CN106170541A - 经遗传修饰以表达纤维素分解系统的酶的乳酸菌 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了用于加工木质素纤维素的乳酸细胞培养物。该细菌培养物可包含生物质成分和包含以下的乳酸菌群：(i) 经遗传修饰以表达分泌的纤维素酶的第一乳酸菌群；和(ii) 经遗传修饰以表达分泌的木聚糖酶的第二乳酸菌群，其中选择第一群:第二群的比率使得培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4。
Description
发明领域和背景
在本发明的一些实施方案中，本发明涉及经遗传修饰以表达纤维素分解系统的酶的乳酸菌，更具体而非排外地讲，本发明涉及纤维素酶和木聚糖酶。
植物细胞壁纤维由聚合物组分组成，例如在总体上代表地球上最丰富的可再生有机聚合物的纤维素、木质素、果胶和半纤维素。尽管其坚硬性质，植物细胞壁的多糖提供碳和能源的绝佳来源，且众多不同的微生物具有能够降解植物细胞壁多糖的经进化的酶系统(值得注意的是糖苷水解酶)。在生物技术过程例如通过代谢工程改造中利用这些酶，具有巨大的环境和可应用潜力。
用于对植物质量生物加工进行代谢工程改造的一个有吸引力的候选物是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，这是一种具有对己糖进行同型乳酸发酵和对戊糖进行异型乳酸(乳酸+乙酸)发酵的常见乳酸菌。植物乳杆菌应用于多种工业和农业应用，并在含有分解的木质素纤维素植物生物质的环境中茂盛生长(2)。在农业上，这些生物的酸化性质用于保存植物生物质以用于动物饲料(3)。大量产生乳酸的能力还可用于从植物生物质生产生物基塑料(biobased plastics) (聚乳酸)。有趣的是，乳杆菌属(Lactobacillus)菌种在污染的乙醇发酵中占优势地位(4，5)，植物乳杆菌显示高乙醇耐受性(6)，通过将产乙醇的酶引入基因库，而使之成为用于生物燃料生产的可能候选物(7)。与常用的产乙醇的酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)相比，植物乳杆菌能够代谢来源于木质素纤维素生物质的戊糖(8-11)。酸的产生和该细菌的耐酸性降低被其它细菌和真菌污染的危险，并且可直接在常用于植物生物质中的木质素解构的酸预处理之后能够使底物降解。植物乳杆菌含有编码18个糖苷水解酶家族的55种基因，但无一是严格的纤维素酶或木聚糖酶(12)。因此细菌缺乏内在的降解纤维素和半纤维素的能力。
报道了使用异源启动子和分泌信号在植物乳杆菌中表达来自革兰氏阳性菌的纤维素酶(12-14)。用pSIP系统的胞内表达最近被用于在植物乳杆菌和干酪乳杆菌(L.casei)菌株两者中表达重组激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)纤维素酶(19)。
其它背景技术包括Ozkose等, Folia microbiologica 54:335-342；Liu等,Applied microbiology and biotechnology 77:117-124；Bates等, 1989 Appl.Environ. Microbiol. 1989, 55(8):2095；Scheirlinck等, 1989, Appl. Environ.Microbiol. 1989, 55(9):2130；Scheirlinck等, 1990, AppI Microbiol Biotechnol.,33:534-541；Rossi等, Antonie van Leeuwenhoek 80: 139-147, 2001。
发明概述
按照本发明的一些实施方案的一个方面，提供包含生物质成分和乳酸菌群的细菌培养物，其包含：
(i) 经遗传修饰以表达分泌的纤维素酶的第一乳酸菌群；和
(ii) 经遗传修饰以表达分泌的木聚糖酶的第二乳酸菌群，其中选择第一群:第二群的比率使得培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4。
按照本发明的一些实施方案的一个方面，提供经遗传修饰以表达分泌的纤维素酶和分泌的木聚糖酶的乳酸菌群。
按照本发明的一些实施方案的一个方面，提供包含本文所述乳酸菌群和生物质成分的培养物。
按照本发明的一些实施方案的一个方面，提供包含本文所述培养物的青贮饲料。
按照本发明的一些实施方案的一个方面，提供按照本文所述方法加工木质素纤维素而产生的青贮饲料。
按照本发明的一些实施方案的一个方面，提供加工木质素纤维素的方法，所述方法包括使本文所述培养物增殖，从而加工木质素纤维素。
按照本发明的一些实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的摩尔比率大于4:1或小于1:4。
按照本发明的一些实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的摩尔比率大于10:1或小于1:10。
按照本发明的一些实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的摩尔比率小于1:10。
按照本发明的一些实施方案，用于表达分泌的纤维素酶和分泌的木聚糖酶的表达质粒是pSIP衍生的表达质粒。
按照本发明的一些实施方案，生物质包含木质素纤维素。
按照本发明的一些实施方案，生物质包含纤维素和半纤维素。
按照本发明的一些实施方案，生物质另包含木质素。
按照本发明的一些实施方案，生物质选自纸、纸制品、废纸、木、碎料板、锯屑、农业废料、污水、青贮饲料、草、稻壳、甘蔗渣、黄麻、大麻、亚麻、竹、剑麻、马尼拉麻、麦秆、玉米芯、玉米秸草、柳枝稷、苜蓿、干草、椰子棕、棉、海草、藻类及其混合物。
按照本发明的一些实施方案，乳酸菌是植物乳杆菌。
按照本发明的一些实施方案，第一乳酸菌群包含植物乳杆菌。
按照本发明的一些实施方案，第二乳酸菌群包含植物乳杆菌。
按照本发明的一些实施方案，纤维素酶是褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)纤维素酶。
按照本发明的一些实施方案，木聚糖酶是褐色喜热裂孢菌木聚糖酶。
按照本发明的一些实施方案，纤维素酶是中温菌纤维素酶。
按照本发明的一些实施方案，木聚糖酶是中温菌木聚糖酶。
按照本发明的一些实施方案，中温菌是生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)或白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)。
按照本发明的一些实施方案，纤维素酶包含SEQ ID NO: 16或17所列出的前导序列。
按照本发明的一些实施方案，木聚糖酶包含SEQ ID NO: 16或17所列出的前导序列。
按照本发明的一些实施方案，第一群和第二群包含相同的细菌菌株。
按照本发明的一些实施方案，第一群和第二群包含不同的细菌菌株。
按照本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括降解木质素纤维素的木质素。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管类似或等同于本文所述那些的方法和材料可用于本发明的实施方案的实践或检验中，但下面描述了示例性的方法和/或材料。万一发生抵触，将以专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例只是说明性的，并无意必然是限制性的。
附图详述
本文仅通过实施例并参考附图对本发明的一些实施方案进行描述。现详细地具体参照附图，要强调的是示出的细节为了举例，而且目的是说明性地论述本发明的实施方案。在这点上，随附图进行的说明使本领域技术人员明白如何可实施本发明的实施方案。
附图中：
图1A-B是说明在37℃或50℃下且在pH 5或6下纯化的重组Cel6A (A)和Xyn11A (B)酶对PASC或木聚糖的比较酶活性的条线图。酶活性定义为在30分钟反应期后的总还原糖(mM)。各反应一式三份进行，注明了标准差。
图2A-B是来自转化的乳杆菌培养上清液的蛋白质印记分析的照片。A。泳道1-3：分别用Lp1、Lp2和No-Lp质粒表达的Cel6A。B. 泳道1-3：分别用Lp1、Lp2和No-Lp质粒表达的Xyn11A。分泌的Cel6A和Xyn11A的计算质量分别为46.9 kDa和33.2 kDa。手工插入图A（Panel A）中的预染色的分子量标志物的泳道作为印迹的化学发光图像的参照。
图3A-D是说明定量测定分泌的酶的条线图。A. 单位为nM的递增浓度的纯化Cel6A和2 μL浓缩的培养上清液的点印迹分析。该图显示黑色的校准曲线的各点的平均强度，而白色圆圈表示Cel6A培养物(No-Lp、Lp1和Lp2)的点的强度。B. 以nM为单位的递增浓度的纯化Xyn11A和2 μL透析培养上清液的点印迹分析。图中Lp2和No-Lp样品之间不相关的点被修剪。C. 对PASC的酶活性。用递增浓度的纯化Cel6A和30 μL浓缩的培养上清液进行反应。酶活性定义为在18小时反应期后释放的可溶性还原糖(mM)。各反应一式三份进行，注明了标准差。D. 对木聚糖的酶活性。用递增浓度的纯化Xyn11A和30 μL透析培养上清液进行反应。酶活性定义为在2小时反应期后的可溶性还原糖(mM)。各反应一式三份进行，并标明了木聚糖水解的标准差。
图4是说明分泌的酶对各种底物的活性的条线图。来源于产生纤维素酶(灰色条形)或木聚糖酶(白色条形)的培养物的上清液的比较酶活性。将底物、PASC、木聚糖或预处理小麦麦秆与30 μl上清液(浓缩至约16.5 nM的酶)一起孵育。Cel6A的酶活性用灰色条形表示，Xyn11A用白色条形表示。酶活性定义为在pH 5和37℃下对于木聚糖在2小时反应期后、对于PASC在18小时孵育后或对于小麦麦秆24小时孵育后的可溶性还原糖(mM)。各反应一式三份进行，注明了标准差。
图5是说明产生纤维素酶和木聚糖酶的共培养物的上清液中的酶活性的条线图。底物是预处理的小麦麦秆，将测量的活性与相应的理论相加效应进行比较。使用以下不同的比率(Cel6A/Xyn11A)接种细胞：1/500、1/100、1/50、1/10、1/1、10/1、50/1、100/1和500/1(其中10/1细胞比率相当于近似1:1摩尔比率的分泌的酶，因为纤维素酶生产约低10倍；参见正文和图3)。反应中预处理小麦麦秆(干物质)的浓度为3.5 g/l。假设所有检测的还原末端属于二聚体，则最高检测的产物浓度(1:500比率)表示27.6%多糖转化。酶活性定义为在37℃和pH 5下在24小时反应期后的可溶性还原糖(mM)。各反应一式三份进行，注明了标准差。理论相加效应定义为各个分泌Cel6A和分泌Xyn11A的培养物的活性总和(有关详细解释参见材料和方法部分)，协同作用计算为测量的活性和假定相加的理论活性之间的比率。
图6是说明如通过RT-PCR测定的在生长期后培养物中Lp1-Cel6A和Lp2-Xyn11A之间的比率的条线图。使用以下不同的比率(Cel6A/Xyn11A)接种培养物：1/500、1/100、1/50、1/10、1/1、10/1、50/1、100/1和500/1。测定各共培养物的各质粒的总拷贝数，并计算比率。
本发明具体实施方案的描述
在本发明的一些实施方案中，本发明涉及经遗传修饰以表达纤维素分解系统的酶的乳酸菌，更具体而非排外地讲，本发明涉及纤维素酶和木聚糖酶。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要了解本发明不必在其应用方面局限于以下描述列出或实施例举例说明的细节。本发明能够有其它实施方案或以不同方式实施或进行。
在青贮作物中，乳酸菌将低分子量碳水化合物转化成乳酸，所述乳酸是秣草保藏法的主要防腐剂。在一些作物中，重要的是在青贮期间加入乳酸菌作为接种物以在促进初始阶段的发酵。
在作物(例如牧草或苜蓿)中，少量的可发酵碳水化合物限制乳酸发酵，这导致不可靠的青贮饲料保存。这可通过加入可发酵碳水化合物源或从例如植物纤维中释放后者的酶而人工改进。虽然纤维素酶有售并用作商用青贮饲料添加剂，但其应用是昂贵的。因此提出在乳酸菌中引入木质素纤维素加工酶，例如纤维素酶和木聚糖酶。
本发明人提议用纤维素酶和木聚糖酶基因的协同组合转化，其可使乳酸菌能够从青贮作物中释放较多量的可发酵碳水化合物，从而提高青贮饲料品质。
在简化本发明用以实施的同时，本发明人产生两种单独的乳酸菌群，第一种经遗传工程改造以表达纤维素酶，第二种经遗传工程改造以表达。分别证实了每个单独的群对纤维素和木聚糖的酶活性(图4)。当混合在一起形成分泌纤维素酶和木聚糖酶两者的基于两种菌株细胞的聚生体时，它们在可溶性糖从小麦麦秆的总释放中显示协同活性(图5)。对于1/5或更大的摩尔比观察到协同性(> 1)，其比分泌任一种酶的细菌有利。在Xyn11A分泌株占强主导地位的反应中，观察到最高总体活性和最大协同效应，其达到1.8的协同因子，并产生高达27.6%的可得糖（availiable sugars）。
因此，按照本发明的一个方面，提供包含生物质成分和乳酸菌群的细菌培养物，其包含：
(i) 经遗传修饰以表达分泌的纤维素酶的第一乳酸菌群；和
(ii) 经遗传修饰以表达分泌的木聚糖酶的第二乳酸菌群，其中选择第一群:第二群的比率使得培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4。
本文所用短语“乳酸菌”是指一群共同具有使糖和柠檬酸盐发醇同时产生酸的能力的革兰氏阳性微需氧或厌氧细菌，所述酸包括乳酸(为主要产生的酸)、乙酸、甲酸和丙酸。
乳酸菌的实例包括但不限于植物乳杆菌、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
术语“纤维素酶”是指内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶两者。内切葡聚糖酶将纤维素链随机切割成较小单位。外切葡聚糖酶包括纤维二糖水解酶，它从纤维素链的末端释放葡萄糖二聚体(纤维二糖)；葡聚糖水解酶，它从纤维素链的末端释放葡萄糖单体；和β-葡糖苷酶，它从纤维二糖二聚体和可溶性纤维糊精释放D-葡萄糖。
术语“外切葡聚糖酶”、“外切纤维二糖水解酶”或“CBH”是指归类为E.C. 3.2.1.91的一组纤维素酶。这些酶从纤维素的还原或非还原末端水解纤维二糖。外切纤维二糖水解酶包括但不限于归类于GH5、GH6、GH7、GH9和GH48 GH家族的酶。
术语“内切葡聚糖酶”或“EG”是指归类为E.C. 3.2.1.4.的一组纤维素酶。这些酶水解纤维素的内部β-1,4糖苷键。内切葡聚糖酶包括但不限于归类于GH5、GH6、GH7、GH8、GH9、GH12、GH44、GH45、GH48、GH51、GH61和GH74 GH家族的酶。
术语“木聚糖酶”是指将线性多糖β-1,4-木聚糖降解成为木糖的酶类，因此分解半纤维素，植物细胞壁的主要成分之一。木聚糖酶包括相当于酶委托号3.2.1.8的那些酶。木聚糖酶包括但不限于归类于GH5、GH8、GH10、GH11和GH43 GH家族的酶。
技术人员应认识到，从多种来源分离的具有纤维素酶或木聚糖酶活性的酶可用于本发明。
此外，应认识到，在本发明的乳酸菌中表达的纤维素酶和木聚糖的序列不必与来自其源生物的序列100%同源。
因此，在本发明的乳酸菌中表达的酶可以是同源物和包括序列的特定氨基酸的添加或缺失的其它修饰(例如，如使用默认参数应用国家生物技术信息中心(NationalCenter of Biotechnology Information，NCBI)的BlastP软件测定，与源生物的天然氨基酸序列有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少91%、至少93%、至少95%或更高比如说100%同源的多肽)。同源物还可以是指其直向同源物(ortholog)、缺失、插入或取代变体，包括氨基酸取代及其生物活性多肽片段。
合适的纤维素酶的一些实例包括但不限于来自以下的纤维素酶：嗜热细菌褐色喜热裂孢菌(DNA：SEQ ID NO: 12，蛋白质：SEQ ID NO: 13)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus) (蛋白质：SEQ ID NO: 28)、双孢嗜热双孢菌(Thermobispora bispora) (DNA：SEQ ID NO: 29，蛋白质：SEQ ID NO:30)和弯曲高温单孢菌(Themomonospora curvata) (DNA：SEQ ID NO: 31，蛋白质：SEQ ID NO: 32)。
合适的木聚糖酶的一些实例包括但不限于来自以下的木聚糖酶：嗜热细菌褐色喜热裂孢菌(DNA：SEQ ID NO: 14，蛋白质：SEQ ID NO: 15)、Clostridium clariflavum (DNA：SEQ ID NO: 18，蛋白质：SEQ ID NO: 19)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum) (DNA：SEQ ID NO: 20，蛋白质：SEQ ID NO:21)、Thermobifida halotolerans (DNA：SEQ ID NO: 22，蛋白质：SEQ IDNO: 23)、双孢嗜热双孢菌(DNA：SEQ ID NO: 24，蛋白质：SEQ ID NO: 25)、Thermopolyspora flexuosa (DNA：SEQ ID NO: 26，蛋白质：SEQ ID NO: 27)。
因为纤维素酶和木聚糖酶是众所周知的，且因为基因组测序的普遍性，所以本领域的技术人员可采用生物信息学方法，基于序列相似性容易地鉴定合适的纤维素酶和木聚糖酶。
本领域技术人员应充分了解，许多水平的序列同一性在鉴定来自其它物种的多肽中是有用的，其中所述多肽具有相同或类似的功能或活性。百分比同一性的有用实例包括但不限于：24%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%，或从24%到100%的任何整数百分比可用于描述本发明，例如25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
生物信息学方法通常包括使用可市购获得的或独立研发的序列分析软件。典型的序列分析软件会包括但不限于1.)程序GCG套件(Wisconsin Package 9.0版，GeneticsComputer Group (GCG), Madison, Wis.)；2.) BLASTP、BLASTN、BLASTX (Altschul等, J.Mol. Biol., 215:403-410 (1990))；3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, Wis.)；4.)Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Mish.)；和5.)并入Smith-Waterman算法的FASTA程序(W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int.Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. 编辑: Suhai, Sandor. Plenum: NewYork, N.Y.)。在本申请的文本中，应了解其中序列分析软件用于分析，分析结果会基于所引用的程序的“默认值”，除非另有说明。本文所用“默认值”会意指在最初的初始化时最初与软件一起加载的任何值或参数组。
通常应用具有已知纤维素酶/木聚糖酶氨基酸序列(例如本文提供的序列)的公开可用数据库的BLAST (上文所述)搜索以鉴定可用于本发明菌株的纤维素酶/木聚糖酶及其编码序列。
因此，本发明人还考虑来自是反刍动物肠生态系统的栖息菌的纤维降解细菌的纤维素酶和木聚糖酶。这类细菌包括生黄瘤胃球菌或白色瘤胃球菌，这些菌种每一个的菌株的基因组均已测序并部分表征[Rincon等, 2010, PLoS ONE 5, e12476]。
还考虑了来自其它中温环境(但非反刍动物)来源的合适酶的替代来源。这些包括来自下列产多纤维素酶体细菌的酶：解纤维素醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)、溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)、溶纸梭菌(Clostridium papyrosolvens)和解纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum)。
按照一个实施方案，细胞可具有至少1-29%的木糖转化收率。
本发明的细胞可具有至少约200、约250、约300、约346、约350、约400、约500、约600、约750或约1000 mg纤维素/g细胞/小时的特定的纤维素降解速率。
按照一个实施方案，细胞可具有至少1-8%的纤维素转化收率。
本发明的细胞可具有至少约200、约250、约300、约346、约350、约400、约500、约600、约750或约1000 mg纤维素/g细胞/小时的特定的纤维素降解速率。
通过用编码酶的多核苷酸转化合适的宿主细胞，来实现异源酶(例如纤维素酶和木聚糖酶)的表达。通常编码序列是用于转化的嵌合基因的一部分，其包括与编码序列有效连接的启动子以及核糖体结合部位和终止调控区。如果编码序列与对于编码酶的天然基因不是天然的调节序列组合，则即使它包括来自用于转化的宿主细胞的酶的编码序列，嵌合基因也是异源的。
本文所用术语“多核苷酸”是指以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或混合多核苷酸序列(例如上述的组合)的形式分离并提供的单链或双链核酸序列。
术语“分离的”是指至少部分从天然环境(例如从细菌细胞)分离。
本文所用术语“转化”是指将核酸片段转移到宿主生物中，导致遗传学上稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物称为“转基因”或“重组”或“转化的”生物。
术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3’。启动子可以其整体来源于天然基因，或由来源于天然存在的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成DNA片段。本领域技术人员要了解，不同的启动子可指导基因在不同的组织或细胞类型中表达，或在不同的发育阶段表达，或在响应不同的环境或生理条件时表达。引起基因在大多数时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。要进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切界限尚未完全界定，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。
密码子简并是指允许核苷酸序列变化而不影响编码多肽的氨基酸序列的遗传密码的性质。技术人员充分了解特定寄主细胞在选择核苷酸密码子用以规定给定氨基酸时表现出的“密码子偏倚”。因此，当合成用于改进在宿主细胞中的表达的基因时，合乎需要的是设计基因使得其密码子选择的频率接近宿主细胞的优选密码子选择的频率。
因此，如本领域技术人员所知，可根据选定宿主的密码子选择，使密码子优化用于表达。
术语“密码子优化”，当它涉及用于转化不同宿主的核酸分子的编码区或基因时，是指改变核酸分子的编码区或基因的密码子以反映宿主生物的典型密码子选择而不改变由DNA编码的多肽。
可用于转化多种宿主细胞的载体是常见的并描述于文献中。通常载体含有允许在所需宿主中自主复制或染色体整合的选择标志物和序列。另外，合适的载体可包含带有转录起始调控的启动子区和转录终止调控区，它们之间可插入编码区DNA片段以提供插入编码区的表达。2个调控区都可来源于与待转化的宿主细胞同源的基因，尽管应理解，所述调控区还可来源于对选择作为生产宿主的具体物种不是天然的基因。
本文所用术语“质粒”和“载体”是指常常携带不是细胞中心代谢一部分的基因并且一般呈环状双链DNA分子形式的染色体外元件。所述元件可以是来源于任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状、单链或双链的DNA或RNA，其中多个核苷酸序列连接或重组入独特的构建体中，所述构建体能够将启动子片段和选定的基因产物的DNA序列以及合适的3’非翻译序列引入细胞中。
起始调控区或启动子(其可用于驱动纤维素酶或木聚糖酶编码区乳酸菌（LAB）中表达)为本领域技术人员所熟悉。一些实例包括amy、apr和npr启动子；nisA启动子(可用于在革兰氏阳性菌中表达(Eichenbaum等, Appl. Environ. Microbiol. 64(8):2763-2769(1998))和合成的P11启动子(可用于在植物乳杆菌中表达，Rud等, Microbiology 152:1011-1019 (2006))。另外，植物乳杆菌的ldhL1和fabZ1启动子可用于在LAB中表达嵌合基因。fabZ1启动子指导具有编码(3R)-羟基肉豆蔻酰-[酰基载体蛋白质]脱水酶的第1基因fabZ1的操纵子转录。
终止调控区还可来源于不同的基因，通常对优选的宿主是天然的基因。任选终止位点可为非必需的。
可用于LAB的载体包括具有允许在大肠杆菌和LAB两者中复制和选择的2个复制起点和2个选择标志物的载体。一个实例为pFP996，其可用于植物乳杆菌和其它LAB中。用于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌(Streptococcus)转化的许多质粒和载体一般可用于LAB。合适载体的非限制性实例包括pAM β1及其衍生物(Renault等, Gene183:175-182 (1996)；和O’Sullivan等, Gene 137:227-231 (1993))；pMBB1和pMBB1的衍生物pHW800 (Wyckoff等, Appl. Environ. Microbiol. 62:1481-1486 (1996))；pMG1，一种接合质粒(Tanimoto等, J. Bacteriol. 184:5800-5804 (2002))；pNZ9520(Kleerebezem等, Appl. Environ. Microbiol. 63:4581-4584 (1997))；pAM401(Fujimoto等, Appl. Environ. Microbiol. 67:1262-1267 (2001))；和pAT392 (Arthur等, Antimicrob. Agents Chemother. 38:1899-1903 (1994))。还报道了来自植物乳杆菌的几种质粒(例如van Kranenburg R, Golic N, Bongers R, Leer R J, de Vos W M, SiezenR J, Kleerebezem M. Appl. Environ. Microbiol. 2005 March；71(3): 1223-123)。
按照一个具体的实施方案，载体基于pSIP系统，其进一步描述于Sorvig等, 2005,Microbiology 151:2439-2449；以及Mathiesen G等, Journal of applied microbiology105:215-226。
用于产生适用于本发明的载体的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，并描述于Sambrook, J., Fritsch, E. F.和Maniatis, T., Molecular Cloning: ALaboratory Manual（分子克隆：实验室手册）, 第2版, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) (下文为"Maniatis")；和Silhavy, T. J.,Bennan, M. L.和Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions（使用基因融合的实验）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984)；以及Ausubel, F. M.等, Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学现行方案）, 由Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。
由于本发明考虑分泌的纤维素酶和木聚糖酶，通常编码酶的多核苷酸编码该酶的前蛋白质形式。
术语“前蛋白质”是指连接有氨基端信号肽区的分泌的蛋白质。信号肽在分泌前被信号肽酶从前蛋白质中切除以产生“成熟的”或“分泌的”蛋白质。信号肽对于具体的酶序列可以是或不是同源的。
示例性的信号肽包括来源于植物乳杆菌WCFS1蛋白pLp_2145s (SEQ ID NO: 16)和pLp_3050s (SEQ ID NO: 17)的信号肽。
可用采本领域已知方法将载体导入宿主细胞中，所述方法例如：电穿孔(Cruz-Rodz等, Molecular Genetics and Genomics（分子遗传学和基因组学） 224:1252-154(1990)；Bringel等, Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 664-670 (1990)；Alegre等,FEMS Microbiology letters 241:73-77 (2004))和缀合(Shrago等, Appl. Environ.Microbiol. 52:574-576 (1986))。还可使用整合载体将嵌合纤维素酶或木聚糖酶基因整合到LAB的染色体中(Hols等, Appl. Environ. Microbiol. 60:1401-1403 (1990)；Jang等, Micro. Lett. 24:191-195 (2003))。
如所提及的，本发明考虑使用2个乳酸菌群，第一群经遗传修饰以表达纤维素酶，第二群经遗传修饰以表达木聚糖酶。2个群可包含相同的乳酸菌菌株。因此，例如第1细菌群可包含经遗传修饰以表达纤维素酶的植物乳杆菌，第2细菌群可包含经遗传修饰以表达木聚糖酶的植物乳杆菌。或者，2个群可包含不同的乳酸菌菌株。因此，例如第1细菌群可包含经遗传修饰以表达纤维素酶的植物乳杆菌，第2细菌群可包含经遗传修饰以表达木聚糖酶的乳酸乳球菌(L. Lactus)(反之亦然)。
还应认识到，第1和第2细菌细胞群可以是或不是纯的群(即包含单一细菌菌株)，但可以是两个或更多个细菌菌株的混合群。
2个群可以单一制品提供，各群单独包装。
按照本发明的另一个方面，提供经遗传修饰以表达分泌的纤维素酶和分泌的木聚糖酶两者的乳酸菌群。
本发明人考虑两种单独的细菌细胞群(即经修饰以表达纤维素酶的第一群和经修饰以表达木聚糖酶的第二群)或单一群(即经修饰以表达纤维素酶和木聚糖酶两者的一个群)的培养物。
培养物包含生物质成分和任选发酵培养基。
本文所用术语“生物质成分”是指包含纤维素和木聚糖(或可被降解以产生纤维素或木聚糖的其它聚合物)的生物材料。
按照一个实施方案，生物质成分包含纤维素和半纤维素。
纤维素是植物细胞壁中最丰富的聚合物，构成其含量的30-40%。第2种是半纤维素，构成20-25%。纤维素聚合物由以线性方式通过β-(1-4)糖苷键连接的D-葡萄糖亚基组成。葡萄糖的重复二聚体被称为纤维二糖，并且被视作基本纤维素亚单元。半纤维素由多种系列（a versatile array）的支链糖聚合物组成，其中木聚糖最为丰富。通过β-(1-4)糖苷键连接的2单位的D-木糖单体构成称为木二糖的木聚糖的基本亚单元。除了这些基本单位以外，木聚糖通常含有与之连接的各种糖侧链。这2种聚合物合起来占了植物细胞壁的大部分。
生物材料可以是活的或死的。生物质成分可另包括木质素纤维素、半纤维素、木质素、甘露聚糖和常见于生物质中的其它材料。生物质成分来源的非限制性实例包括草(例如柳枝稷、芒属植物(Miscanthus))、稻壳、甘蔗渣、棉、黄麻、桉树、大麻、亚麻、竹、剑麻、马尼拉麻、麦秆、树叶、草屑、玉米秸草、玉米芯、酒糟、豆科植物、高粱、甘蔗、甜菜浆、木屑、锯屑和生物质作物(例如两节荠属植物)。生物质聚合物的来源可以是非精制的植物原料(例如离子性液体处理的植物生物质)或精制的生物质聚合物(例如山毛榉材木聚糖或磷酸溶胀纤维素)。生物质成分的其它来源包括纸、纸制品、废纸、木、碎料板、锯屑、农业废料、污水、青贮饲料、草、稻壳、甘蔗渣、黄麻、大麻、亚麻、竹、剑麻、马尼拉麻、麦秆、玉米芯、玉米秸草、柳枝稷、苜蓿、干草、椰子棕、棉、海草、藻类及其混合物。
除生物质材料以外，发酵培养基可含有本领域技术人员已知的适于培养物生长的合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂和其它成分。通常使细胞在范围为约25℃-约40℃的温度下在合适的培养基中生长。用于使乳酸菌生长的合适培养基是本领域已知的。选择用于特定细菌菌株生长的培养基会是微生物学或发酵学学科领域的技术人员已知的。还可将已知直接或间接调节分解代谢产物阻抑的剂(例如环腺苷2’:3’-单磷酸盐)的使用并入发酵培养基中。
可用于遗传修饰的细菌增殖的示例性培养基可包含至少10、至少20、至少30、至少40、至少50种或全部本文下表1所列成分—参见例如Wegkamp等, Letters in AppliedMicrobiology, 50 (2010) 57-64。表1还提供各成分的示例性浓度。
用于发酵的合适的pH范围介于pH 4.5与pH 7.0之间，其中优选pH 5.0-pH 6.0作为初始条件。
发酵可在需氧或厌氧条件下进行，其中优选厌氧或微需氧条件。
选择培养物中各群的相对比率使得培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4。
按照一个具体的实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于4:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于5:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于6:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于7:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于8:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于9:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于10:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于20:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于30:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于40:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于50:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中木聚糖酶:纤维素酶的比活大于4:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中木聚糖酶:纤维素酶的比活大于5:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中木聚糖酶:纤维素酶的比活大于6:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中木聚糖酶:纤维素酶的比活大于7:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中木聚糖酶:纤维素酶的比活大于8:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中木聚糖酶:纤维素酶的比活大于9:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中木聚糖酶:纤维素酶的比活大于10:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中木聚糖酶:纤维素酶的比活大于20:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中木聚糖酶:纤维素酶的比活大于30:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中木聚糖酶:纤维素酶的比活大于40:1。
按照一个具体的实施方案，培养物中木聚糖酶:纤维素酶的比活大于50:1。
本文所用术语“比活”是指在规定时间内和在规定温度下每规定量的蛋白质所消耗的底物和/或所产生的产物的量。
本发明的培养物还可包含能够降解木质素的酶。所述酶包括苯酚氧化酶例如木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶，其可包括在诸如黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)和变色栓菌(Trametes versicolor)等白腐真菌中。漆酶具有宽泛的底物特异性，并随氧自由基的形成氧化酚类和木质素亚结构。参与木质素降解过程的其它酶是产H2O2的酶和氧化还原酶，其可位于胞内或胞外。细菌和真菌阿魏酸酯酶和对香豆酸酯酶是能够释放阿魏酰基和对香豆酰基的相对新的酶，并在禾本科植物坚硬细胞壁（recalcitrant cell wall）的生物降解中起重要作用。
本发明的培养物可用于加工木质素纤维素。在木质素纤维素的代谢后，释放的戊糖可用于产生诸如生物燃料(例如乙醇、丁醇)或聚乳酸等产品。
因为占优势的乳酸发酵是制备好的青贮饲料的关键，所以本发明的培养物可用于青贮饲料产品。青贮饲料是通过受控发酵具有高水分的作物残茬或草料产生的材料。目的是通过自然发酵经达到厌氧条件并阻止梭菌生长来保存草料。
本文所用术语“约”是指± 10%。
术语“包含”、“含有”、“包括”、“含”、“具有”及其变化形式意指“包括但不限于”。
术语“由……组成”意指“包括并限于”。
术语“基本由……组成”意指组成、方法或结构可包括其它成分、步骤和/或部分，但只要其它成分、步骤和/或部分不物质上(materially)改变所要求保护的组成、方法或结构的基本和新的特征。
本文所用单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
在本申请中，本发明的不同的实施方案可以范围形式存在。应了解，范围形式的描述仅出于方便和简洁，不应解释为本发明范围的不可变更的限制。因此，范围的描述应视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围的各个数值。例如，范围例如1-6的描述应视为具体公开了诸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范围，以及该范围的各个数，例如1、2、3、4、5和6。不论范围宽度均适用。
每当本文标示数值范围时，均意指包括该标示范围的任何引述的数值(分数或整数)。短语“介于”第一标示数字和第二标示数字“之间的一个范围/多个范围”和“从”第一标示数字“到”第二标示数字“的一个范围/多个范围”在本文互换使用，意指包括第一标示数字和第二标示数字和其间的所有分数和整数。
本文所用术语“方法”是指用于完成指定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域从业人员已知或容易由他们从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
要认识到，为了清楚起见，在单独的实施方案的背景下描述的本发明的某些特征，也可在单一实施方案中组合提供。相反，出于简洁起见，在单一实施方案的背景下描述的本发明的不同特征，也可单独提供或以任何合适的亚组合提供或适用于本发明的任何其它描述的实施方案的方式提供。在不同实施方案的背景下描述的某些特征不视为所述实施方案的必需特征，除非该实施方案在无所述要素时是无效的。
在下面的实施例中，得到对上文描述和随附权利要求书部分要求保护的本发明的不同实施方案和方面的实验支持。
实施例
现参照以下实施例，其连同上文的描述，以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。
一般而言，本文所用命名法和用于本发明的实验室程序包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。参考文献中全面阐释了所述技术。参见例如"Molecular Cloning: ALaboratory Manual（分子克隆：实验室手册）" Sambrook等(1989)；"Current Protocolsin Molecular Biology（分子生物学现行方案）" 第I-III卷Ausubel, R. M.编辑(1994)；Ausubel等, "Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学现行方案）", JohnWiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide toMolecular Cloning（分子克隆的实践指南）", John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson等, "Recombinant DNA（重组DNA）", Scientific American Books, New York；Birren等(编辑) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series（基因组分析：实验室指南系列）", 第1-4卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057列出的方法；"CellBiology: A Laboratory Handbook（细胞生物学：实验手册）", 第I-III卷Cellis, J. E.编辑(1994)；Freshney, "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique（动物细胞培养-基础技术指南）", Wiley-Liss, N. Y. (1994), 第3版；"CurrentProtocols in Immunology（免疫学当前方案）" 第I-III卷Coligan J. E.编辑(1994)；Stites等(编辑), "Basic and Clinical Immunology（基础和临床免疫学）" (第8版),Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell和Shiigi (编辑), "SelectedMethods in Cellular Immunology（细胞免疫学选择的方法）", W. H. Freeman and Co.,New York (1980)；可用的免疫测定法大量描述于专利和科学文献中，参见例如美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis（寡聚核苷酸合成）" Gait, M. J.编辑(1984)；“Nucleic Acid Hybridization（核酸杂交）" Hames, B. D.和Higgins S. J., 编辑(1985)；"Transcription and Translation（转录和翻译）" Hames, B. D.和Higgins S.J., 编辑(1984)；"Animal Cell Culture" Freshney, R. I.编辑(1986)；"ImmobilizedCells and Enzymes（固定的细胞和酶）" IRL Press, (1986)；"A Practical Guide toMolecular Cloning（分子克隆的实践指南）" Perbal, B., (1984)和"Methods inEnzymology（酶学方法）" 第1-317卷, Academic Press；"PCR Protocols: A Guide ToMethods And Applications（PCR方案：方法和应用指南）", Academic Press, San Diego,CA (1990)；Marshak等, "Strategies for Protein Purification andCharacterization - A Laboratory Course Manual（蛋白质纯化和表征的策略-实验过程指南）" CSHL Press (1996)；其全部通过引用予以结合就像在本文完全阐述一样。在该整个文件中提供其它通用参考文献。其中的方法被视为是本领域众所周知的，出于方便读者而提供。其中所含全部信息通过引用结合到本文中。
材料和方法
克隆：如前所述从褐色喜热裂孢菌基因组DNA克隆野生型酶Cel6A和Xyn11A(21，22)。设计pET28a中的酶构建体以含有His标签用于后续纯化。
对于植物乳杆菌中的表达和分泌，使用SalI或XhoI(SalI与XhoI相容)和HindIII限制位点，通过用合适的扩增基因片段置换这些质粒中的淀粉酶基因，将糖苷水解酶克隆到模块式分泌质粒pLp_2145sAmy和pLp_3050sAmy (15)中。为了此目的，使用正向引物5’-tcttCTCGAGatggcatcccccagacctct-3’ (SEQ ID NO: 1)和反向引物5’-aatAAGCTTtcagctggcggcgcaggtaag-3’(SEQ ID NO: 2) (XhoI和HindIII位点为大写字母)，扩增Cel6A编码基因。使用5’-tcttGTCGACatggccgtgacctccaacgag-3’ (SEQ ID NO:3)和5’-aatAAGCTTctagttggcgctgcaggaca-3’ (SEQ ID NO: 4)引物(SalI和HindIII位点为大写字母)，克隆扩增的Xyn11A编码基因。pLp_2145s构建体称为Lp1，而含有pLP_3050s的构建体称为Lp2。
pLp_2145sAmy和pLp_3050sAmy是pSIP400系列的一部分(13)。作为对照，将2种酶也克隆到pSIP407 (称为No-Lp)中，它含有与Lp1和Lp2相同的复制子和启动子但没有前导肽(13)。为了制备这些构建体，将存在于pSIP407中的pepN基因用含有cel6A基因的NcoI-XbaI片段或含有xyn11A基因的BspHI-XbaI片段置换，这导致该基因与启动子转录融合(BspHI与NcoI相容)。为了此目的，使用正向引物5’-atatatCCATGGatggcatcccccagacctcttcgc-3’(SEQ ID NO: 5)和反向引物5’-atatatTCTAGAtcactccaggctggcggcgcagg-3’ (SEQ ID NO: 6；NcoI和XbaI位点为大写字母)，扩增Cel6A编码基因。使用5’-tcagtcTCATGAatggccgtgacctccaacgagaccgg-3’ (SEQID NO: 7)和5’-agcgtaTCTAGActagttggcgctgcaggacacc-3’引物(SEQ ID NO: 8；BspHI和XbaI位点为大写字母)，克隆扩增的Xyn11A编码基因。
为了产生空的pLP_2145s和pLP_3050s，使用SalI和EcoRI限制性酶切除Amy基因。将线性化质粒纯化，并使用Quick Blunting Kit (NEB，MA，USA)平端化。平端片段自连产生空质粒。
PCR反应使用Phusion High Fidelity DNA聚合酶F530-S (New EnglandBiolabs，Inc)进行，使用HiYieldTM Gel/PCR Fragments Extraction Kit (Real BiotechCorporation，RBC，Taiwan)纯化DNA样品。限制性酶购自New England Biolabs (Beverly，MA)，T4 DNA连接酶购自Fermentas (Vilnius，Lithuania)。使植物乳杆菌质粒亚克隆入大肠杆菌TG1感受态细胞(Lucigen Corporation，WI，USA)中。植物乳杆菌菌株WCFS1按照Aukrust等人的方案转化(23)。对于植物乳杆菌和大肠杆菌，用于阳性克隆选择并加入培养基中的抗生素分别为10 µg/ml和200 μg/ml红霉素。
大肠杆菌中的蛋白质表达和纯化：如较早的报道，使质粒pCel6A和pXyn11A在大肠杆菌BL21 (lDE3) pLysS细胞中表达，并在Ni-NTA柱(Qiagen)中纯化带His标签的酶(24)。在10%丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE测试重组蛋白质的纯度，使用Amicon离心过滤器(Millipore，France)合并和浓缩含有纯的重组蛋白质的流分。以用Protparam工具计算的理论消光系数，通过测量280 nm处的吸光度，确定蛋白质浓度。将蛋白质在50% (v/v)甘油中保存在-20℃下。
用于纯的酶的活性测定法：在含有0.5 μM酶和7.5g/l磷酸溶胀的维素(PASC，按Lamed等人所述制备(25))或50 mM柠檬酸盐缓冲液pH 5或6中的2% 燕麦斯佩耳特小麦木聚糖(Sigma Chem. Co, St. Louis MO)的反应物中测试纯化的重组Cel6A和Xyn11A的活性。将样品在37或50℃下孵育30分钟，通过置于冰上冷却至0℃，然后在4℃下以14000 rpm离心5分钟。通过下述DNS方法，测定上清液中可溶性还原糖的量。
植物乳杆菌中的蛋白质表达：使带有pSIP衍生的表达质粒的植物乳杆菌WCFS1的新接种的培养物在37℃下MRS液体培养基(BD DifcoTM，Franklin Lakes，NJ，USA)，含有10 μg/ml红霉素)中生长。通过加入用于sakacin P生产的诱导肽(Caslo Laboratory，Denmark) (26)至25 ng/ml的终浓度在OD600为0.3时诱导基因表达，并在37℃下再孵育3小时。对于共培养实验，将产生纤维素酶或木聚糖酶的菌株分别以相等的OD或以不同的比率混合，然后生长并以相同的方式诱导。
蛋白质印记法：在SDS-PAGE凝胶(10%丙烯酰胺)上分离培养上清液的蛋白质，并使用Trans-Blot® Cell Mini (Bio-Rad Laboratories Ltd，Israel)转移到硝化纤维膜上。通过将膜与5% BSA (在Tris Buffer Saline-Tween 20，TBS-T中制备)一起孵育1小时，封闭非特异性蛋白质相互作用。然后将膜用TBS-T漂洗2次(1分钟)。将针对各种酶的兔抗体(由Sigma，Israel制备)在含有1% BSA的TBS-T中与合适的膜一起孵育1小时。再次将膜用TBS-T漂洗2次(1分钟)，然后与1:10000稀释度的第二抗体小鼠抗兔辣根过氧化物酶(HRP)一起孵育1小时。如上述将膜漂洗，然后用TBS + 1% Triton X-100漂洗2次(30分钟)。通过将膜与等量的ECL溶液A和B (Ornat，Israel)一起孵育1分钟，使印迹显影。采用发光影像分析仪ImageQuant LAS 4000 Mini (Danyel Biotech，Israel)，定量测定化学发光。
点印迹法：采用Amicon离心过滤器(Millipore，France)，将表达Cel6A酶、在OD600= 1下的50 ml体积培养物(Lp1、Lp2或No-Lp)浓缩50倍。对于Xyn11A酶，将1 ml在OD600=1下的各培养物(Lp1、Lp2或No-Lp)在TBS中透析以除去MRS培养基。通过将2 μl合适的溶液(在TBS中)施加到硝化纤维膜(Whatman)上，以对于纤维素酶以0.5-20 nM或对于木聚糖酶以0.1-10 nM的浓度范围对纯化的酶进行印迹。通过施加2 μl培养物对浓缩的和/或透析的培养上清液进行印迹。然后进行用于蛋白质印迹的上述方案。
刚果红测定法：遵照Anbar的方案并加以修改(27)。对于木聚糖酶活性检测使用燕麦斯佩耳特小麦木聚糖(0.3%)而不是羧甲基纤维素(CMC)。将转化的植物乳杆菌细胞铺展在含有红霉素(10 μg/mL)的MRS板上，并在37℃下孵育过夜。将板用含有0.3% (w/v)CMC或燕麦斯佩耳特小麦木聚糖(用于纤维素酶或木聚糖酶活性检测)、0.7%琼脂和200 μl柠檬酸盐缓冲液(25 mM，pH 5.0)中的0.1 μg/ml pSIP诱导肽的20 ml软琼脂覆盖。将板在37℃下孵育2小时以诱导酶表达和活性。然后将板用新的刚果红溶液(0.25%)染色10分钟，在1 M NaCl中脱色。菌落周围晕圈的形成表示内切葡聚糖酶或内切木聚糖酶活性的产生。
活性测定法：通过将从0到100 nM (终浓度)变化的纯的重组Cel6A或30 μl体积的浓缩培养物上清液(如上所述)在200 μl最终体积的50 mM乙酸盐缓冲液pH 5.0中与150 μl 7.5 g/l磷酸溶胀纤维素(PASC)混合，来测定PASC降解。将样品在37℃下孵育18小时，并通过将样品管浸入冰水中终止反应。以14000 rpm将样品离心2分钟以除去底物。
木聚糖酶测定混合物由100 μl含纯化的Xyn11A酶(0-5 nM)的缓冲液(50 mM柠檬酸盐缓冲液pH 6.0)或50 mM同一缓冲液中、体积为30 μl的透析的培养物上清液组成。加入100 μl 2% 燕麦斯佩耳特小麦木聚糖开始反应，在37℃下继续2小时。将管转移到冰水浴中终止反应，接着以14000 rpm离心2分钟。
如前所述将由Valagro (Poitiers，France)提供的小麦麦秆(0.2–0.8 mm)洗涤(28，29)。然后在室温下对材料进行次氯酸钠(12%)预处理1小时(30)。在200 μl含有3.5 g/l预处理小麦麦秆和30 μl浓缩的或透析的培养上清液的50 mM乙酸盐/柠檬酸盐缓冲液pH5-6.0中进行降解测定。在来自分泌Cel6A和Xyn11A酶的菌株的共培养物(50 ml，在OD600= 1时)的上清液的情况下，采用Amicon离心过滤器(Millipore，France)浓缩50倍。使反应物在37℃下孵育24小时。
所有测定一式三份进行。通过二硝基水杨酸(DNS)方法测量从多糖底物释放的可溶性还原糖，来定量地测定酶活性(31，32)。将DNS溶液(150 μl)加入100 μl样品中，在煮沸反应混合物10分钟后，测量540 nm处的吸光度。利用葡萄糖标准曲线测定糖浓度。
协同作用的评价：为了测定共培养物中的理论酶活性(相加效应)，自两个不同的测定法计算酶活性。在各测定法中，使酶分泌株之一连同各自携带空质粒的对照菌株的共培养物生长(并如上所述诱导)，针对酶活性对其上清液进行分析。通过计算各个测量的酶的每一种的活性总和，计算理论相加活性。例如，对于1/500比率，将1体积的Cel6A分泌株(Lp1)和500体积的携带空pLp_3050s质粒的菌株(作为Xyn11A分泌株(Lp2)的替换)共培养。平行地，将1体积的携带空pLp_2145s质粒的菌株(作为Cel6A分泌株(Lp1)的替换)和500体积的Xyn11A分泌株(Lp2)共培养。分别测定30 μl来自各共培养物的浓缩上清液(如上针对共培养物实验所述)对小麦麦秆底物的酶活性，加在一起，并定义为理论相加效应。然后将这些值与相应的纤维素酶分泌株和木聚糖酶分泌株的合并的共培养物的值进行比较。
质粒提取：如上所述使纤维素酶分泌株和木聚糖酶分泌株的共培养物生长。在OD600 = 1下，通过在4℃下以5000 g离心10分钟，使细胞从5 ml的培养物中沉淀，并在200 μl High-Speed Plasmid Mini Kit (Geneaid，New Taipei City，TW)的PD1缓冲液中重新悬浮。将溶菌酶加入悬液中至3 mg/ml的终浓度。使悬液在37℃下孵育15分钟，然后如下进行5个冻融循环：使样品浸没在液氮中3分钟，转移到70℃水浴维持另外3分钟，然后轻轻但彻底地混合。在该步骤后，按照生产商说明书实施方案。
实时PCR：进行定量实时PCR分析以验证细菌聚生体中纤维素酶分泌株和木聚糖酶分泌株之间的比率。使用正向引物5’-ATTTAGCTGGCTGGCGTAAAGTATG-3’ (SEQ ID NO:9)用于两种质粒和反向引物5’-TCATTTCAGGATTGATCATTGTTGC-3’ (SEQ ID NO: 10)用于pLP_2145s (Lp1)和5’-GACGACCCCGAAGACACAACTAG-3’ (SEQ ID NO: 11)用于pLP_3050s(Lp2)，使各质粒的特定片段(对于pLP_2145s和pLP_3050s分别为140和124bp)扩增。通过扩增系列10倍稀释的通过各片段扩增获得的量化的凝胶提取的PCR产物，产生适于各质粒量化的各个标准曲线。标准曲线使用4个稀释点获得，并应用Rotorgene 6000系列软件(Qiagen，Hilden，Germany)计算。利用所产生的标准曲线，用相同程序计算随后的定量。作为阳性对照，将用于标准曲线的具有已知浓度的一种纯化的产物加入各定量反应中。这还用来评价反应的再现性并将结果与标准曲线拟合。实施了2个阴性对照；第1个含有质粒之一的纯化产物和另一个的引物。实施它是为了排除引物交叉反应性的可能性。第2对照不含任何DNA模板。所有所获得的标准曲线符合所需的效率标准(R2 > 0.99，90% < E < 115%)。评价了培养物中各质粒的拷贝数，并且确定质粒间的比率。在10 µl含有5 µl AbsoluteBlue SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific，MA，USA)、0.5 µl各引物(10 µM工作浓度)、2 µl不含核酸酶的水和2 µl 10 ng/µl DNA模板的反应混合物中进行实时PCR。扩增包括在95℃下15分钟的一个保持循环用于初始变性和热启动聚合酶系统的激活，然后30个循环：在95℃下10 s ，接着在53.3℃下退火20 s和在72℃下延伸20 s。为了测定扩增的特异性，通过以1℃的增额从45℃到99℃慢慢加热并收集荧光，来监测PCR产物的解链曲线。
结果
木质素纤维素分解酶的选择。用于植物乳杆菌转化的精选酶来源于极充分表征的纤维素分解细菌褐色喜热裂孢菌。该细菌产生仅6种纤维素酶和4种木聚糖酶的一组酶。已知这些适度嗜热的酶具有宽泛的温度-活性和pH-活性(37)，这可能与乳酸杆菌发酵期间预期的条件相容。
对于最初的研究，我们聚焦于褐色喜热裂孢菌(T .fusca)内切葡聚糖酶Cel6A(这是由纤维二糖高度诱导的(38))和内切木聚糖酶Xyn11A，其为在木聚糖中的生长期间产生的最丰富的木聚糖酶(39)。除其催化模件外，Cel6A具有与纤维素选择性结合的C端家族2CBM，Xyn11A含有结合纤维素和木聚糖两者的C端家族2 CBM。酶的分子质量对于Cel6A和Xyn11A分别为46,980 Da和33,168 Da。Cel6A和Xyn11A的选择还基于在酸性条件(在pH 5.0下的活性> 在pH 6.0下的活性的90%)和在37℃下(对于Cel6A和Xyn11A分别为在50℃下的活性的~40%和~70%)的其可观的残留活性和其简单的模块式结构，这与植物乳杆菌的正常生长相符(图1)。
通过植物乳杆菌进行的酶分泌。使用针对各酶的特异性抗体，通过蛋白质印迹法观察到培养基中分泌的酶的存在(图2A-B)。在携带Lp1和Lp2分泌质粒的菌株的胞外部分中可观察到酶，所观察到的条带与其理论质量十分相符。还观察到降解产物，即较小的条带。携带没有分泌肽的表达质粒的菌株的上清液中未检出胞外酶(图2，泳道3)。
通过刚果红方法(数据未显示)和通过培养上清液的活性测定法(图3A-D；见下)，检出转化菌落中的胞外纤维素酶和木聚糖酶活性。采用刚果红测定法，具有各酶的胞内表达的对照培养物不显示任何活性，而且其上清液对木聚糖或PASC不显示水解活性。
通过点印迹分析或通过测量PASC或木聚糖底物中的还原糖形成，比较胞外部分与系列稀释的纯化酶来计算不同培养物中分泌的酶的浓度。估计OD600= 1时的纤维素酶浓度对于Lp1和Lp2分泌质粒分别为0.33 nM和0.27 nM。对于木聚糖酶，估计这些值分别为2.7nM和3.3 nM (图3C，D)。通过点印迹法定量或酶活性方法计算的浓度对于2种酶是相似的，表明了分泌的酶的主要部分是有功能的，并且表达和分泌过程基本上不影响其活性。在不加入蛋白酶抑制剂的情况下在4℃下保存几天后，培养上清液保持完全（full）纤维素酶/木聚糖酶活性。
具有胞内表达的菌株的培养上清液不显示酶活性的事实(图3 C和D)，表明所Lp1和Lp2构建体检出的活性正确地反映了分泌的酶，并且不来源于细胞裂解。
小麦麦秆降解：在酶促降解前，用起降低木质素含量的作用的次氯酸钠对小麦麦秆进行化学预处理同时保留纤维素/半纤维素流分以促进酶促降解。预处理的小麦麦秆的化学组成为63%纤维素、31%半纤维素和3%木质素(30)。分泌的纤维素酶和分泌的木聚糖酶两者显示对预处理的小麦麦秆的酶活性(图4)。
当在小麦麦秆上孵育时，Cel6A分泌株(Lp1)和Xyn11A分泌株(Lp2)的共培养物的上清液显示出活性(图5)。对于1/50和更大比率观察到协同活性(> 1)，其比分泌任一酶的细菌有利。在Xyn11A分泌株占强主导地位的反应中，观察到最高总体活性和最大协同效应并产生高达27.6%的可得糖(图5)，表明了通过Xyn11A进行的木聚糖降解是一个比通过Cel6A进行的纤维素降解更快的过程。这个观察结果进一步表明，与纤维素降解对于木聚糖可得性的有益性相比，木聚糖降解对于纤维素的可得性的有益性更大。在生长期结束时不同质粒的RT-PCR显示细菌菌株的比率保持与接种比率相似(图6)，因此表明2种蛋白质的表达和分泌对细菌的生长速率不具有差异影响。
讨论
在该实施例中，公开了通过植物乳杆菌成功地产生并分泌纤维素酶和木聚糖酶。尽管采用相同的克隆策略，但是酶以不同水平产生。使用小麦麦秆降解的效率作为输出参数，建立了包含2种所得菌株的优化细胞聚生体。这些结果提供针对先进的生物质转化进行乳杆菌工程改造的原理证明。褐色喜热裂孢菌酶显示范围为50-60℃的最适温度，但仍选择其在37℃和pH 5下相当大的残留活性(图1)，所述37℃和pH 5即在植物乳杆菌培养物中常用的条件。
作为通向更复杂的生物转化的第一步，本发明人研究了分泌2种酶的重组细菌的共培养物。这种方法是可行的，因为异源酶的表达不影响细菌生长，意味着在生长期内菌株比率保持得相当稳定。
使用共培养物的优势是可通过在接种期间调节各个细胞类型的比率容易地优化细胞聚生体。在最新的出版物中，具有优化内切葡聚糖酶:外切葡聚糖酶:β-葡糖苷酶比率的酿酒酵母细胞的混合物与由等量的各个细胞类型组成的细胞相比产生1.3倍的乙酸，表明了用于木质素纤维素生物加工的细菌聚生体的有用性(44)。还可采用这类方法平衡可能不同的生产水平，如本研究中针对Cel6A和Xyn11A所观察的一样。
转化的植物乳杆菌细胞能够降解木聚糖或纤维素和小麦麦秆。有趣的是，对于与大量木聚糖酶的组合，共培养显示明显的协同效应，其协同因子达到1.8。这些结果表明木聚糖酶在解构底物中的作用使纤维素可接近纤维素酶，如之前的研究所述(45-47)。
对其它细菌的若干研究表明产生这些木质素纤维素分解酶的植物乳杆菌可能具有有吸引力的应用。例如，将来自芽孢杆菌ATCC 21833的纤维素酶整合到植物乳杆菌的基因组中导致苜蓿青贮饲料发酵的效率提高(48)。报道了用Neocallimastix sp.纤维素酶转化的乳酸乳球菌菌株的类似结果(49)。编码纤维溶解酶的基因在乳杆菌中的表达对于肠益生菌菌株的生长也是有益的(50-52)。最近，报道了β-葡聚糖酶和木聚糖酶在路氏乳杆菌(L. reuteri)中的共表达(52)，且转化的菌株显示对可溶性β-葡聚糖和木聚糖的酶活性。
尽管本发明结合其具体的实施方案加以描述，但是显然许多替换、修改和变动对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，本发明意图包括所有落入所附权利要求书的精神和大范围中的这些替换、修改和变动。
本说明书所提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用以其整体结合到本说明书中，其程度与每个独立出版物、专利或专利申请具体而单独指明通过引用结合到本文中一样。另外，在本申请中，任何参考文献的引用或标识(identification)都不得解释为承认这样的参考文献作为本发明的现有技术是有效的。就使用章节标题所使用的程度而言，它们不应解释为必然限制性的。
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Claims (27)
1. 一种包含生物质成分和乳酸菌群的细菌培养物，其包含：
(i) 经遗传修饰以表达分泌的纤维素酶的第一乳酸菌群；和
(ii) 经遗传修饰以表达分泌的木聚糖酶的第二乳酸菌群，其中选择第一群:第二群的比率使得培养物中纤维素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4。
2.一种乳酸菌群，其经遗传修饰以表达分泌的纤维素酶和分泌的木聚糖酶。
3.一种培养物，其包含权利要求2的乳酸菌群和生物质成分。
4.权利要求3的培养物，其中培养物中纤维素酶:木聚糖酶的摩尔比率大于4:1或小于1:4。
5.权利要求1或4的培养物，其中培养物中纤维素酶:木聚糖酶的所述比活比率大于10:1或小于1:10。
6.权利要求5的培养物，其中培养物中纤维素酶:木聚糖酶的所述比活比率小于1:10。
7.权利要求1或2的培养物或乳酸菌群，其中用于表达所述分泌的纤维素酶和所述分泌的木聚糖酶的表达质粒是pSIP衍生的表达质粒。
8.权利要求1或3的培养物，其中所述生物质包含木质素纤维素。
9.权利要求1或3的培养物，其中所述生物质包含纤维素和半纤维素。
10.权利要求9的培养物，其中所述生物质另包含木质素。
11.权利要求1或3的培养物，其中所述生物质选自纸、纸制品、废纸、木、碎料板、锯屑、农业废料、污水、青贮饲料、草、稻壳、甘蔗渣、黄麻、大麻、亚麻、竹、剑麻、马尼拉麻、麦秆、玉米芯、玉米秸草、柳枝稷、苜蓿、干草、椰子棕、棉、海草、藻类及其混合物。
12. 乳酸菌群，其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
13.权利要求1的培养物，其中所述第一乳酸菌群包含植物乳杆菌。
14.权利要求1或13的培养物，其中所述第二乳酸菌群包含植物乳杆菌。
15. 权利要求1-14中任一项的培养物或乳酸菌群，其中所述纤维素酶是褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)纤维素酶。
16.权利要求1-14中任一项的培养物或乳酸菌群，其中所述木聚糖酶是褐色喜热裂孢菌木聚糖酶。
17.权利要求1-14中任一项的培养物或乳酸菌，其中所述纤维素酶是中温菌纤维素酶。
18.权利要求1-14中任一项的培养物或乳酸菌，其中所述木聚糖酶是中温菌木聚糖酶。
19. 权利要求17或18的培养物或乳酸菌，其中所述中温菌是生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)或白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)。
20. 权利要求1-14中任一项的培养物或乳酸菌，其中所述纤维素酶包含SEQ ID NO:16或17所列出的前导序列。
21. 权利要求1-14中任一项的培养物或乳酸菌，其中所述木聚糖酶包含SEQ ID NO:16或17所列出的前导序列。
22.权利要求1的培养物，其中所述第一群和所述第二群包含相同的细菌菌株。
23.权利要求1的培养物，其中所述第一群和所述第二群包含不同的细菌菌株。
24.一种加工木质素纤维素的方法，所述方法包括使权利要求8的培养物增殖，从而加工所述木质素纤维素。
25.权利要求24的方法，所述方法另包括降解所述木质素纤维素的木质素。
26.包含权利要求1或3中任一项的培养物的青贮饲料。
27.按照权利要求24的方法通过加工木质素纤维素产生的青贮饲料。
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