相对于混合物10倍的醇体积浓度为95％的乙醇，加热至沸腾回流3小时，过滤，收集滤液，随后在真空度0.08Mpa下减压浓缩至40℃时相对密度为1.00的膏体，喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度175℃、出风温度85℃，随后粉碎成粉末，制成干膏粉；

实施例3添加剂3

一种三文鱼饲料添加剂，其中添加剂包括：小球藻14g、豆油8g、栀子13g、茭白18g、苋菜23g、苦瓜16g、柳橙18g、连翘8g、金银花10g、砂仁花0.7g、甘草6g、青叶丹0.8g、狗蚁草1.0g、黄连蜜20g和油菜花粉17g。

添加剂的制备方法包括以下步骤：

(2)按所述质量份数比例取栀子、苋菜、连翘、砂仁花、甘草、青叶丹、狗蚁草和金银花混合，加入相对于混合物11倍的醇体积浓度为95％的乙醇，加热至沸腾回流4小时，过滤，收集滤液，随后在真空度0.06Mpa下减压浓缩至50℃时相对密度为1.02的膏体，喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度170℃、出风温度85℃，随后粉碎成粉末，制成干膏粉；

安全性试验

1、急性毒性试验

(1)试验动物、饲料及饲养

清洁级昆明种小白鼠，体重18-22g，20只，雌雄各半。由上海斯莱克实验动物有限公司提供。全价营养生长饲料由广州大台农饲料有限公司提供。黑龙江省疾病控制中心Ⅱ级动物房，人工昼夜节律，温度：24±2℃，湿度：45±5％。

(2)试验及试剂

羧甲基纤维素(分析纯)，用蒸馏水配制成0.5％悬浮液待用。

(3)试验方法

试验方法选用最大耐受量法。取20只体重为18-22g健康的清洁级昆明种小白鼠，雌雄各10只。试验前禁食16h(隔夜)，不禁水。取5g本发明实施例1中的添加剂1，用0.4％羧甲基纤维素稀释至18mL。分上、下午间隔4h二次经口灌胃，第二次灌胃后2h进食，总灌胃剂量为10g·(kg·bw)^-1。连续观察14d，记录中毒表现及死亡情况。

2、致突变性试验

2.1试验菌株

TA97、TA98、TA100、TA102四株鼠伤寒沙门氏菌。由黑龙江省疾病控制中心提供。

2.2试验动物及试剂

(1)Ames试验：

营养肉汤培养基的配制：牛肉膏2.4g，蛋白胨5.0g，氯化钠2.4g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)1.2g，蒸馏水500mL。加热溶解将上述试剂，调pH至7.4，分装、灭菌(0.103MPa，20min)，普通冰箱保存备用(不超过半年)。

磷酸盐贮备液配制：磷酸氢钠氨(NaNH4HPO4·4H2O)17.4g，柠檬酸(C6H8O7·H2O)10.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4)50.0g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g。

硫酸镁待其他试剂完全溶解后再缓缓放入，使其继续溶解(否则会析出沉淀)。

1.5％琼脂培养基配制：琼脂Agar6.0g，滴入蒸馏水至400mL，上述试剂融化后0.102MPa灭菌25min。

底层培养基配制：灭菌琼脂培养基(80℃)400mL，磷酸盐贮备液7mL，40％葡萄糖溶液20mL，在容器中依次加入上述试剂，充分混匀，待温度降至80℃左右时倒平皿，每皿25mL，37℃培养过夜的同时除去水分，然后检查有无污染。

顶层琼脂配制：琼脂3.0g，氯化钠2.5g，滴入蒸馏水至500Ml。

0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液配制：D-生物素D-Biotin(分子量244)30.4mg，L-组氨酸L-Histidine(分子量155)19.3mg，滴入蒸馏水至250mL

10％S-9混合液的配制：磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH7.4)6mL，氯化钾溶液(1.65mol/L)0.2mL，氯化镁溶液(0.4mol/L)0.2mL，葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液(0.05mol/L)1.0mL，辅酶-Ⅱ溶液(0.0025mol/L)1.5mL，肝S-9液1.0mL混匀，临用时配制，置水浴中待用。

肝S-9液由黑龙江省疾病控制中心提供。标准诱变剂分别为敌克松、叠氮钠、2-乙酰氨基芴、1、8-二羟蒽醌，由黑龙江省疾病控制中心提供。

(2)微核试验

50只清洁级昆明种小白鼠，体重25-30g，雌雄各半。由上海斯莱克实验动物有限公司提供。全价营养生长饲料由广州大台农饲料有限公司提供。人工昼夜节律，温度：24±2℃，湿度：45±5％。

小牛血清：小牛血清虑菌后放入恒温水浴中，56℃灭活1h。灭活后将其储存于4℃冰箱中保存备用。

吉姆萨(Giemsa)染液：称取Giemsa3.8g，加入375ml甲醇(分析纯)研磨，待完全溶解后，再加入125ml甘油。置于37℃恒温箱48h震摇数次。过滤，静置两周后用。

吉姆萨(Giemsa)应用液：取一份Giemsa染液与6份磷酸盐缓冲液混合而成。临用时配制。

1/15moL/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制：磷酸二氢钾(KH2PO4)4.50g，磷酸二氢钠(Na2HPO4·12H2O)11.78g，滴入蒸馏水至1000mL，全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为蒸馏水。

(3)精子畸形试验

50只清洁级昆明种雄性小白鼠，体重25-35g。由上海斯莱克实验动物有限公司提供。全价营养生长饲料由广州大台农饲料有限公司提供。人工昼夜节律，温度：24±2℃，湿度：45±5％。

甲醇。1％～2％伊红染色液：称取伊红1～2g，溶于100mL蒸馏水备用。全部试剂除标明外，均为分析纯，试验用水为蒸馏水。

2.3试验方法

2.3.1Ames试验

(1)原理：鼠伤寒沙门氏菌的突变型(即组氨酸缺陷型)菌株在有组氨酸条件下的培养基上可以正常生长，在无组氨酸存在的培养基上不能生长。但若有致突变物存在于无组氨酸的培养基中时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型(表现型)，因而可以生长于无组氨酸的培养基上，所以可根据菌落形成数量为标准来判断受试物致突性的强弱。一些特殊的受试物需要经过代谢活化系统处理后才能使沙门氏菌突变型回复突变为野生型，代谢活化系统采用S-9混合液(制备方法：利用多氯联苯(Polychlorinated biphenyl,PCB)诱导大鼠肝匀浆(S-9))。

(2)试验菌株：采用TA97、TA98、TA100、TA102四株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株，TA97和TA98可以检测各种移码型诱变剂；TA100可检测引起碱基对置换的诱变剂；TA102能检测出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂。

(3)5个本发明实施例1中的添加剂1剂量分别为5000、1000、200、40和8μg/皿.

(4)增菌培训取营养肉汤培养基5ml,加入无菌小三角瓶或无菌试管中，将冷冻保存的菌株接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡(100次/min)培养10h至对数增长期，每毫升活菌数多于1×10⁹～2×10⁹个，用黑纸包裹培养瓶，以防细菌被光线照射。

(5)准备数个底层培养基平皿。

(6)将顶层培养基融化并分装于无菌小试管，每管2ml，保温于45℃水浴锅中。

(7)将0.1ml的测试菌株新鲜增菌液依次加入保温的顶层培养基中，混匀；然后滴入0.1ml受试物(活化时另加入0.5ml 10％S-9混合液)，再混匀，快速倒在底层培养基上，并使其在底层上均匀分布，平放固化，无菌箱中(37℃)培养48h观察结果。

(8)另做溶剂对照(即阴性对照，蒸馏水0.1ml/皿)和阳性对照(分别采用叠氮钠1.5μg/皿、敌克松50μg/皿、2-乙酰氨基芴10μg/皿、1,8-二羟蒽醌50μg/皿)。溶剂对照加灭菌蒸馏水；阳性对照不加受试物，只加标准诱变剂；其他方法同上。重复两次。

2.3.2微核试验

表1微核试验设计(n＝10)

剂量组	剂量(g·(kg·bw·d)^-1)
		阴性组	0.5％羧甲基纤维素
低剂量组	0.5
		中剂量组	5
高剂量组	9
		阳性组	0.04

按30h给受试物法给药，阳性对照组用环磷酸胺一次腹腔注射0.04g·(kg·bw)^-1，其余各组灌胃，2次给药间隔24h，第2次给药后6h处死动物。

制片：在第2次给药6h后将小鼠脱颈椎处死，取小鼠脊椎，剔去肌肉，剪开一端的骨椎，用尖嘴钳挤出骨髓滴到小牛血清(0.05mL，置于载玻片上)中。

推片：混匀后，推片若干张，静置干燥。

固定：用甲醇溶液将干燥的涂片固定5～10min，取出晾干。当日不染色的涂片亦应固定后保存。

染色：用1:10的吉姆萨-磷酸缓冲液(pH为6.4)染色固定好的涂片15～30min。用蒸馏水冲洗，干燥后待检。每只小白鼠计数1 000个PCE(Poiychromatic erythrocytes，PCE)，微核率以‰表示；另外，在计数PCE时，同时计数RBC(Red blood cell count，RBC)数，计算PCE/RBC值。

2.3.3精子畸形试验

表2精子畸形试验设计(n＝10)

剂量组	剂量(g·(kg·bw·d)^-1)
		阴性组	0.5％羧甲基纤维素
低剂量组	0.5
		中剂量组	5
高剂量组	10
		阳性组	0.04

每日染毒一次，连续5d，每天记录体重、进食量和摄入添加剂量。阳性对照组采用0.04g·(kg·bw·d)^-1环磷酰胺进行腹腔注射，本发明实施例1添加剂1的给药方式为灌胃。试验结束时要求每组至少有5只存活动物。

精子采样与镜检：于首次给受试物后第5周(35d)将小鼠用颈椎脱臼法处死，打开腹腔，摘取两侧附睾，放入小平皿中(盛有约2ml生理盐水)。将附睾以眼科剪剪碎(不能太碎)。将组织碎片用四层擦纸滤去。滤液离心5min(1000～1500r/min)。留存约0.5ml液体，其余上清液弃除，将其与沉淀物摇匀后，在洁净的载玻片上滴1滴进行涂片(一般每只小鼠做4～5张涂片)。涂片在空气中干燥后，采用甲醇溶液固定5min。用2％伊红溶液在其自然干燥后染色1h，用水轻冲，干燥待检。

在低倍镜下找到精子重叠较少、背景清晰的部分，用高倍镜顺序检查精子，并计数。凡不完整，轮廓不清，或重叠，或明显属人为剪碎者均不计算。一个精子只计其中较为明显的一种畸形。

精子的畸形主要表现在头部，其次在尾部，畸形类型有香蕉形、无定形、无钩、胖头、双头、双尾、尾折叠等。记录异常的精子数和异常类型，并计算畸形类型的精子构成比。每鼠计1000个完整精子，畸形率以‰表示。

精子畸形率(‰)＝精子畸形总数/检查精子总数×1 000

3、慢性和亚慢性试验

3.1试验动物、饲料及饲养

3.1.1大鼠30d喂养试验

清洁级Wistar大白鼠，体重150-180g，80只，雌雄各半。由上海斯莱克实验动物有限公司提供。全价营养生长饲料由北京澳协力饲料有限公司提供。Ⅱ级动物房，人工昼夜节律，温度：24±2℃，湿度：45±5％。

3.1.2蛋鸡56d喂养试验

29周龄海赛蛋鸡240只，由哈尔滨益农禽业提供。基础饲粮由哈尔滨华达饲料厂提供。蛋鸡饲养在东北农业大学实验实习基地蛋鸡舍。

3.2试验试剂

普通化学试剂：甲醛、石蜡、乙醇、二甲苯、苏木精、伊红、丙酮、磷酸盐缓冲液等。

生化指标测定试剂盒：谷草转氨酶(Glutamic-oxalacetic transaminease，GOT)、谷丙转氨酶(Glutamic-pyruvic transaminase，GPT)、尿素氮(Urea nitrogen，BUN)、肌酐(Creatinine，CRE)、胆固醇(Cholesterol，CHO)、血糖(Glucose，GLU)、TG、白蛋白(Albumin，ALB)、总蛋白(Total protein，TP)测试试剂盒均购自中生北控(生产批号：100731)

血细胞分析仪测试试剂：染色剂(STROMATOLYSER-4DS FFS-800A)、血蛋白检测试剂(SULFOLYSERSLS-210A1015)、嗜碱性粒细胞和白细胞检测试剂(STROMATOLYSER-FBR1039)、稀释液(PK-30L G2109)。全部试剂均为分析纯，试验用水为蒸馏水。

3.3试验方法

3.4.1大鼠30d喂养试验

表3大鼠30d喂养试验设计(n＝20)

组别	处理
		对照组	全价饲料
低剂量组	全价饲料+0.4％本发明实施例1添加剂1
		中剂量组	全价饲料+2％本发明实施例1添加剂1
高剂量组	全价饲料+10％本发明实施例1添加剂1

动物购入隔离喂养1周后供试验用，每组雌雄各半。试验动物自由采食、自由饮水。

(1)血液指标：

一般性指标：观察大鼠的采食、饮水、发病及死亡等情况，每日早晚两次，体重和饲料每周各称一次，并计算平均增重、采食量、始重、末重及饲料利用率。

血液学指标：30d喂养结束后，采血液样品，测定红细胞(Red blood cell count，RBC)、白细胞(White blood cell count，WBC)、血红蛋白(Hemoglobin，HGB)、淋巴细胞数(Lymphocyte，LYM)及白细胞分类。

生化指标：30d喂养结束后，采集大鼠血液样品离心取血清，测定GOT、GPT、BUN、CRE、CHO、GLU、TG、ALB、TP。

(2)病理学检查：

尸检：观察并记录各系统器官、组织的肉眼变化，典型病变拍照。

脏器系数：心脏、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸或卵巢等组织及体重称重，并计算脏器系数。

组织学检查：在上述解剖试验动物以肉眼观察变化的同时，取心脏、肾脏、脾脏、肝脏、胃、睾丸或卵巢等脏器组织1～2块，以甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE(H Ematine，HE)染色，显微镜下观察并记录组织学变化。

3.4.2蛋鸡56d喂养试验

表4蛋鸡56d喂养试验设计(n＝60)

组别	处理
		对照组	基础饲粮
低剂量组	基础饲粮+0.4％本发明实施例1添加剂1
		中剂量组	基础饲粮+2％本发明实施例1添加剂1
高剂量组	基础饲粮+10％本发明实施例1添加剂1

动物购入后在本试验条件下适应7天后再开始试验。试验动物自由采食、自由饮水。

(1)血液指标：

一般性指标：观察蛋鸡的采食、饮水、发病及死亡等情况，每日早晚两次，对蛋重和饲料每天各称一次，并计算料蛋比、产蛋率。

血液学指标：在56天喂养结束后，对蛋鸡进行采血测定RBC、WBC、HGB、LYM。

生化指标：在56天喂养结束后，对蛋鸡进行采集血液离心取血清测定GOT、GPT、BUN、CRE、CHO、GLU、TG、ALB、TP。

(2)病理学检查：

尸检：肉眼观察并记录各系统器官、组织的变化，典型病变拍照。

脏器系数：称心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、胰腺、腺胃、肌胃等组织重及体重。

组织学检查：在上述解剖试验动物以肉眼观察变化的同时，取肝脏、脾脏、肾脏、腺胃等脏器组织1～2块以甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察并记录组织学变化。

3.4数据处理

结果用平均值±标准差表示，采用SPSS 17.0进行统计分析。急性毒性试验、大白鼠30d喂养试验和蛋鸡56d喂养试验结果进行单因素方差(one-wayANOVA)分析；Ames试验结果和小鼠骨髓细胞微核试验结果均进行卡方检验；小鼠精子畸形试验结果进行单因素方差分析和Duncan′s法多重比较。P<0.05为差异显著性判断标准，P<0.01为差异极显著判断标准。

4、结果与分析

4.1急性毒性

表5急性毒性

由表5可见，试验结束后，所有小鼠在试验期间全部无异常，饮水、采食及粪便均正常，全部存活；两种性别小鼠的体重增重未见显著差异(P>0.05)。在试验结束后将全部小鼠脱颈处死，解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、胃、肾、胸腺等脏器均未出现异常病理变化。结果表明，本发明实施例1添加剂1的LD50>10mg·(kg·bw)-1，属于实际无毒类物质。

4.2致突变性

4.2.1Ames试验

由表6、7、8、9可见，与阴性对照组相比，在加与不加S-9情况下两次Ames试验阳性对照组回复突变菌落数极显著增高(P<0.01)，本发明实施例1添加剂1各剂量组回复突变菌落数无显著差异(P>0.05)，无剂量反应关系，即此剂量下本发明实施例1添加剂1对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阴性。

表6本发明实施例1添加剂1对回复突变菌落数的影响(第一次试验，-S9)

注：同列中*表示差异极显著(P<0.01)。表7、8、9同

表7本发明实施例1添加剂1对回复突变菌落数的影响(第一次试验，+S9)

表8本发明实施例1添加剂1对回复突变菌落数的影响(第二次试验，-S9)

表9本发明实施例1添加剂1对回复突变菌落数的影响(第二次试验，+S9)

4.2.2小鼠骨髓细胞微核试验

表10小鼠骨髓细胞微核试验(n＝10)

注：同列中肩标*者表示差异极显著(P<0.01)

由表10可见，与阴性对照组相比，阳性对照组微核率极显著提高(P<0.01)，雌、雄小鼠本发明实施例1添加剂1各组微核率均无显著差异(P>0.05)，说明在此剂量下本发明实施例1添加剂1对小鼠骨髓细胞微核率无显著影响，即本试验结果为阴性。此外，除阳性对照组外，本发明实施例1添加剂1各组与阴性对照组相比PCE/RBC无显著差异(P>0.05)，说明此剂量下本发明实施例1添加剂1对试验动物未见细胞毒性作用。

4.2.3小鼠精子畸形试验

由表11可见，各组小鼠均有一定数量的畸形精子出现，与阴性对照组相比，阳性对照组精子畸形率极显著提高(P<0.01)，本发明实施例1添加剂1各组差异均不显著(P>0.05)，无剂量反应关系，说明在此剂量下本发明实施例1添加剂1对小鼠精子畸形发生率没有影响。

表11小鼠精子畸形试验(n＝10)

注：同列中肩标*者表示差异极显著(P<0.01)

4.3慢性和亚慢性

4.3.1大鼠30d喂养试验

4.3.1.1一般性指标

表12大鼠30d喂养试验体重增重、进食量、食物利用率(n＝10)

由表12可见，本发明实施例1添加剂1喂饲大鼠30d后体重增重、总进食量以及食物利用率与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。

4.3.1.2血液学指标

表13大鼠30d喂养试验血液学指标(1)(n＝10)

表14大鼠30d喂养试验血液学指标(2)(n＝10)

由表13和14可见，与对照组相比，本发明实施例1添加剂1饲喂大鼠30d后雌雄大鼠的白细胞、红细胞、血红蛋白以及白细胞分类计数差异均不显著(P>0.05)。

4.3.1.3血液生化指标

表15大鼠30d喂养试验血液生化指标(1)(n＝10)

表16大鼠30d喂养试验血液生化指标(2)(n＝10)

由表15和16可见，与对照组相比，本发明实施例1添加剂1饲喂大鼠30d后雌雄大鼠的9项血液生化指标差异均不显著(P>0.05)。

4.3.1.4病理学检查

(1)大体观察

试验结束后解剖各组大鼠进行肉眼尸检。各组大鼠气管、心脏、胸主动脉、肝、肾、肾上腺、脾、胃、盲肠、结肠、直肠、胰腺、部分肠系膜淋巴结、乳腺、十二指肠、空肠、前列腺、睾丸、附睾精囊或卵巢、子宫、阴道、坐骨神经、膀胱、皮肤等组织均未见明显异常。

表17大鼠30d喂养试验脏器体重比(1)(n＝10)

表18大鼠30d喂养试验脏器体重比(2)(n＝10)

由表17、18可见，本发明实施例1添加剂1饲喂大鼠30d后与对照组雌雄大鼠的脏器体重比相比差异均不显著(P>0.05)。

(2)脏器组织病理检查

试验结束后对所有大鼠心脏、肝脏、脾、肾、胃、睾丸或卵巢进行HE染色。显微镜下观察，各剂量组与对照组相比未见任何明显异常

4.3.2蛋鸡56d喂养试验

4.3.2.1一般性指标

由表19可见，与对照组相比，蛋鸡经56d本发明实施例1添加剂1饲喂后日采食量、平均蛋重差异均不显著(P>0.05)；平均产蛋率显著提高，料蛋比显著降低(P<0.05)，表明适当剂量本发明实施例1添加剂1能够提高蛋鸡的生产性能。

表19蛋鸡喂养试验一般性指标(n＝60)

注：同行中肩上字母不同者表示差异显著(P<0.05)

4.3.2.2血液学指标

由表20可见，与对照组相比，蛋鸡经56d本发明实施例1添加剂1饲喂后白细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞比容、红细胞平均体积、平均红细胞血色素、红细胞平均蛋白浓度、血小板差异均不显著(P>0.05)。

表20蛋鸡喂养试验血液学指标(n＝60)

4.3.2.3血液生化指标

表21蛋鸡喂养试验血液生化指标(n＝60)

注：同行中肩上标注*者表示差异显著(P<0.05)

由表21可见，与对照组相比，高剂量组蛋鸡血液BUN水平显著降低(P<0.05)，其他指标均无显著差异(P>0.05)。

4.3.2.4病理学检查

(1)大体观察

试验结束后，对各组蛋鸡解剖，进行肉眼尸检。各组蛋鸡的主要脏器气管、心脏、肝、肾、肾上腺、脾、胃、盲肠、结肠、直肠、胰腺、部分肠系膜淋巴结、十二指肠、卵巢、子宫、皮肤等经肉眼观察，未见明显异常。

表22蛋鸡喂养试验脏器体重比(n＝60)

项目	对照组	低剂量组	中剂量组	高剂量组
					心脏体重比	3.69±0.51	4.22±0.56	2.49±0.13	3.74±0.59
肝脏体重比	23.79±4.88	26.28±3.38	23.51±3.68	27.09±6.01
					肾体重比	6.02±1.03	7.13±0.31	6.33±0.58	7.27±0.37
脾体重比	1.23±1.02	0.94±0.12	1.02±0.12	0.71±0.72
					法氏囊体重比	1.19±0.49	0.95±0.18	0.59±0.50	0.52±0.32
腺胃体重比	4.19±0.42	3.91±0.31	3.40±0.71	4.24±0.28
					肌胃体重比	16.24±1.14	15.93±1.15	14.28±2.98	17.65±2.18

由表22可见，与对照组相比，本发明实施例1添加剂1各组蛋鸡脏器体重差异均不显著(P>0.05)。

(2)脏器组织病理检查

蛋鸡肝脏、脾、肾、腺胃经HE染色，在显微镜下观察，各剂量组与对照组相比较均未见任何明显异常

综上实验结果:

1.本发明实施例1添加剂1的半数致死量大于10g·(kg·bw)-1，属于实际无毒类物质。

2.本试验条件下，本发明实施例1添加剂1没有致突变性。

3.本试验条件下，本发明实施例1添加剂1对大鼠和蛋鸡没有慢性和亚慢性毒性，并可提高蛋鸡的生产性能。

综上所述，本试验结果提示，本试验条件下，本发明实施例1添加剂1既没有急性毒性、致突变性，也没有慢性或亚慢性毒性，本发明实施例1添加剂1在适当的剂量下完全可以作为一种绿色、天然、安全的功能性饲料添加剂，并应用于畜牧生产中。

本发明的实施例2和实施例3的添加剂同样进行了上述试验，同样证明本发明实施例2和实施例3的添加剂既没有急性毒性、致突变性，也没有慢性或亚慢性毒性，在适当的剂量下完全可以作为一种绿色、天然、安全的功能性饲料添加剂，并应用于畜牧生产中。

对比试验：

1、试验用鱼

选取某三文鱼养殖场。挑选外观正常、体质健壮、大小均匀的三文鱼800尾。该鱼场水温16-22℃。

2、试验分组及日粮

将该800尾三文鱼随机分为4组，每组200尾，4组分别为添加剂1组、添加剂2组、添加剂3组和对比组。

添加剂1组：本发明的三文鱼实施例1添加剂与基础饲料以5:10000的比例混合均匀。

添加剂2组：本发明的三文鱼实施例2添加剂与基础饲料以5:10000的比例混合均匀。

添加剂3组：本发明的三文鱼实施例3添加剂与基础饲料以5:10000的比例混合均匀。

对比组：基础饲料。

3、试验日常管理

将该4组三文鱼分别放养3.12m*1.42m*1.5m的水池中，每组一池，4个水池相邻排列。日投饵3次，分别于8：00,12：00,16：30进行，日投饵量为体重的2％。保持池中清水不断流动。每天清理池底淤物1次，随时保持水质清新。每天仔细观察水池内三文鱼的活动情况，详细记录各水池的实际投喂量，如果鱼有死亡，做好记录，并且定时测定水温。试验90天。

4、指标测定

饲养试验开始时以及结束时，分别从每个水池随机抽取10尾三文鱼于清晨7：30称重1次，计算平均体重。

尾绝对增重/g＝试验鱼结束尾重-试验鱼开始尾重

相对增重率/％＝(尾绝对增重/试验开始尾重)*100％

特定生长率/％＝(ln试验鱼结束平均体重-ln试验鱼开始平均体重)/试验天数*100％

饲料系数＝总投饵量/总增重

存活率/％＝(试验结束鱼尾数/试验开始鱼尾数)*100％

5、血细胞吞噬活力的检测

用无菌生理盐水冲洗过活化的白色念珠菌斜面，经过来活制成1.4*107/ml的菌悬液。将饲喂上述4组90天的三文鱼进行接种试验，每组随机取20尾三文鱼，于三文鱼背部进行肌肉注射接种0.6ml的菌悬液。1h后用1ml注射器采血并按常规方法制作血液涂片玻片，染色，检测100个血细胞，计算吞噬率和吞噬指数。计算公式如下：

吞噬百分比(PP)＝100个血细胞中参吞噬的细胞数/100*100％

吞噬指数(PI)＝100个参与吞噬的细胞内的真菌总数/100

实验结果如下：

表23四组三文鱼生长情况

分组	增重率/％	特定生长率/％	饲料系数	成活率/％
					添加剂1组	187.4^b	4.1	1.62	100
添加剂2组	185.6^b	4.0	1.63	100
					添加剂3组	185.1^b	3.98	1.63	100
对比组	143.8^a	3.0	1.87	96

注：同列字母相同表示无显著差异(P>0.05)；字母不同，则有显著差异

(P<0.05)。

从以上数据可以看出本发明实施例所得添加剂与普通饲料相比，增重效果明显，生长迅速，成活率高.

表24试验前后血细胞吞噬活力的检测

注：同行字母相同表示无显著差异(P>0.05)；字母不同，则有显著差异

(P<0.05)。

从以上数据可以看出本发明实施例所得添加剂与普通饲料相比，免疫力得到了极大的提高。

6、选取该三文鱼养殖场中患有烂鳍病的病鱼100尾，为4组，每组25尾。4组分别为

添加剂1组：本发明的三文鱼实施例1添加剂与基础饲料以1:1000的比例混合均匀。

添加剂2组：本发明的三文鱼实施例2添加剂与基础饲料以1:1000的比例混合均匀。

添加剂3组：本发明的三文鱼实施例3添加剂与基础饲料以1:1000的比例混合均匀。

对比组：普通添加剂组的对比组。

将4组三文鱼分别放养在1.0m*1.0m*0.5m的网箱中，试验期为4天。日常的饲养管理、病害防治等工作按常规养殖管理的方法。日投饵3次，分别于8：00,12：00,16：30进行，日投饵量为体重的2％。保持池中清水不断流动。每天清理池底淤物1次，随时保持水质清新。每天仔细观察水池内三文鱼的活动情况，详细记录各水池的实际投喂量，如果鱼有死亡，做好记录，并且定时测定水温。试验4天。

症状：

背鳍、尾鳍或胸鳍外缘的上皮增生变白，逐渐向基部扩展，最后溃烂、鳍条露出。

疗效判定：

痊愈：鳍部溃烂面愈合，发育正常；

有效：鳍部溃烂面溃烂程度减轻；

无效：鳍部溃烂面恶化，鳍条露出。

实验结果：

表25将100尾病三文鱼饲喂4天后结果

以上实验结果可以看出，本发明实施例所得添加剂与普通添加剂相比，可以显著提高三文鱼的免疫力及抗病能力，对治疗三文鱼的病效果相当显著，具有独特的见效快、疗程短、无毒副作用的优势。

综上实验结果，本发明所得三文鱼添加剂相对于普通添加剂，能明显的提高三文鱼的免疫力，极大提高了三文鱼生长速度，同时可有效治疗三文鱼烂鳍病，提高了三文鱼的经济价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种三文鱼饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂包括以下组分：小球藻、豆油、栀子、茭白、苋菜、苦瓜、柳橙、连翘、金银花、砂仁花、甘草、青叶丹、狗蚁草、黄连蜜和油菜花粉。

2.如权利要求1所述的三文鱼饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂中各原料的重量份数为：小球藻11-23份、豆油4-9份、栀子8-18份、茭白12-23份、苋菜15-26份、苦瓜13-24份、柳橙15-28份、连翘4-15份、金银花5-14份、砂仁花0.4-1.1份、甘草6-11份、青叶丹0.4-1.3份、狗蚁草0.5-1.2份、黄连蜜17-28份和油菜花粉10-23份。

3.如权利要求1或2所述的三文鱼饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂中各原料的重量份数为：小球藻14-20份、豆油5-8份、栀子10-15份、茭白15-20份、苋菜18-23份、苦瓜16-21份、柳橙18-24份、连翘6-11份、金银花7-12份、砂仁花0.4-1.0份、甘草6-10份、青叶丹0.4-0.9份、狗蚁草0.5-1.0份、黄连蜜20-24份和油菜花粉14-20份。

4.如权利要求1至3任一所述的三文鱼饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂中各原料的重量份数为：小球藻20份、豆油7份、栀子10份、茭白20份、苋菜21份、苦瓜18份、柳橙24份、连翘6份、金银花12份、砂仁花1.0份、甘草9份、青叶丹0.4份、狗蚁草0.7份、黄连蜜24份和油菜花粉14份。

5.如权利要求1至4任一所述的三文鱼饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂中各原料的重量份数为：小球藻17份、豆油5份、栀子15份、茭白15份、苋菜18份、苦瓜21份、柳橙22份、连翘11份、金银花7份、砂仁花0.4份、甘草10份、青叶丹0.9份、狗蚁草0.5份、黄连蜜22份和油菜花粉20份。

6.如权利要求1至5任一所述的三文鱼饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂中各原料的重量份数为：小球藻14份、豆油8份、栀子13份、茭白18份、苋菜23份、苦瓜16份、柳橙18份、连翘8份、金银花10份、砂仁花0.7份、甘草6份、青叶丹0.8份、狗蚁草1.0份、黄连蜜20份和油菜花粉17份。

7.一种如权利要求1至6任一所述的三文鱼饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）将所述质量份数的茭白、苦瓜和柳橙投入粉碎机粉碎，按所述质量份数取小球藻，与粉碎后的茭白、苦瓜和柳橙,混合均匀后得混合物一；

（2）按所述质量份数比例取栀子、苋菜、连翘、砂仁花、甘草、青叶丹、狗蚁草和金银花混合，加入相对于混合物10～12倍的醇体积浓度为90%～95%的乙醇，加热至沸腾回流3～5小时，过滤，收集滤液，随后在真空度0.05～0.08Mpa下减压浓缩至40～50℃时相对密度为1.00～1.04的膏体，喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度160～175℃、出风温度80～85℃，随后粉碎成粉末，制成干膏粉；

（3）取所述质量份豆油、黄连蜜、油菜花粉，与步骤（1）得到的混合物一，步骤（2）得到的干膏粉混合均匀得到三文鱼饲料添加剂。