CN106109492A - 营养组合物及在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物中的应用 - Google Patents

营养组合物及在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种营养组合物及在制备及在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物中的应用的应用，是由赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、乳清酸、核苷酸、维生素A、维生素D、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸、叶酸、维生素C、铁、锌、锰、铜、硒、铬、钾、钙、镁、肌醇及大豆磷脂按比例配制而成，具有促进造血干细胞增殖等作用且可对切除修复基因损伤、错配修复基因损伤、同源重组修复基因损伤及错误倾向修复基因损伤等均有恢复作用，可满足基因治疗的需要。

Description

营养组合物及在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物 中的应用
技术领域
本发明涉及一种营养组合物及用途，尤其是可使肝细胞、脾脏B细胞、肾小管上皮细胞及脑海马部神经元细胞线粒体增殖的营养组合物及在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物中的应用。
背景技术
人体的细胞内有两个基因组，一个是核基因组，另一个是线粒体基因组。已知线粒体控制189条生化代谢，主导和维持生长发育和衰老的主要代谢基础。线粒体疾病是以线粒体结构和功能缺陷为主要原因的疾病，目前发现与线粒体基因（mtDNA）突变有关的人类疾病多达百余种。mtDNA发生突变后，可导致细胞能量少、细胞活力下降，最终导致器官乃至整体功能下降，出现疾病或衰老征象。如在恶性肿瘤细胞中的线粒体明显减少、氧化代谢趋向降低，而无氧酵解趋向增强。目前对于线粒体疾病的治疗方法有如下几种：
①补充疗法：给病人添加呼吸链所需的辅酶，如辅酶Q等；
②选择疗法：选择ATP合成酶的抑制剂——氯霉素，连续低剂量使用此药以促进对缺陷线粒体的排斥；
③基因疗法：将线粒体基因转入患者体内，以替代缺陷mtDNA发挥作用。
由于在遗传学方面已有如下权威结论：“不论是器质性疾病还是功能性疾病，都有必要在基因水平上去探究其病因”，“人类正常的衰老和死亡也受到基因的调控”，“不论是防治疾病还是延缓衰老，都可以从基因这个层次上来研究解决问题”为此，基因治疗已经成为现代科学研究的热点。
基因治疗是纠正与疾病相关的缺陷基因的一种技术，现有方法大多都是以正常基因替换异常的致病基因。如将载有治疗基因的病毒载体感染靶细胞；脂质体携带治疗基因穿过靶细胞膜进入细胞；通过化学方法将治疗基因与特异细胞受体结合，开展靶向治疗。此外，也有少数用RNA干扰的方法。虽然1990年开始进行第一例基因治疗已获得成功，但仍面临如下问题有待解决：①外源基因在受体表达不稳定、时间短，限制了基因治疗的疗效；②外源基因移植引起免疫系统对已识别过的外来物产生免疫增强，使病人的治疗难以重复；③病毒载体对病人可能有各种潜在的危险；④许多疾病是由多基因缺陷引起的，无法用单基因纠正解决问题。
专利号为200710012788.8的中国发明专利公开了一种“促进造血干细胞增殖与血红蛋白合成的营养组合物”。该营养组合物的原料及重量比如下：核苷酸90~110、精氨酸20~30、赖氨酸20~30、半胱氨酸10~20、甘氨酸25~35、组氨酸20~30、卵磷脂110~130、脑磷脂50~70、维生素E 0.4~0.6、维生素C 5~7、叶酸0.02~0.04、维生素B2 0.05~0.07、维生素B6 0.07~0.08、维生素B12 0.0001~0.0002、铁0.5~1.5、锌0.5~0.7、锰0.4~0.6、枸杞多糖14~16、葡萄籽提取物14~16。可明显提高血中血红蛋白（Hb）、红细胞（RBC）、白细胞（WBC）及血小板（Plt）数量；可刺激骨髓造血干细胞的增殖，使造血干细胞明显增多；明显提高细胞内线粒体数目；对肝、脾的损伤具有明显的恢复作用。该营养组合物适用于营养不良性贫血（缺铁性贫血及叶酸与维生素B12营养不良性贫血）、红细胞生成减少所致贫血以及红细胞破坏过多或丢失所致贫血。专利号为201010129027.2的中国发明专利公开了上述营养组合物可对线粒体损伤的恢复提供基本营养条件，达到恢复线粒体损伤的目的。“线粒体的DNA复制（mtDNA）的周期与线粒体增殖是平行的”，“每个细胞内的线粒体进行几百到几千的复制”，采用营养组合物促进线粒体增殖，与当代的氯霉素法、辅酶Q法、线粒体基因转入法比较，有着本质的进步，但是对于线粒体内部大片DNA的缺失和损伤尚需进一步研究。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可使肝细胞、脾脏B细胞、肾小管上皮细胞及脑海马部神经元细胞线粒体增殖的营养组合物及在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物中的应用。
本发明的技术解决方案是：一种营养组合物，其特征在于各组分质量比如下：赖氨酸200~1200、甲硫氨酸100~1600、苯丙氨酸150~1400、苏氨酸50~600、色氨酸50~400、精氨酸200~1500、组氨酸100~1000、甘氨酸100~600、天冬氨酸100~600、亮氨酸100~600、异亮氨酸100~600、缬氨酸100~800、丝氨酸100~400、谷氨酰胺200~600、牛磺酸100~500、乳清酸100~300、核苷酸200~1200、维生素A 0.2~0.6、维生素D 0.002~0.006、维生素B2 1~4、维生素B6 1~4、维生素B12 0.001~0.006、烟酸 5~20、叶酸0.01~1.2、维生素C 50~150、铁2~10、锌2~10、锰2~10、铜 0.5~2、硒0.01~0.1、铬0.01~0.02、钾10~300、钙100~300、镁100~200、肌醇50~60、大豆磷脂100~2500。
各组分最佳质量比如下：赖氨酸600、甲硫氨酸800、苯丙氨酸700、苏氨酸300、色氨酸200、精氨酸760、组氨酸500、甘氨酸300、天冬氨酸300、亮氨酸300、异亮氨酸300、缬氨酸400、丝氨酸200、谷氨酰胺300、牛磺酸500、乳清酸300、核苷酸400、维生素A 0.6、维生素D0.006、维生素B22、维生素B62、维生素B12 0.004、烟酸12、叶酸0.9、维生素C100、铁10、锌10、锰 8、铜2、硒0.1、铬 0.02、钾 300、钙300、镁 200、肌醇60、大豆磷脂1200。
上述营养组合物在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物中的应用。
上述营养组合物在制备肝细胞线粒体增殖药物中的应用，
上述营养组合物在制备脾脏B细胞线粒体增殖药物中的应用，
上述营养组合物在制备肾小管上皮细胞线粒体增殖药物中的应用。
上述营养组合物在制备脑海马部神经元细胞线粒体增殖药物中的应用。
线粒体内的DNA（mtDNA）是裸露的，不与组蛋白结合，其突变率是核基因的10—100倍，易损伤而不易修复。虽然线粒体自我更新快，但线粒体内部大片DNA的缺失，是构成人类疾病和衰老的一个重要因素。由于“线粒体中90%以上的蛋白质都是由核基因编码，在细胞质核糖体上完成的，”因此，本发明在组合物中加大了从染色质、核酸代谢、DNA的甲基化及蛋白合成后修饰等营养保证力度，既提高了核基因受损后的修复能力，又促进了mtDNA的损伤修复，为生命科学领域从根本上解决能量代谢存在的问题，找到了出路。本发明的营养组合物具有促进造血干细胞增殖等作用且可对使肝细胞、脾脏B细胞、肾小管上皮细胞及脑海马部神经元细胞线粒体增殖，对肝细胞、脾脏B细胞线粒体基因损伤进行修复。解决了向机体植入外源基因所存在的种种问题，具有有效、安全、简便、经济、不产生免疫排斥等优点。
附图说明
图1是本发明实施例对再障大鼠体重的影响示意图。
图2是本发明实施例对再障大鼠肝脏细胞线粒体的影响示意图（电镜）。
图3 是本发明实施例对再障大鼠脾脏细胞线粒体的影响示意图（电镜）。
图4 是本发明实施例对再障大鼠肾小管上皮细胞线粒体的影响示意图（电镜）。
图5是本发明实施例对再障大鼠脑海马部的影响示意图（电镜）。
图6是本发明实施例对再障大鼠线粒体膜电位的影响示意图。
图7是本发明实施例对再障大鼠线粒体DNA含量的影响。
本发明实施例各实验组造血细胞、肝细胞及脾细胞内线粒体DNA含量示意图。
具体实施方式
实施例1：本发明的营养组合物各组分质量（mg）比如下：赖氨酸200~1200、甲硫氨酸100~1600、苯丙氨酸150~1400、苏氨酸50~600、色氨酸50~400、精氨酸200~1500、组氨酸100~1000、甘氨酸100~600、天冬氨酸100~600、亮氨酸100~600、异亮氨酸100~600、缬氨酸100~800、丝氨酸100~400、谷氨酰胺200~600、牛磺酸100~500、乳清酸100~300、核苷酸200~1200、维生素A 0.2~0.6、维生素D 0.002~0.006、维生素B2 1~4、维生素B6 1~4、维生素B12 0.001~0.006、烟酸 5~20、叶酸0.01~1.2、维生素C 50~150、铁2~10、锌2~10、锰2~10、铜 0.5~2、硒0.01~0.1、铬0.01~0.02、钾10~300、钙100~300、镁100~200、肌醇50~60、大豆磷脂100~2500。
实施例2：各组分质量（mg）比如下：赖氨酸600、甲硫氨酸800、苯丙氨酸700、苏氨酸300、色氨酸200、精氨酸760、组氨酸500、甘氨酸300、天冬氨酸300、亮氨酸300、异亮氨酸300、缬氨酸400、丝氨酸200、谷氨酰胺300、牛磺酸500、乳清酸300、核苷酸400、维生素A0.6、维生素D0.006、维生素B22、维生素B62、维生素B12 0.004、烟酸12、叶酸0.9、维生素C100、铁10、锌10、锰 8、铜2、硒0.1、铬 0.02、钾 300、钙300、镁 200、肌醇60、大豆磷脂1200。
所述营养组合物可对使肝细胞、脾脏B细胞、肾小管上皮细胞及脑海马部神经元细胞线粒体增殖，对肝细胞、脾脏B细胞线粒体基因损伤进行修复，可在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物中应用。
原料来源如下表：
实验：
一．再生障碍性贫血大鼠模型的建立
本实验采用SD大鼠。实验步骤：第一天X射线2.5Gy照射后，于第4、6、8天分别给予环磷酰胺35mg/kg，氯霉素45 mg/kg腹腔注射。第15天重复以上步骤。以单纯等量生理盐水相应部位注射为正常对照组。
实验分组：根据动物药理学的药品剂量和综合试验的设计分析，分为：①正常对照组；②再障模型组；③实施例2营养组合物高剂量组，以2266.95mg/kg.d对大鼠灌胃；④实施例2营养组合物中剂量组，以1511.3mg/kg.d对大鼠灌胃；⑤实施例2营养组合物低剂量组，以1057.91mg/kg.d对大鼠灌胃。
试验流程：首先，按前述再障大鼠模型的建立方法建立模型，从第5天开始，营养组合物高、中、低剂量组分别以相应剂量对大鼠进行灌胃，每天一次，直至第60天，拉颈处死大鼠，采样进行检测。同时每日进行整体观察，测量体重。
二．实验方法
1. 外周血检测
各实验组第60天, 称重动物，经眼眶取血，采用全自动血细胞分析仪测定外周血血红蛋白含量、红细胞、白细胞及血小板数；显微镜下观察外周血涂片。
2．促红细胞生成素（Epo）检测
酶标板每孔加入标准液，对照液及预先用样品稀释液稀释的待测样品100ul，封板，37°C孵育90分钟。反应后甩干孔内液体后，将准备好的生物素抗小鼠EPO抗体工作液按每孔100ul依次加入（TMB空白显色孔除外），封板后37°C反应60分钟，0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。加入准备好的亲和素－过氧化物酶复合物工作液按每孔100ul依次加入（TMB空白显色孔除外），37°C反应30分钟。按每孔90µl依次加入已在37℃中平衡30分钟TMB显色液，37°C避光反应，每孔100µl依次加入TMB终止液。用酶标仪于450nm波长处读取吸光度（OD值）, 根据标准曲线测得样本Epo浓度（pg/ml）。
3. 骨髓检测
颈椎脱臼处死大鼠, 分离双侧股骨打开骨髓腔进行骨髓涂片、骨髓单个核细胞计数、骨髓病理检查、骨髓间充质干细胞增殖及分化趋势的分析。
4. 骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离提取
SD大鼠腹腔注射麻醉药后脱颈处死，75% 乙醇浸泡大鼠20 min；无菌取双后肢，放入75% 的乙醇中浸泡5 min；清除下肢肌肉，从膝关节断离股骨，剪开股骨两端；用10 mL注射器吸取10% 胎牛血清的F-12K培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，制成单细胞悬液，200目筛网滤过后以1×108接种于培养瓶中。置于37°C、5% CO2培养箱中培养。72 小时首次更换培养液，去除未贴壁细胞，以后每隔2天换液1次。当细胞铺满整个培养瓶底面积的80%~90%时，传代培养。
5．间充质干细胞（BMSCs）的成脂诱导分化
成脂诱导法：将分离纯化的骨髓间充质干细胞常规培养，消化传代，以1×105/孔的密度，400ul/孔接种于预先放置有盖玻片的6孔培养板中，制备细胞爬片，当细胞生长达80%融合时，加入10%的胎牛血清、1μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L牛胰岛素的H-DMEM诱导3天，再用10% 的胎牛血清、10 mg/L牛胰岛素的H-DMEM处理1天，如此循环3次后，用10%的胎牛血清、10 mg/L牛胰岛素的H-DMEM处理7天，每隔三四天换液1次。对照组始终加入含体积分数为10% 的胎牛血清、10 mg/L牛胰岛素的H-DMEM，每隔三四天换液1次。诱导后细胞用PBS洗涤2~3次，10% 甲醛室温固定40min。PBS洗2~3次，饱和油红O染液用一蒸水以3:2稀释，室温染色30min，PBS洗数次直至无肉眼观察到沉渣，光镜观察。
6. 间充质干细胞（BMSCs）成骨细胞培养及鉴定
取P2代骨髓间充质干细胞，按2×105个/孔接种于12孔板，当细胞贴壁生长达80% 融合时，吸除孔中培养液，换为成骨细胞诱导液 (含高糖DMEM、体积分数为10% 胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、10-2 mol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸)，每3天更换诱导液1次。培养14天后，吸除培养液，PBS洗2次，10%甲醛室温固定40 min，PBS洗3次，加入0.1% 茜红素（3:2稀释），室温染色10min，去除染液，PBS洗3次后，显微镜下观察。
7. RNA提取和RT-PCR分析
常规应用Trizol 法提取各标本的总RNA，紫外分光光度计测定A260和A280，以检测RNA含量和纯度，并置放于-70°C保存。
反转录体系20μl，包含样品RNA 1μl，按照TaKaRa 的反转录试剂盒提供的说明书进行操作。反转录反应条件为：65°C 1min，30°C 5min，65°C 15min，98°C 5min，5°C 5min。
PCR反应体系50 μl，包含反转录液10 μl。PCR反应条件： 94°C预变性1min；97°C变性 20s,64°C退火20s,72°C 20s延伸，循环30次；72°C 延伸5min，4°C恒定。取5μl PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳， 紫外灯下凝胶成像。
8. 透射电镜观察
将大鼠部分肝、脾、脑、肾组织标本上取不同部位的3张切片进行透射电镜(JEM-100CXE型) 超微结构的观察，每张切片分别随机观察5-6个部位，并按相同放大倍数摄片，每组随机抽取l0张照片，采用Epson微机和Summa Sketch PIus 数字化仪，并使用Sigmascan软件，对各组照片作电镜图像的形态进行分析，同时计数线粒体的平均数目。
9. 线粒体膜电位测定
细胞（5×105个）接种于25cm2培养瓶中, 37℃培养24 h后，加入不同浓度的姜黄素分别作用1 h和 6 h 后，收获细胞，PBS洗两遍，重悬于2ml 含1.0 µM 罗丹明123的新鲜培养液中，37°C 水浴振摇孵育10 min，离心去掉细胞，荧光比色计测定培养液中罗丹明123的强度，激发波长490 nm，发射波长520 nm，结果以细胞吸收的罗丹明123的荧光强度表示。
10. 线粒体DNA含量测定
将骨髓单个核细胞（5×107）、新鲜组织肝脏、脾、脑、肾匀浆、裂解、离心，获取线粒体。按照DNA提取试剂盒说明提取线粒体中的DNA，采用紫外分光光度计测量其含量。计算公式如下：
DNA浓度（μg/μl）= A260 × 50μg/ml × 稀释倍数 × 10-3。
11. 病理学观察
将大鼠部分肝、脾、脑、肾、肠、肌肉置于4 %多聚甲醛中固定，依次经过常规脱水、石蜡浸泡包埋、切片、HE 染色, 显微镜观察各组织细胞的形态结构。
12. 免疫组化染色
石蜡切片脱蜡、水化；PBS洗2-3次各5分钟；3% H2O2（80%甲醇）滴加在玻片上，室温静置10分钟；PBS洗2-3次各5分钟；抗原修复；PBS洗2-3次各5分钟；滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，滴加一抗50μl，4°C过夜。过夜后需在37°C复温45分钟。PBS洗3次各5分钟；滴加二抗40-50μl，室温静置，或37°C 1小时；PBS洗3次各5分钟；DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度；PBS或自来水冲洗10分钟；苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；自来水冲洗10-15分钟；脱水、透明、封片、镜检。
13. 流式细胞仪分析
取大鼠左胫骨，去除表面肌肉组织，修剪骨垢，用18 号针插入胫骨踝端，用PBS 5mL 冲洗入试管内，以200目筛网过滤。1000 r/min 离心 5min，弃上清液。将细胞加入5mLPercoll分离液（相对比重1.073g/L），2000r/min，离心25min，取中间单个核细胞层。PBS洗涤后调整单个核细胞数为l×106/管，每样本3管，测定管加入FITC标记的CD34或CD45抗体，37°C孵育2小时。然后PBS洗涤一次。用流式细胞仪检测表达CD34/45阳性细胞数量变化，以标记抗体呈阳性的细胞百分率作为表达CD34/45 蛋白（骨髓造血干细胞标志物）的计量标准。同时以只加标记荧光素的羊抗兔IgG和不加抗体的细胞作阴性对照。
14. 蛋白芯片分析
将大鼠部分骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞、肝脏组织进行蛋白芯片分析，此部分工作由上海康城公司完成。
15. 统计学分析
所有数据均用SPSS 17.0软件进行统计分析。每一项分析至少有三次结果。数值用均数±SD表示，采用t检验。P<0.05认为有显著性差异,并在统计学上有意义。
三、实验结果
（一）营养组合物对再障大鼠全身情况的影响
与正常对照组相比，再障模型组大鼠自6天起陆续出现皮毛松弛蓬乱，光泽度降低，部分大鼠有脱毛及皮损。同时大鼠消瘦、精神渐显不佳，唇色眼睑苍白、活动减少、少食、体重下降。其中再障模型组大鼠体重（218.23±33.52 g）与正常对照组（366.54±49.68 g,*p <0.05）相比下降明显。
不同剂量的营养组合物组与再障模型组比较，大鼠精神状态渐佳，进食量增大，体重增加（见图1）。表明营养组合物对再生障碍性贫血小鼠全身有显著恢复作用。
（二）营养组合物对再障大鼠外周血的影响
与正常对照组相比，再障模型组外周血中红细胞 (RBC)、白细胞 (WBC)、血小板 (PLT)及血红蛋白 (Hb) 均显著下降 (表 1，#p<0.05)；不同剂量营养组合物组与再障模型组比较，其外周血中各项指标均显著升高 (表 1，*p<0.05)，并呈量效依赖性。
与正常对照组相比，再障模型组大鼠促红细胞生成素（EPO）含量明显升高，且EPO与 RBC、 Hb的降低呈负相关，r=-0.91及r=-0.93（* p<0.05），表明EPO水平与再障骨髓红系生成能力降低，EPO反应性能力减弱，EPO呈代偿性升高有关。(表1，* p <0.01)。EPO是一种重要的造血调控因子，具有促进红系祖细胞增殖、分化和成熟，维持外周血中红细胞，血红蛋白恒定的作用，血液中EPO水平能反映机体中的红细胞生成能力。而不同剂量的营养组合物组与再障模型组比较,促红细胞生成素（Epo）由于代偿作用含量降低 (* p <0.01)；并呈剂量-效应关系。
以上结果提示，营养组合物对再障大鼠外周血各种血细胞有促进升高作用。
表1营养组合物对再障大鼠外周血的影响
# P<0.05 再障组与正常组；*P<0.05 营养组合物组与再障组
（三）营养组合物对再障大鼠线粒体的影响
1. 线粒体形态观察
肝组织（汇管区）透射电镜显示（图2），与正常对照组相比，再障模型组大鼠肝细胞内线粒体数目明显减少，嵴不清楚或消失，细胞浆疏松；不同剂量的营养组合物组与再障模型组比较, 大鼠肝细胞内线粒体数目明显增多，胞浆逐渐恢复正常。
脾透射电镜显示（图3），与正常对照组相比，再障模型组大鼠脾脏B细胞内线粒体数目明显减少；不同剂量的营养组合物组与再障模型组比较，细胞内线粒体数目明显增多。
肾小管上皮细胞透射电镜显示（图4），与正常对照组相比，再障模型组大鼠肾小管上皮细胞内线粒体数目明显减少，排列紊乱；不同剂量的营养组合物组与再障模型组比较，肾小管基底部上皮细胞线粒体数目明显增多，排列整齐。
脑透射电镜显示（图5），与正常对照组相比，再障模型组大鼠脑海马部神经元细胞内线粒体数目明显减少；不同剂量的营养组合物组与再障模型组比较, 大鼠脑细胞内线粒体数目略有增多。
结果表明本发明实施例营养组合物可促进再障大鼠肝细胞线粒体、脾脏B细胞线粒体、肾小管上皮细胞线粒体及脑海马部神经元细胞线粒体的增加。
2. 线粒体膜电位测定
线粒体膜电位是观察线粒体功能的重要指标，线粒体功能的改变多表现为膜电位降低和膜的不稳定。采用荧光探针罗丹明123（Rh123）测定营养组合物对线粒体膜电位的影响。Rh123为亲脂性阳离子荧光素，能顺利通过活细胞的细胞膜和线粒体膜，进入线粒体后，由于线粒体膜的负电位差使Rh123选择性富集在线粒体上，胞浆中结合的非常少。线粒体对Rh123的摄入量取决于其膜电位的高低，一定的膜电位形成一定的荧光强度，成正比，强度的大小反映线粒体膜受损程度。
与正常对照组相比，再障模型组大鼠骨髓造血细胞、肝细胞及脾细胞内线粒体膜电位呈明显下降趋势，表明线粒体功能缺失（表2）；不同剂量的营养组合物组与再障模型组比较，大鼠骨髓造血细胞、肝细胞及脾细胞内线粒体膜电位明显增高，呈量效关系（表2）。
与正常对照组相比，再障模型组大鼠脑、肾细胞线粒体膜电位减少（图6），但无显著差异；不同剂量的营养组合物组与再障模型组比较, 大鼠脑、肾细胞线粒体膜电位略有增加，但无显著差异（图6）。
结果表明营养组合物可促进再障大鼠骨髓单个核细胞、肝细胞及脾细胞线粒体膜电位升高；而对再障大鼠的脑、肾细胞线粒体膜电位无显著影响。
表2
# P<0.05 再障组与正常组；*P<0.05 营养组合物组与再障组
3. 紫外分光光度计检测线粒体DNA含量
与正常对照组相比，再障模型组大鼠骨髓造血细胞、肝细胞及脾细胞mtDNA的含量明显下降趋势；不同剂量的营养组合物组与再障模型组比较，大鼠骨髓造血细胞、肝细胞及脾细胞mtDNA的含量明显增高，呈量效关系（表3）。
与正常对照组相比，再障模型组大鼠脑、肾细胞线粒体mtDNA的含量减少（图7），但无显著差异；不同剂量的营养组合物组与再障模型组比较，大鼠脑、肾细胞mtDNA的含量略有增加，但无显著差异（图7）。
以上结果表明营养组合物对再障大鼠骨髓单个核细胞、肝细胞及脾细胞mtDNA的损伤具有恢复作用；而对再障大鼠的脑、肾细胞mtDNA含量无显著影响。
表3
# P<0.05 再障组与正常组；*P<0.05 营养组合物组与再障组。

Claims (7)

1.一种营养组合物，其特征在于各组分质量比如下：赖氨酸200~1200、甲硫氨酸100~1600、苯丙氨酸150~1400、苏氨酸50~600、色氨酸50~400、精氨酸200~1500、组氨酸100~1000、甘氨酸100~600、天冬氨酸100~600、亮氨酸100~600、异亮氨酸100~600、缬氨酸100~800、丝氨酸100~400、谷氨酰胺200~600、牛磺酸100~500、乳清酸100~300、核苷酸200~1200、维生素A 0.2~
0.6、维生素D 0.002~0.006、维生素B2 1~4、维生素B6 1~4、维生素B12 0.001~0.006、烟酸5~20、叶酸0.01~1.2、维生素C 50~150、铁2~10、锌2~10、锰2~10、铜 0.5~2、硒0.01~0.1、铬0.01~0.02、钾10~300、钙100~300、镁100~200、肌醇50~60、大豆磷脂100~2500。
2.根据权利要求1所述的营养组合物，其特征在于各组分质量比如下：赖氨酸600、甲硫氨酸800、苯丙氨酸700、苏氨酸300、色氨酸200、精氨酸760、组氨酸500、甘氨酸300、天冬氨酸300、亮氨酸300、异亮氨酸300、缬氨酸400、丝氨酸200、谷氨酰胺300、牛磺酸500、乳清酸300、核苷酸400、维生素A 0.6、维生素D0.006、维生素B22、维生素B62、维生素B12 0.004、烟酸12、叶酸0.9、维生素C100、铁10、锌10、锰 8、铜2、硒0.1、铬 0.02、钾 300、钙300、镁 200、肌醇60、大豆磷脂1200。
3.一种如权利要求1或2所述营养组合物在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物中的应用。
4.一种如权利要求3所述营养组合物在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物中的应用，其特征在于在制备肝细胞线粒体增殖药物中的应用。
5.一种如权利要求3所述营养组合物在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物中的应用，其特征在于在制备脾脏B细胞线粒体增殖药物中的应用。
6.一种如权利要求3所述营养组合物在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物中的应用，其特征在于在制备肾小管上皮细胞线粒体增殖药物中的应用。
7.一种如权利要求3所述营养组合物在制备线粒体增殖、线粒体基因损伤修复药物中的应用，其特征在于在制备脑海马部神经元细胞线粒体增殖药物中的应用。
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