CN101982420A - 磁性纳米颗粒溶液、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分散在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中的磁性纳米颗粒溶液。制备磁性纳米颗粒溶液的方法，包括下列步骤：利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；其特征在于所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。本发明也公开了利用该磁性纳米颗粒溶液制备磁性生物传感器的方法及在制备磁性生物传感器的应用。本发明磁性纳米颗粒溶液制备的磁性生物传感器，保持该生物传感器活性达到99.95％-99.97％，可保留原生物传感器对特定底物的定量响应强度和检测灵敏度，同时可以通过磁体回收将生物传感器从水体或土壤样品中分离，为生物传感器在环境检测与医药领域的应用提供了技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种磁性纳米颗粒溶液，以及该磁性纳米颗粒溶液的制备方法，磁性生物传感器的构建方法，及该磁性纳米颗粒溶液的用途。
背景技术
社会各行业在生产、运输、使用和处置过程中，往往伴随着大量具有环境风险的污染物残留、泄露和排放。近年来，随着我国工业、农业和市政建设的快速发展，由上述污染物所导致的环境污染事故层出不穷，受污染场地的数目与面积逐年扩大，对人民生活健康造成了重大威胁。在这些污染物中，以农药和石油化工产品为代表的复杂持久性有机污染物具有痕量、广泛存在和种类繁多等特点，给环境监测与风险评价提出了巨大的挑战。现有的传统化学分析方法面对复杂持久性有机污染物，具有操作繁琐(复杂的预处理过程)、耗时较长(几小时至几天时间)、设备昂贵和成本较高等缺点，并且无法有效评价复合污染条件下的生物毒性与环境生态风险。这些问题严重制约了相关污染场地的环境评估和风险评价，限制了突发性环境应急事故的快速评估，为新型检测技术，特别是以生物传感器(biosensor)为代表的生物快速检测技术的发展提供了良好的契机。
据相关行业报告表明，英国环境监测市场目前已达到5.9亿英镑(60亿人民币)的规模(Environmental KTN report，2008)。其中，快速检测技术所涵盖的市场份额达到2亿英镑(20亿人民币)。而从全球范围来看，最新的全球市场分析报告(GlobalIndustry Analysts，Inc.)预测生物传感器市场价值在2012年之前可以达到61亿美元(400亿人民币)。现有中国经济的高速发展已经付出了高昂的环境代价，这主要体现在污染场地带来的生态修复与人体健康问题、工业搬迁场地引发的二次开发问题和突发性环境事故导致的预警应急问题等。这些问题都伴随着对环境监测与风险评价的更高要求，表明中国政府对新型环境检测技术具有迫切的需求，预示着生物快速检测技术在中国具有广阔的市场。
生物细胞传感器以活体微生物细胞作为宿主，可以真实的评价环境中目标物质的生物效应(生物可利用性)，检测方法简单易行，可直接应用于水样，具有稳定性和可靠性，与传统分析方法相比具有高度的准确性。而其低成本和快速响应的特点，可以满足此领域市场的需要，兼备操作简单和可实现定量测定等优点。但与此同时，生物细胞传感器由于受到自身特点的限制，具有难回收和难操控等问题。首先，由于活体生物细胞传感器本身具备生物活性，可以在自然环境中增殖与运动，因此一旦投入被检测或应用环境中，难以同土著微生物进行区别，更难以回收，其自身携带的目标基因、调控基因或报道基因存在巨大的环境风险。其次，对于土壤等复杂环境样品的分析，往往需要在检测过程中将样品与生物传感器分离，以避免复杂介质对检测信号的影响。
磁性纳米颗粒是一种有效的远距离操纵工具，通过将磁性纳米颗粒与有机或无机材料结合，可以实现通过磁场对相应材料的运动进行远距离控制，已在微晶体和碳纳米管研究领域受到了广泛关注。在微生物学领域，已有研究成功将磁性纳米颗粒固定在活体酵母细胞，但应用于活体细菌细胞的研究尚未见报道，其面临的技术问题主要包括如何在固定化过程中保持细胞活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以与生物传感器结合，同时保持该生物传感器活性，并使生物传感器具有磁性，便于检测回收的磁性纳米颗粒溶液，其制备方法及应用。
为了达到上述目的，本发明提供了一种磁性纳米颗粒溶液，该磁性纳米颗粒分散在溶剂中，其特征在于所述的溶剂是聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。
本发明的磁性纳米颗粒溶液，其特征在于所述的磁性纳米颗粒是直径为15-21nm的氧化铁。
本发明还提供了一种制备磁性纳米颗粒溶液的方法，该方法包括下列步骤：
a.利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；
b.利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；
其特征在于：所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。
本发明的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其进一步特征在于：所述的磁性纳米颗粒是直径为15-21nm的氧化铁。
本发明的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其进一步特征在于：步骤b所述的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤a所制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
本发明的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其进一步特征在于：步骤b所述的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤a所制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在20KHz至120KHz超声条件下震荡5-20分钟，2000rpm至6000rpm下离心5-20分钟，弃去上清液，加入等体积纯水，在20KHz至120KHz超声条件下震荡5-20分钟，2000rpm至6000rpm下离心5-20分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
本发明还提供了一种磁性生物传感器的构建方法，该方法包括下列步骤：
a.接种生物传感器的单菌落于液体培养基中，获得细胞悬浮液；
b.利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；
c.利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，获得磁性纳米颗粒溶液；
d.将步骤a制得的细胞悬浮液与步骤c制得的磁性纳米颗粒溶液共培养，磁体回收已经结合磁性纳米颗粒的生物传感器，制得磁性生物传感器；
其特征在于：步骤c中所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。
本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于：所述的磁性纳米颗粒是直径为15-21nm的氧化铁。
本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于：步骤c所述的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤b中所制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于：步骤c所述的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤b中所制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在20KHz至120KHz超声条件下震荡5-20分钟，2000rpm至6000rpm下离心5-20分钟，弃去上清液，加入等体积纯水，在20KHz至120KHz超声条件下震荡5-20分钟，2000rpm至6000rpm下离心5-20分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于：所述的的生物传感器选自：不动杆菌(Acinetobacter sp,)ADPWH_lux、不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol和不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_alk。
进一步，本发明还提供了磁性纳米颗粒溶液用于制备磁性生物传感器的应用。本发明的磁性生物传感器检测水体或土壤样品中污染物的应用，是将所述的磁性生物传感器与水体或土壤样品混合，培养所述磁性生物传感器，通过检测报道基因表达产物的发光强度来直接定量检测土壤样品污染物含量。其中使用多功能酶标仪作为检测仪器，使用磁体回收磁性生物传感器，所述培养温度为30℃。
本发明的磁性纳米颗粒溶液与生物传感器结合，制备磁性生物传感器，可以同时保持该生物传感器活性达到99.95％-99.97％，可保留原生物传感器对特定底物的定量响应强度和检测灵敏度，同时可以通过磁体回收的方法将磁性生物传感器从水体或土壤样品中分离，有效增强了生物传感器的使用范围，为生物传感器在环境检测与医药领域的应用提供了技术支持。
为了更好地理解本发明，现在结合附图及具体实施例对本发明进行详细地说明。
在此需要说明的是本发明所用的生物材料、试剂、仪器如无特别说明均属于本领域常规的生物材料、试剂、仪器，均可以通过商业途径购得。本发明中所使用的培养基及方法如无特别说明，均为本领域常规的培养基及方法。
附图说明
图1是本发明制得的磁性纳米颗粒溶液的透射电子显微镜(TEM)照片。
图2是悬浮状态(左图)与磁体吸附状态(右图)的本发明制得的磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux。
图3是本发明制得的磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp)ADPWH_lux薄片法的透射电子显微镜(TEM)照片。
图4是图3部分区域的放大图像。
图5是本发明制得的磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux的表面电子能谱(EDX)。
图6是在琼脂糖板上菌落计数磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux数量的图示。
图7是磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux细胞的生长和分裂的图示。
图8是磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux对水中不同浓度水杨酸的响应。
图9A和9B是磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_alk对海水中不同浓度石油的响应。
图10是磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol对水中不同浓度甲苯的响应。
图11是磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux对土壤不同水杨酸含量的响应。
具体实施方式
实施1：磁性纳米颗粒溶液的制备
将2.0mL浓度为1.0M的FeCl3溶液加入到试管中，缓慢加入0.5mL浓度为2.0M的FeCl2溶液，搅拌均匀。逐滴缓慢加入25mL浓度为1.0M的氯化铵溶液，同时1000rpm转速快速搅拌，直至出现黑色沉淀。使用磁体回收该沉淀，弃去上清液，加入等体积纯水。反复重复磁体回收过程，直至上清液pH值为7.0，获得含有磁性纳米颗粒水溶液。
取100mg聚烯丙基胺盐酸盐(Poly(allylamine)Hydrochloride，PAH )，加入至10.0mL纯水中，配置浓度为10.0g/L的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液。取10mL该聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入1.0mL上述步骤中制备得到的磁性纳米颗粒水溶液，40KHz超声波条件下振荡10分钟，3000rpm条件下离心10分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
实施2：磁性纳米颗粒溶液的制备
将2.0mL浓度为1.0M的FeCl3溶液加入到试管中，缓慢加入0.5mL浓度为2.0M的FeCl2溶液，搅拌均匀。逐滴缓慢加入25mL浓度为1.0M的氯化铵溶液，同时1000rpm转速快速搅拌，直至出现黑色沉淀。使用磁体回收该沉淀，弃去上清液，加入等体积纯水。反复重复磁体回收过程，直至上清液pH值为7.0，获得含有磁性纳米颗粒的水溶液。
取100mg聚烯丙基胺盐酸盐(Poly(allylamine)Hydrochloride，PAH)，加入至10.0mL纯水中，配置浓度为10.0g/L的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液。取10mL该聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入1.0mL上述步骤中制备得到的磁性纳米颗粒水溶液，20KHz超声波条件下振荡5分钟，2000rpm条件下离心5分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
实施3：磁性纳米颗粒溶液的制备
将2.0mL浓度为1.0M的FeCl3溶液加入到试管中，缓慢加入0.5mL浓度为2.0M的FeCl2溶液，搅拌均匀。逐滴缓慢加入25mL浓度为1.0M的氯化铵溶液，同时1000rpm转速快速搅拌，直至出现黑色沉淀。使用磁体回收该沉淀，弃去上清液，加入等体积纯水。反复重复磁体回收过程，直至上清液pH值为7.0，获得含有磁性纳米颗粒的水溶液。
取100mg聚烯丙基胺盐酸盐(Poly(allylamine)Hydrochloride，PAH)，加入至10.0mL纯水中，配置浓度为10.0g/L的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液。取10mL该聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入1.0mL上述步骤中制备得到的磁性纳米颗粒水溶液，120KHz超声波条件下振荡20分钟，6000rpm条件下离心20分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
参考图1，实施例1-3中所制得的磁性纳米颗粒溶液的透射电子显微镜(TEM)照片显示该磁性纳米颗粒几乎都是球形形状并且氧化铁颗粒的大小分布是15-21nm之间，包括端值。
实施4：磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux的制备
1)细胞培养
生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux(购自惟馨雨生物技术有限公司或根据现有技术公开的文献Huang W.E.et al.Chromosomally located genefusions constructed in Acinetobacter sp.ADP1 for the environmental detection of salicylate.Environ.Microbiol.7，1339-1348，2005所述方法构建)单菌落接种至LB液体培养基(LB)，30℃培养过夜后，取10mL菌液(CFU＝5×108cells/mL)，3000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均匀，再次3000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入1mL纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为5×109cells/mL。
2)磁性纳米颗粒溶液制备
如实施例1所述。
另取10mL聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入1.0mL纯水，40KHz超声波条件下振荡10分钟，3000rpm条件下离心10分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。
3)磁性生物传感器构建
取500μL步骤1)中制备的细胞悬浮液，加入4.5mL步骤2)中制备的磁性纳米颗粒溶液。30℃条件下震荡培养30分钟。使用磁体置于试管侧壁10分钟，回收已结合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于等体积液体矿质培养基(1升液体矿物质培养基含有2.5g Na2HPO4、2.5g KH2PO4、1.0gNH4Cl、0.1gMgSO4·7H2O、10μL饱和CaCl2溶液、10μL饱和FeSO4溶液和1mL Bauchop & Elsden溶液)中，获得磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux。
另取500μL步骤1)中获得的生物传感器细胞悬浮液，加入4.5mL步骤2)中制备的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。30℃条件下震荡培养30分钟。使用3000rpm离心10分钟，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述离心回收步骤重复三次，最后将所获得沉淀溶解于等体积液体矿质培养基中，获得无磁性纳米颗粒的生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux阴性对照。
实施5：磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_alk的制备
1)细胞培养
生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_alk(购自惟馨雨生物技术有限公司)单菌落接种至含有10mg/L卡那霉素的LB液体培养基(LBK)，30℃培养过夜后，取10mL菌液(CFU＝5×108cells/mL)，3000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均匀，再次3000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入1mL纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为5×109cells/mL。
2)磁性纳米颗粒溶液制备
如实施例2所述。
3)磁性生物传感器构建
取500μL步骤1)中获得的生物传感器细胞悬浮液，加入4.5mL步骤2)制备的磁性纳米颗粒溶液。30℃条件下震荡培养30分钟。使用磁体置于试管侧壁10分钟，回收已结合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于等体积液体矿质培养基(1升液体矿物质培养基含有2.5g Na2HPO4、2.5gKH2PO4、1.0gNH4Cl、0.1gMgSO4·7H2O、10μL饱和CaCl2溶液、10μL饱和FeSO4溶液和1mL Bauchop & Elsden溶液)中，获得磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH alk。
另取500μL步骤1)中获得的生物传感器细胞悬浮液，加入4.5mL实施例4步骤2)中制备的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。30℃条件下震荡培养30分钟。使用3000rpm离心10分钟，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述离心回收步骤重复三次，最后将所获得沉淀溶解于等体积液体矿质培养基(1升液体矿物质培养基含有2.5g Na2HPO4、2.5g KH2PO4、1.0g NH4Cl、0.1g MgSO4·7H2O、10μL饱和CaCl2溶液、10μL饱和FeSO4溶液和1mLBauchop&Elsden溶液)中，获得无磁性纳米颗粒的生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_alk阴性对照。
实施例6：磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol的制备
1)细胞培养
磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol(购自惟馨雨生物技术有限公司或根据现有技术公开的文献Huang W.E.et al.Characterizing the regulationof the Pu promoter in Acinetobacter baylyi ADP1.Environ.Microbiol.10，1668-1680，2008所述方法构建)单菌落接种至含有10mg/L卡那霉素的LB液体培养基(LBK)，30℃培养过夜后，取10mL菌液(CFU＝5×108cells/mL)，3000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均匀，再次3000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入1mL纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为5×109cells/mL。
2)磁性纳米颗粒溶液制备
如实施例3所述。
3)磁性生物传感器构建
取500μL步骤1)中获得的生物传感器悬浮液，加入4.5mL步骤2)中制备的磁性纳米颗粒溶液。30℃条件下震荡培养30分钟。使用磁体置于试管侧壁10分钟，回收已结合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于等体积液体矿质培养基中，获得磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol。
另取500μL步骤1)中获得的生物传感器悬浮液，加入4.5mL实施例4步骤2)中制备的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。30℃条件下震荡培养30分钟。使用3000rpm离心10分钟，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述离心回收步骤重复三次，最后将所获得沉淀溶解于等体积液体矿质培养基(1升液体矿物质培养基含有2.5g Na2HPO4、2.5g KH2PO4、1.0g NH4Cl、0.1g MgSO4·7H2O、10μL饱和CaCl2溶液、10μL饱和FeSO4溶液和1mLBauchop&Elsden溶液)中，获得无磁性纳米颗粒的生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol阴性对照。
实施例7：磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux的特性
对实施例4的磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux做如下实验，实验过程及结果如下：
磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux悬浮状态(图2左图)与普通细胞悬浊液无显著差异，在磁体吸附状态(图2右图)下，磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux可被有效富集和回收。证明了磁性纳米颗粒溶液使得生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux具有了磁性。
如图3所示，薄片法的磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp)ADPWH_lux的透射电子显微镜照片显示：磁性纳米颗粒粘附于细胞表面。如图4所示，图3中部分放大的图像显示：磁性纳米颗粒都粘附于细胞外壁上，在胞质中没有发现磁性纳米颗粒。此外，如图5所示，磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux的表面电子能谱(EDX)证实了细胞壁上氧化铁纳米颗粒的存在。
然后用磁性和非磁性的生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux的平板计数来估测该磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux的效率。
计数结果是磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux的数量是2.22±0.10×108CUF/ml，非磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux细胞数量是8.00±0.51×104CUF/ml(图6)，表明磁性化生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux的效率是99.96±0.01％。因为，通过在琼脂糖板上菌落计数来计数磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux的数量，因此，该实验也表明磁性化的细菌细胞还是活的，因此该磁性生物传感器是生物相容性的。在PAH中分散的磁性纳米颗粒不能进入胞质解释了高水平存活率的原因。并且我们也检查了磁性化细胞的生长和分裂，图7表明在30℃温育120分钟期间，非磁性化的细胞数量从0增加到12％，这证明了磁性化的细胞能够正常分裂和生长。
对实施例5和6中制得的磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_alk和不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol做了相同的实验，实验过程及结果相同。
实施例8：磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux对水中水杨酸含量的检测
1)样品准备
称取160.1mg水杨酸钠，加入到100mL纯水中，得到浓度为10mM的水杨酸钠储备溶液。分别上述获得的水杨酸钠溶液按比例用纯水稀释，配置浓度为50nM、100nM、1μM、10μM和100μM的水杨酸钠溶液。
称取27.02g六水合丁二酸钠，加入到100mL纯水中，使用0.22μm滤膜(Millipore)过滤，得到无菌丁二酸钠储备溶液，该溶液丁二酸钠浓度为1M。
2)样品测试
取176μL实施例4中获得的磁性生物传感器和无磁性阴性对照的生物传感器，加入黑色底透的96孔酶标板(美国Corning Costar公司)孔内。每孔内分别加入4μL丁二酸那储备溶液和20μL上述系列水杨酸钠溶液，使用纯水作为阴性对照(control)，每组测试包括三个平行样。
使用多功能酶标仪(型号Synergy 2，美国BioTek公司)对96孔酶标板内生物发光强度进行测量。培养温度为30℃，每10分钟进行一次测量，每次测量前振荡1分钟以保证细胞混合均匀。
3)数据处理
计算步骤2)中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数。取每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数峰值及其前后各2个时间点生物发光相对倍数，计算平均值，获得该生物传感器生物发光响应倍数。
磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux对水中不同浓度水杨酸的响应如图8所示。测试结果表明，磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobactersp.)ADPWH_lux与原生物传感器均对水杨酸有显著响应，生物发光响应倍数随水杨酸浓度增加而增强。两种生物传感器对相同浓度水杨酸溶液的响应无显著差异，表明磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux可以有效识别并对水溶液中水杨酸产生定量响应。
实施例8：磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADP_alk对海水中石油含量的检测。
1)样品准备
分别12.5μL英国北海布伦特原油和伊朗锡里岛原油，溶解于100mL海水中，使用40K-Hz超声波振荡30秒，摇匀，该乳浊液含有石油浓度为100mg/L。将该乳浊液按不同比例使用海水稀释，配制浓度为0.1、0.2、1、2、10、20、100mg/L的系列石油海水溶液。
称取27.02g六水合丁二酸钠，加入到100mL纯水中，使用0.22μm滤膜(Millipore)过滤，得到无菌丁二酸钠储备溶液，该溶液丁二酸钠浓度为1M。
2)样品测试
取20μL实施例5中制得的磁性生物传感器和无磁性阴性对照生物传感器的悬浮液，加入黑色底透的96孔酶标板(美国Corning Costar公司)孔内。每孔内分别加入4μL丁二酸那储备溶液和176μL上述系列石油水溶液，使用纯水作为阴性对照(control)，每组测试包括三个平行样。
使用多功能酶标仪(型号Synergy 2，美国BioTek公司)对96孔酶标板内生物发光强度进行测量。培养温度为30℃，每10分钟进行一次测量，每次测量前振荡1分钟以保证细胞混合均匀。
3)数据处理
计算步骤2)中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数。取每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数峰值及其前后各2个时间点生物发光相对倍数，计算平均值，获得该生物传感器生物发光响应倍数。
磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_alk对海水中不同浓度石油的响应如图9A、9B所示。测试结果表明，磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_alk与原生物传感器均对海水中不同浓度的原油有显著响应，生物发光响应倍数随原油浓度增加而增强。相同石油浓度条件下，磁性生物传感器生物发光响应倍数显著低于原生物传感器，这可能是由于磁性生物传感器表面聚丙烯基胺高分子膜对非极性分子传质的阳碍作用，但两种生物传感器对原油的检测限相同，表明磁性生物传感器Acinetobacter sp.ADPWH_alk可以有效识别并对海水中原油产生定量响应。
实施例9：磁性生物传感器(Acinetobacter sp)ADPWH_Tol对水中甲苯含量的检测
1)样品准备
取甲苯20μL加入到100mL纯水中，40K-Hz超声波30秒，得到甲苯饱和储备溶液，浓度为600μM。将该乳浊液按不同比例使用纯水稀释，配制浓度为6、60和600μM的系列甲苯溶液。
称取27.02g六水合丁二酸钠，加入到100mL纯水中，使用0.22μm滤膜(Millipore)过滤，得到无菌丁二酸钠储备溶液，该溶液丁二酸钠浓度为1M。
2)样品测试
取20μL实施例6中获得的磁性生物传感器和无磁性阴性对照生物传感器悬浮液，加入黑色底透的96孔酶标板(美国Corning Costar公司)孔内。每孔内分别加入4μL丁二酸那储备溶液和176μL上述系列甲苯水溶液，使用纯水作为阴性对照(control)，每组测试包括三个平行样。
使用多功能酶标仪(型号Synergy 2，美国BioTek公司)对96孔酶标板内生物发光强度进行测量。培养温度为30℃，每10分钟进行一次测量，每次测量前振荡1分钟以保证细胞混合均匀。
3)数据处理
计算步骤2)中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数。取每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数峰值及其前后各2个时间点生物发光相对倍数，计算平均值，获得该生物传感器生物发光响应倍数。
磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol对水中不同浓度甲苯的响应如图10所示。测试结果表明，磁性生物传感器Acinetobacter sp.ADPWH_Tol与原生物传感器均对甲苯有显著响应，生物发光响应倍数随甲苯浓度增加而增强。两种生物传感器对相同浓度甲苯溶液的响应无显著差异，表明磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux可以有效识别并对水溶液中甲苯产生定量相应。
实施例10：磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux对土壤水杨酸含量的检测
1)细胞培养
不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux单菌落接种至LB液体培养基(LB)，30℃培养过夜后，取10mL菌液(CFU＝5×108cells/mL)，3000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均匀，再次3000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入1mL纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为5×109cells/mL。
2)磁性生物传感器构建
取500μL步骤1)中获得的细胞悬浮液，加入4.5mL实施例1中制备的磁性纳米颗粒溶液。30℃条件下震荡培养30分钟。使用磁体置于试管侧壁10分钟，回收已结合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均匀。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于1/10体积纯水中，获得磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux。
3)样品准备
称取160.1mg水杨酸钠，加入到100mL纯水中，得到浓度为10mM的水杨酸钠储备溶液。分别上述获得的水杨酸钠溶液按比例用纯水稀释，配置浓度为0、0.1、1、10和100μM的水杨酸钠溶液。分别取上述水杨酸钠溶液2.0mL加入到2.0g干净土壤中，室温条件下震动搅拌24小时以保证水杨酸与土壤混合均匀，该土壤水杨酸含量分别为0.0、0.14、1.4、14和140mg/g。上述土壤分别加入8mL纯水，40K-Hz超声波300秒后，加入1mL步骤2)中获得的磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux和1mL液体LB培养基。该土壤/生物传感器混合液30℃条件下培养20分钟，静置2分钟后取2mL上清液。使用磁体置于含上述上清液的试管侧壁10分钟，回收磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux，小心移去上清液和土壤颗粒沉淀，加入1.8mL纯水和200μL新鲜液体LB培养基，振荡摇匀。
4)样品测试
取200μL步骤2)中获得的磁性生物传感器Acinetobacter sp.ADPWH_lux悬浮液，加入黑色底透的96孔酶标板(美国Corning Costar公司)孔内，每组测试包括三个平行样。
使用多功能酶标仪(型号Synergy 2，美国BioTek公司)对96孔酶标板内生物发光强度进行测量。培养温度为30℃，每10分钟进行一次测量，每次测量前振荡1分钟以保证细胞混合均匀。
5)数据处理
计算步骤4)中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光响应倍数。
磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux对土壤不同水杨酸含量的响应如图11所示。测试结果表明，经磁体回收的磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux对土壤中水杨酸有显著响应，生物发光响应倍数随水杨酸含量增加而增强。磁性生物传感器不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux对土壤不同水杨酸含量的响应峰值出现在120分钟左右，但与土壤混合培养后已对水杨酸产生响应，表现为多功能酶标仪0分钟时刻不同水杨酸含量土壤对应生物发光响应倍数不同。
Claims (12)
1.一种磁性纳米颗粒溶液，该磁性纳米颗粒分散在溶剂中，其特征在于：所述的溶剂是聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米颗粒溶液，其特征在于：所述的磁性纳米颗粒是直径为15-21nm的氧化铁。
3.一种制备磁性纳米颗粒溶液的方法，该方法包括下列步骤：
a.利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；
b.利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；
其特征在于：所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。
4.根据权利要求3所述的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其特征在于：所述的磁性纳米颗粒是直径为15-21nm的氧化铁。
5.根据权利要求4所述的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其特征在于：步骤b的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤a中制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
6.根据权利要求5所述的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其特征在于：步骤b的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤a中制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在20KHz至120KHz超声条件下震荡5-20分钟，2000rpm至6000rpm下离心5-20分钟，弃去上清液，加入等体积纯水，在20KHz至120KHz超声条件下震荡5-20分钟，2000rpm至6000rpm下离心5-20分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
7.一种磁性生物传感器的构建方法，该方法包括下列步骤：
a.接种生物传感器的单菌落于液体培养基中，获得细胞悬浮液。
b.利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；
c.利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；
d.将步骤a制得的细胞悬浮液与步骤c制得的磁性纳米颗粒溶液共培养，磁体回收已经结合磁性纳米颗粒的生物传感器，得到磁性生物传感器；
其特征在于：步骤c中所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。
8.根据权利要求7所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于：所述的磁性纳米颗粒是直径为15-21nm的氧化铁。
9.根据权利要求8所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤c的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤b中制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
10.根据权利要求9所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤c的超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤b中制得的磁性纳米颗粒中加纯水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在20KHz至120KHz超声条件下震荡5-20分钟，2000rpm至6000rpm下离心5-20分钟，弃去上清液，加入等体积纯水，在20KHz至120KHz超声条件下震荡5-20分钟，2000rpm至6000rpm下离心5-20分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。
11.根据权利要求7至10中任一权利要求所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于：所述的生物传感器选自：不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_lux、不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_Tol和不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPWH_alk。
12.权利要求1或2所述的磁性纳米颗粒溶液用于制备磁性生物传感器的应用。
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