CN106109495A - 一种活体动态示踪肿瘤细胞浸润坐骨神经的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种活体动态示踪肿瘤细胞浸润坐骨神经的方法，其包括如下步骤：A、在裸鼠体外以示踪剂转染肿瘤细胞；B、将已经转染示踪剂的肿瘤细胞注射于裸鼠的坐骨神经外膜下；C、每个时间点对坐骨神经进行MR扫描。本发明以示踪剂标记肿瘤细胞，通过MR扫描，不仅早期观察到肿瘤细胞浸润坐骨神经现象(较传统评估坐骨神经浸润的方法，如坐骨神经功能评估、影像学观察肿瘤大小以及坐骨神经直径等，提前了约一半的时间)，而且活体动态示踪了肿瘤细胞沿坐骨神经转移的过程。

Description

一种活体动态示踪肿瘤细胞浸润坐骨神经的方法

技术领域

本发明涉及一种活体动态示踪肿瘤细胞浸润坐骨神经的方法。

背景技术

外周神经浸润(PNI)是复杂的病理过程，涉及肿瘤细胞、神经纤维及肿瘤基质，缺乏理想疾病模型限制了PNI的研究。较早期体外研究利用Boyden小室铺Matrigel胶模拟基底膜，寻找和验证与肿瘤侵袭或转移相关神经营养因子，但这种方法未能直接说明肿瘤细胞浸润神经。2001年，Ayala等首次报道了建立肿瘤细胞PNI的体外三维培养模型，即Matrigel/DRG模型。利用此模型可以动态观察肿瘤细胞对DRG的侵袭，是目前研究PNI最常用体外培养方法，本课题前期工作的体外实验也选择了此模型。

目前PNI体内模型主要有：化学剂诱导成瘤模型、原位接种肿瘤模型、皮下移植成瘤模型以及坐骨神经浸润模型。研究表明，前面三种模型均能观察到PNI的发生，但化学剂诱导、原位接种成瘤均存在造模困难，创伤大、成功率低等缺点；而皮下成瘤并不能模拟胰腺周围富神经的条件，无法为研究PNI提供理想的实验条件。而且，以上三种模型均无间接征象可观察到PNI，需将动物处死行病理检验后方能确定有无PNI。

坐骨神经浸润模型即将肿瘤细胞接种于坐骨神经鞘内，模拟神经微环境，观察肿瘤细胞在神经内的生长特性及其对坐骨神经的浸润情况。Mashour等首次建立坐骨神经浸润模型，用于评估溶瘤病毒对神经转移瘤的治疗效果。此模型通过评估动物坐骨神经的功能间接评估肿瘤PNI情况，为实验过程中PNI程度提供了一个可观察指标。

坐骨神经浸润模型可通过观察坐骨神经功能间接评估PNI，但此时肿瘤已经显著长大、浸润坐骨神经，而PNI的发生早期可能只涉及少量肿瘤细胞，在明显成瘤前已经开始。由于坐骨神经较为表浅，走形固定，较多研究者通过B超、MRI等影像检查手段评估肿瘤与神经的关系，即神经变粗、周围有组织增生等。但影像学改变是肿瘤沿神经转移间接证据，并不能直接说明是肿瘤细胞侵犯神经，最终仍需将动物处死后进行病理学检验证实。

发明内容

本发明的目的是提供一种活体动态示踪肿瘤细胞浸润坐骨神经的方法，其可早期、无创示踪神经浸润的过程。

为了实现上述目的，本发明提供了一种活体动态示踪肿瘤细胞浸润坐骨神经的方法，其包括如下步骤：

A、在裸鼠体外以示踪剂转染肿瘤细胞；

B、将已经转染示踪剂的肿瘤细胞注射于裸鼠的坐骨神经外膜下；

C、每个时间点对坐骨神经进行MR扫描。

相对于其他如PET、荧光成像等可用于示踪的显像手段，MR成像具有无创伤、成像深度无限制、高图像分辨率等无可比拟的优势。

现有技术中，有将转染示踪剂的肿瘤细胞注射于小鼠心脏、肝脏的方案，在这样的方案中，每次进行MR扫描时，仅仅显示转移灶的位置，并不能显示转移灶的转移路径。采用本发明的方法，可以动态显示肿瘤细胞沿着神经的转移过程以及转移路径。

相对于未使用示踪剂的坐骨神经浸润模型，本发明具有如下优点：

1、早期发现癌细胞沿坐骨神经转移；采用本发明的方法在第10天可观察到癌细胞沿神经转移现象，较以神经功能评估或观察成瘤方法观察PNI提前了10天。具体而言，坐骨神经功能障碍需待肿瘤形成，并明显浸润神经后才出现。大约在手术后20天可通过功能评估观察到神经功能障碍、MR扫描也可见到明显肿物。

2、无创、活体示踪癌细胞PNI；坐骨神经浸润模型可通过观察坐骨神经功能间接评估PNI，但此时肿瘤已经显著长大、浸润坐骨神经，而PNI的发生早期可能只涉及少量肿瘤细胞，在明显成瘤前已经开始；由于坐骨神经较为表浅，走形固定，较多研究者通过B超、MRI等影像检查手段评估肿瘤与神经的关系，即神经变粗、周围有组织增生等。但影像学改变是肿瘤沿神经转移间接证据，并不能直接说明是肿瘤细胞侵犯神经，最终仍需将动物处死后进行病理学检验证实。采用本发明的方法，使用示踪剂之后，利用MR成像，可实现无创、活体示踪癌细胞PNI。

3、动态示踪浸润过程；通过MR扫描可以发现示踪剂的信号，进而了解癌细胞何时局限于注射部位，何时向坐骨神经近端转移，何时出现肿物，何时肿物变大。这一点，未使用示踪剂的坐骨神经浸润模型无法做到。

根据本发明另一具体实施方式，示踪剂为氧化铁磁性纳米微粒(IONPs)。氧化铁磁性纳米颗粒(magnetic iron oxide nanoparticles，IONPs)有效成分为Fe3O4，可作为MRT2对比剂表现出负性增强效果。梯度回波T2*WI序列对局部磁场不均质十分敏感，对IONPs标记的细胞可产生明显低信号。且IONPs具有良好生物相容性及生物可降解性，用于构建体内纳米载药体系，可标记细胞达到体内MRI示踪目的。IONPs有良好的生物相容性及可降解性，Lee等用其作为纳米载体构建体可控释吉西他滨的载药体系，并利用其作为MR T2加权序列的阴性对比剂，通过MRI成像观察肿瘤组织药物浓度。Jendelova等以氧化铁纳米颗粒标记骨髓间充质干细胞及胚胎干细胞，将标记的干细胞移植于大鼠大脑皮层内，成功通过MR扫描示踪经标记的干细胞分布、分化，证明氧化铁纳米颗粒对干细胞无毒性作用，可作为MR长期示踪的标志物。如图5细胞存活率结果所示，IONPs在体外12mg/L-36mg/L的浓度范围内对PANC-1无明显毒性作用。

根据本发明另一具体实施方式，步骤B中，将肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的细胞悬液注射于裸鼠坐骨神经外膜下。

巨噬细胞是肿瘤微环境中重要炎症细胞，来源于血液中的单核细胞，受肿 瘤细胞分泌的巨噬细胞集落因子等趋化因子募集至肿瘤灶，并进一步转化为M2型巨噬细胞，即“肿瘤相关巨噬细胞”(tumor-associated macrophages,TAMs)。TAMs可刺激血管形成，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，阻止肿瘤细胞被自然杀伤细胞及T细胞攻击，在肿瘤形成及发展过程中起重要促进作用。

根据本发明另一具体实施方式，肿瘤细胞为胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、或者甲状腺癌细胞。

根据本发明另一具体实施方式，步骤C中，进行MR扫描的同时，进行病理检验。

根据本发明另一具体实施方式，步骤C中，各个时间点分别为：第0天、第3天、第7天、第10天、第17天、第20天、第24天。

根据本发明另一具体实施方式，步骤A具体包括如下步骤：

A1、将肿瘤细胞接种于大皿中，长满约90％时换液；

A2、加入含IONPs的DMEM溶液，转染后去除原来培养基；

A3、PBS轻轻冲洗未转染的附着于细胞表面的IONPs，常规消化后离心；

A4、PBS重悬。

根据本发明另一具体实施方式，步骤A具体包括如下步骤：

a1、将肿瘤细胞接种于大皿中，长满约90％时换液；

a2、加入含IONPs的DMEM溶液，转染后去除原来培养基；

a3、PBS轻轻冲洗未转染的附着于细胞表面的IONPs，常规消化后离心；

a4、PBS重悬；

a5、向步骤a4的重悬液中加入肿瘤相关巨噬细胞混合。

本发明具有如下有益效果：

从MR上可以观察到早期IONPs标记的PANC-1细胞沿坐骨神经转移，随着细胞分裂增殖，IONPs不能随之传代，当肿物形成时，可见低信号只局限于肿瘤中心。以IONPs标记肿瘤细胞，通过MR扫描动态观察的优势在于两者可以相互补充。早期通过IONPs对比剂的负性增强作用，MR扫描可以观察到少量细胞的转移，这是神经功能评估所不能反映的PNI早期阶段；到后期，随着细胞传代 增殖肿物形成，而IONPs并未能传代甚至可能在体内被部分降解时，此时MR扫描已经能够识别肿物。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

附图说明

图1显示实施例1中，术后四周TAMs+PANC-1组较PANC-1组左侧肢体重度瘫痪；

图2A为实施例1中，左侧肢体坐骨神经功能评估对比图；其显示PANC-1组左侧后肢肌力评分均正常，TAMs+PANC-1组左侧后肢肌力评分第三周已经出现受损，到第四周3/4达到完全瘫痪；

图2B为实施例1中，另一左侧肢体坐骨神经功能评估对比图；其显示PANC-1组左侧坐骨神经指数第一周为9.10±0.08mm，第四周为9.00±0.08mm，两者无明显差异；而TAMs+PANC-1组左侧坐骨神经指数第一周为9.03±0.41mm，第四周为2.83±1.05mm，较第一周坐骨神经功能明显变差，P＜0.0001；TAMs+PANC-1组第四周左侧坐骨神经功能PANC-1组亦明显受损，P＜0.0001；

图3显示实施例1中，TAMs显著促进PANC-1裸鼠体内神经浸润；从图中可见，TAMs+PANC-1组在局部形成肿物，并沿着神经向近端转移使神经明显增粗，而PANC-1组坐骨神经未见明显肿物，神经亦无增粗；

图4为实施例1中，HE染色及S-100免疫组化镜下表现；其中，TAMs+PANC-1组显著浸润神经，神经失去原有束状结构呈树梢状，周围浸润肿瘤细胞，而PANC-1组仅在局部可见少数肿瘤细胞向神经内浸润；

图5为实施例1中，IONPs细胞存活率试验结果比较；与对照组相比，不同浓度IONPs下PANC-1的存活率分别为95.65％±4.38％(12mg/L)、92.78％±17.22％(24mg/L)、104.0％±1.56％(36mg/L)、97.77％±7.91％(48mg/L)，各组间差异无统计学意义。

图6A显示实施例1中，不同浓度IONPs溶液；

图6B显示实施例1中，不同浓度IONPs溶液的MR T2图像；其中，对照组不含IONPs即DMEM的T2值为1570.7±781.1，不同浓度IONPs溶液的T2值分别为40.0±2.2(12mg/L)、24.2.±2.5(24mg/L)、18.1.±2.4(36mg/L)、14.0±3.0(48mg/L)，各组与对照组的差异有统计学意义(P＜0.01)，但各组之间差异无统计学意义；

图7显示实施例1中，MRI动态示踪TAMs促进PANC-1体内PNI；其中蓝色箭头为右侧，红色箭头为左侧；

A：各研究时间点裸鼠的双侧肢体功能大体，左侧TAMs+PANC-1组第20天时出现瘫痪。B-E为MR扫描图像；

B：右侧PANC-1组坐骨神经梯度回波T2*W矢状位图；

C：左侧TAMs+PANC-1组坐骨神经梯度回波T2*W矢状位图；

D：双侧坐骨神经梯度回波T2*W冠状位图；

E：双侧坐骨神经最小密度投影图像；

F：各研究时间点裸鼠的双侧坐骨神经外观；

图8为实施例1中，各实验时间点坐骨神经组织切片H&E染色结果，其中红色箭头所指为神经束，蓝色箭头所指为PANC-1细胞团；

左侧是TAMs+PANC-1组各时间点坐骨神经组织切片H&E染色结果(40X、200X)；

右侧是PANC-1组各时间点坐骨神经组织切片H&E染色结果(40X、200X)。

具体实施方式

实施例1

1.实验方法

1.1细胞培养

人胰腺癌细胞株PANC-1于含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基、人单核细胞株U937于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，恒温37℃，5％CO₂培养箱中培养。

1.2细胞因子诱导单核细胞U937为TAMs

人单核细胞株U937种于6孔板中(按5×105个/ml密度)，然后于培养体系中加入10ng/ml PMA，诱导24小时后见U937细胞由悬浮状态转为贴壁生长，吸去原来培养基及为贴壁的细胞，后加入2ml含10ng/ml IL-4的1640完全培养基，继续培养24小时，U937将被诱导生成M2型巨噬细胞，即TAMs。

1.3细胞存活率试验

为评估IONPs对PANC-1细胞的毒性影响，进行MTS实验。每组设3个复孔，该实验独立重复3次，所得数值表示为均数±标准误。

(1)PANC-1细胞1×104/孔接种在96孔板，无抗生素完全培养基中贴壁生长24小时。

(2)去除旧培养基，分别加入含IONPs 12mg/L、24mg/L、36mg/L、48mg/L的DMEM培养基100μl。对照组仅加DMEM培养基。空白为DMEM培养基。

(3)37℃，5％CO2培养箱中培养8小时后去除原有培养基，加入完全培养基继续培养48小时。

(4)去除原有培养基，每孔加入100μl(含有10μl MTS)DMEM培养基，37℃，5％CO2培养箱中避光培养3.5小时。

(5)以空白组调零，酶标仪检测波长为490nm吸光度值。

细胞存活率(％)＝(A实验组/A对照组)×100％。

1.4测定不同浓度IONPs溶液的T2值

配制含IONPs 12mg/L、24mg/L、36mg/L、48mg/L的DMEM培养基，4℃冰箱过夜，第二天观察溶液有无沉淀形成，将100μl DMEM、含IONPs 12mg/L、24mg/L、36mg/L、48mg/L的DMEM培养基依次加入96孔板中，行MR T2序列扫描，并测定T2值。

1.5建立裸鼠体内坐骨神经浸润模型

(1)准备动物：选取体重为15g±1g的雌性BALB/C(nu/nu)裸鼠养于SPF环境；

(2)准备细胞

①诱导单核细胞U937为TAMs

人单核细胞株U937种于6孔板中(按5×105个/ml密度)，然后于培养体系中加入10ng/ml PMA，诱导24小时后见U937细胞由悬浮状态转为贴壁生长，吸去原来培养基及为贴壁的细胞，后加入2ml含10ng/ml IL-4的1640完全培养基，继续培养24小时，U937将被诱导生成M2型巨噬细胞，即TAMs。

②IONPs转染PANC-1

PANC-1细胞接种于大皿中，长满约90％时换液，加入含IONPs 36mg/L的DMEM溶液，转染8h后去除原来培养基，PBS轻轻冲洗未转染的附着于细胞表面的IONPs，常规消化后离心，PBS重悬，行细胞计数，1/2PANC-1细胞离心后加PBS至1×10^5/μl，剩余1/2的PANC-1细胞按10：1比例与TAMs混合，离心后加PBS至1×10^5/μl。

(3)准备手术用品：麻醉药物(4％水合氯醛)，高温消毒的手术器械，经酒精消毒、双抗溶液浸泡的显微注射器、手术显微镜等。

(4)手术过程：用4％水合氯醛(按85μl/10g体重给药)腹腔注射将裸鼠麻醉后俯卧位固定四肢，安尔碘表面皮肤消毒。剪开皮肤，暴露右侧坐骨神经至股二头肌，在手术显微镜下，用10μl的hamilton微量注射器将3μl的PANC-1-IONPs细胞悬液于2min内缓慢注射于神经外膜下。同样方法暴露左侧坐骨神经，将3μl的TAMs+PANC-1-IONPs细胞悬液注射于神经外膜下。缝合皮肤、消毒。注意保温至裸鼠苏醒。

(5)评估坐骨神经功能：每周观察两组裸鼠体重、坐骨神经功能、局部肿瘤大小。按照文献方法测定双侧坐骨神经功能，①粗略行为：观察走路姿势，后肢有无运动无力；②后肢肌力评分：观察后肢脚趾对人工牵拉肢体的反应，分为4-1级，依次为正常、轻度受影响、重度受影响、完全瘫痪；③坐骨神经功能指数：计算裸鼠后肢第l趾和第5趾之间的自然伸展长度(单位mm)。

(6)MR扫描：分别于0d、3d、7d、10d、17d、20d、24d等研究时间点取 出一只裸鼠，进行MR扫描。用4％水合氯醛将裸鼠麻醉后固定于泡沫板上，双侧下肢尽量拉直后固定四肢。MR成像在德国西门子3.0T磁共振成像系统上完成，使用40mm表面线圈。进行平行于坐骨神经的快速自旋回波序列T2加权扫描(T2WI)(参数：重复时间(TR)2700ms，回波时间(TE)70ms，视野37mm×25mm，层厚1.0mm，翻转角150°，加速因子15，矩阵192×138，平均值32)。进行梯度回波T2*加权扫描(T2*WI)(参数：TR 13.4ms TE 5.2ms，视野为83mm×52mm，层厚0.24mm，翻转角30°，矩阵256×243，平均值8)。T2*W容积数据在SyngoViews工作站进行后期处理以获取多平面的重建图像，包括平行于双侧坐骨神经的矢状位、冠状位图像，以及最小密度投影图像。

(7)病理检验：扫描结束后将动物安乐死。以生理盐水行心脏灌注后分离暴露坐骨神经下至腘窝，上至脊柱旁，完整分离双侧坐骨神经，以4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，沿着神经纵轴制备6μm切片，分别进行H&E染色，病理学观察PNI情况。

1.6 H&E染色

(1)石蜡切片：新鲜肿瘤组织经4％多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，沿着神经纵轴6um厚连续切片，贴于载玻片上备用；

(2)烤片：脱蜡前将玻片放置于烤箱内60℃烤片30分钟-1小时；

(3)脱蜡：取出玻片，立即放入二甲苯内浸泡脱蜡3次，依次在二甲苯I内浸泡10分钟，二甲苯II内浸泡5分钟，二甲苯III内浸泡5分钟脱蜡；

(4)水化：玻片从二甲苯中取出后放入酒精中梯度水化，依次在无水乙醇I、无水乙醇II浸、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇中各浸泡3分钟；然后PBS洗涤3次，每次3分钟；

(5)10％苏木素染色1分钟，自来水冲洗2分钟；

(6)1％盐酸分化，自来水冲洗2分钟；

(7)伊红染色2分钟；

(8)常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.7镜下阅片标准

PNI诊断标准：肿瘤细胞与神经紧密接近并浸润神经鞘三层结构中任何一层中至少33％区域。

1.8统计方法

两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析。。应用SPSS17.0 for windows统计软件进行统计学分析。显著性差异水平为P＜0.05。

2.结果

2.1术后四周两组裸鼠双侧后肢的功能

手术后两组的双侧神经功能未见明显变化。观察至第四周TAMs+PANC-1有3/4的裸鼠完全瘫痪，到达实验终点。如图1所示，术后四周两组裸鼠左侧肢体功能差异明显，TAMs+PANC-1组完全瘫痪，而PANC-1组未见明显异常，两组的对照侧均正常。

2.2两组左侧肢体坐骨神经功能评估

每周评估后肢肌力、坐骨神经指数(第一趾与第五趾间距mm)。TAMs+PANC-1组左侧的坐骨神经功能第三周已经出现障碍，后肢肌力评分下降，坐骨神经指数变差，而PANC-1组无明显变化。PANC-1组左侧坐骨神经指数第一周为9.10±0.08mm，第四周为9.00±0.08mm，两者无明显差异；而TAMs+PANC-1组左侧坐骨神经指数第一周为9.03±0.41mm，第四周为2.83±1.05mm，较第一周坐骨神经功能明显受损，P＜0.0001；TAMs+PANC-1组第四周左侧坐骨神经功能PANC-1组亦明显受损，P＜0.0001(如图2A-图2B所示)。说明TAMs+PANC-1组坐骨神经功能较PANC-1组显著受损，差异有统计学意义。

2.3 TAMs显著促进PANC-1裸鼠体内神经浸润

如图3所示，TAMs+PANC-1组在局部形成肿物，并沿着神经向近端转移使神经明显增粗，而PANC-1组未见明显肿物，神经亦无增粗。

2.4 H&E染色及S-100免疫组化镜下表现

S-100是神经组织较为特异的蛋白，本课题结合HE染色及S-100免疫组化检验两组PNI。如图4所示，TAMs+PANC-1组显著浸润神经，神经失去原有束状结构呈树梢状，周围浸润肿瘤细胞，而PANC-1组仅在局部可见少数肿瘤细胞向神经内浸润。

2.5细胞存活率试验

IONPs对PANC-1细胞的毒性作用通过MTS试验观察。PANC-1细胞与不同浓度的IONPs共同孵育8小时(即完成转染)后，更换新的完全培养基继续培养48小时，细胞存活率如图5所示：与对照组相比，不同浓度IONPs下PANC-1的存活率分别为95.65％±4.38％(12mg/L)、92.78％±17.22％(24mg/L)、104.0％±1.56％(36mg/L)、97.77％±7.91％(48mg/L)，各组间差异无统计学意义。细胞毒性试验结果示在12mg/L-48mg/L的浓度范围内IONPs对细胞活力的影响不大。

2.6不同浓度IONPs溶液的MR T2图像

INOPs是氧化铁磁性纳米颗粒，可作为MR T2序列的阴性对比剂。含不同浓度IONPs溶液于4℃冰箱中放置过夜未见沉淀析出。如图6A-图6B所示，随着IONPs浓度增大，在T2序列的信号逐渐降低，T2值逐渐减小。对照组不含IONPs即DMEM的T2值为1570.7±781.1，不同浓度IONPs溶液的T2值分别为40.0±2.2(12mg/L)、24.2.±2.5(24mg/L)、18.1.±2.4(36mg/L)、14.0±3.0(48mg/L)，各组与对照组的差异有统计学意义(P＜0.01)，但各组之间差异无统计学意义。

2.7 MRI动态示踪TAMs促进PANC-1体内PNI

MR扫描采用的是对铁敏感的梯度回波T2*WI序列。如图7中B-E所示，在坐骨神经的行走区域中看到的黑色低信号为载IONPs的PANC-1细胞。图像7B、7C两列是矢状位，7D是冠状位，7E是图像经多平面重建后的最小密度投影图像。可以看到，0天、3天、7天这三个时间点低信号局限于注射部位，双侧并无明显差异。第10天开始，左侧TAMs+PANC-1组低信号向坐骨神经近端转移，较右侧PANC-1组明显。第20天以后，左侧TAMs+PANC-1组可见肿物，第24天的肿物则更明显，右侧未见肿物。

如图7中A所示，第0天、3天、7天双侧神经功能均正常，图7中F显示解剖后观察双侧坐骨神经未见肿物。第10天、17天的MRI提示左侧TAMs+PANC-1组低信号向坐骨神经近端转移较右侧PANC-1组明显，而此时双侧坐骨神经功能及外观均未见明显改变。第20天开始，左侧TAMs+PANC-1组肢体出现瘫痪，坐骨神经可见肿物形成，第24天更明显，与MR图像显示一致；而右侧PANC-1组未见肿物形成。

2.8各实验时间点坐骨神经组织切片H&E染色结果

如图8所示，第0天、3天、7天肿瘤细胞(图中蓝色箭头所指)局限于神经外膜下，与神经束(图中红色箭头所指)分离，未见PNI发生，双侧无明显差异。10天、17天时左侧TAMs+PANC-1组细胞向神经束浸润，右侧PANC-1组细胞仍局限于外膜下。20天、24天左侧细胞显著生长形成肿物，肿瘤细胞明显浸润神经，右侧细胞于局部稍有浸润。各时间点的H&E结果与对应的MR图像结果一致。

3.结论

在12mg/L–48mg/L浓度范围内，IONPs对PANC-1细胞无明显毒性，可作为MR T2的负性对比剂。坐骨神经功能评估、单纯MRI扫描以及IONPs标记细胞+MRI扫描三种方法均可观察到TAMs+PANC-1组发生PNI，但三种方法的时限有所不同。坐骨神经功能障碍需待肿瘤形成，并明显浸润神经后才出现。大约在手术后20天可通过功能评估观察到神经功能障碍、MR扫描也可见到明显肿物。而IONPs标记细胞+MRI扫描的方法在第10天时即可观察到神经浸润 现象，并与病理结果一致，这较传统观察PNI方法即通过神经功能评估或观察成瘤提前了10天。

应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

说明书中中英文缩写对照：

英文缩写 英文全称 中文全称

BSA bovine serum albumin 小牛血清蛋白

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium 一种细胞培养基

DMSO dimethyl sulphoxide 二甲基亚砜

DRG dorsal root ganglia 背根神经节

IL-4 Interleukin-4 白介素4

PBS phosphate buffer solution 磷酸盐缓冲液

PMA phorbol myristic acetate 十四酰佛波乙酸酯

PNI perineural invasion 外周神经浸润

TAMs tumor associated macrophage 肿瘤相关巨噬细胞

IONPs Iron Oxide Nanoparticles 氧化铁磁性纳米颗粒

MRI Magnetic Resonance Imaging 核磁共振成像。

Claims (8)

1.一种活体动态示踪肿瘤细胞浸润坐骨神经的方法，其包括如下步骤：

A、在裸鼠体外以示踪剂转染肿瘤细胞；

B、将已经转染示踪剂的肿瘤细胞注射于裸鼠的坐骨神经外膜下；

C、每个时间点对坐骨神经进行MR扫描。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述示踪剂为氧化铁磁性纳米微粒(IONPs)。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤B中，将肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的细胞悬液注射于裸鼠坐骨神经外膜下。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤细胞为胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、或者甲状腺癌细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤C中，进行MR扫描的同时，进行病理检验。

6.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤C中，各个所述时间点分别为：第0天、第3天、第7天、第10天、第17天、第20天、第24天。

7.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤A具体包括如下步骤：

A1、将肿瘤细胞接种于大皿中，长满约90％时换液；

A2、加入含IONPs的DMEM溶液，转染后去除原来培养基；

A3、PBS轻轻冲洗未转染的附着于细胞表面的IONPs，常规消化后离心；

A4、PBS重悬。

8.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤A具体包括如下步骤：

a1、将肿瘤细胞接种于大皿中，长满约90％时换液；

a2、加入含IONPs的DMEM溶液，转染后去除原来培养基；

a3、PBS轻轻冲洗未转染的附着于细胞表面的IONPs，常规消化后离心；

a4、PBS重悬；

a5、向步骤a4的重悬液中加入肿瘤相关巨噬细胞混合。