CN106103725A - 由生物质生产可溶性糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于生产可溶性糖的酶介导的生物质水解的方法，其中所述方法包括向酶溶液稳定添加小份的生物质，实现生物质的快速溶解。用于酶糖化的方法实现生物质载量增加、酶再循环以及底物和产物抑制效应的减轻。未水解的生物质与可溶性酶一起再循环确保所述酶的完全重复用于有效的重复水解，由此增加所使用的酶的总体生产力。

Description

由生物质生产可溶性糖的方法
技术领域
本发明涉及一种由生物质生产可溶性糖的方法，该生物质还用于生产有价值的产品，例如燃料和其它化学品，包括乙醇。
背景技术
虽然长期以来，生物质作为一种有前景的可再生燃料能源，但仍需要更有效的将生物质转化为合适生物燃料的方法。纤维素和木质纤维素原料和废物，例如农业残渣、木材、林业废物、造纸污泥和城市和工业固体废物，为生产诸如燃料和其它化学品等有价值的产品提供了潜在的可再生原料。植物材料也是可转化为生物燃料的诸如葡萄糖等可发酵糖的重要来源。植物材料中的糖由包括纤维素、半纤维素、葡聚糖和木质素的长链聚合物组成。因此需要把这些聚合物分解成单体糖。将生物质转化为可发酵糖的方法是本领域已知的，通常主要包括以下二个步骤：预处理步骤，使植物结构变松，和化学或酶水解步骤，将纤维素和半纤维素的高分子链转化为单糖，单糖又进一步被发酵为有用的产品。
预处理步骤是精细的平衡行为，旨在打开纤维，以使得酶可接近，同时使糖损失和抑制物的产生最小化，从而确保高产量和适于酶水解及发酵的底物。使用预处理方法，使纤维素和木质纤维素材料的碳水化合物聚合物对于糖化/水解酶更易处理。
然后，使用诸如半纤维素酶和纤维素酶等酶对预处理后的混合物进行酶水解，酶催化半纤维素或纤维素水解成水解产物中的寡糖和/或单糖。对水解产物进一步进行发酵生产生物燃料。用于从预处理后的生物质生产可发酵糖的糖化酶通常包括一种或多种糖苷酶，例如纤维素水解糖苷酶、半纤维素水解糖苷酶、淀粉水解糖苷酶，以及肽酶、脂肪酶，木质素酶和/或阿魏酸酯酶。Lynd,L.R.等人(Microbiol.Mo.Bio.Rev.(2002)66:506-577)综述了用于生物质处理的糖化酶和方法。
美国专利US20090053777公开了一种使预处理后生物质进行糖化而得到高浓度可发酵糖的方法。分批进料反应器系统包括多个粒径减小步骤，并混合以在垂直搅拌槽中保持彻底的混合。该方法包括：提供一部分可混的预处理后生物质浆料；和部分复合糖化酶，其包括至少一种能够水解纤维素的酶；使所述浆料和酶在25℃至60℃的温度和pH4.5至6.0下反应；应用粒径减小装置；加入另一部分预处理后生物质，产生较高固体生物质浆料；使所述较高固体生物质浆料在上述条件下反应，其中重复该步骤两次以上，以产生高含糖量的水解产物；其中预处理后生物质的干重在24％-30％之间，以获得水解终产物重量的20％。
WO2011157427描述了一种用于纤维素生物质的酶水解的连续方法，其中该方法包括将预定量的纤维素生物质和酶加入连续搅拌的罐反应器，对纤维素生物质进行部分酶水解，其中部分水解的纤维素生物质被连续移走。所述纤维素生物质的固体含量为10-45％之间。
WO2006063467公开了一种用于预处理后纤维素的酶水解的连续方法系统，其包括：将预处理后纤维素原料的含水浆料加入垂直柱水解反应器的底部。通过避免混合并使浆料平均流速保持在每小时约0.1-约20英尺而限制反应器中的轴向扩散，使未溶解的固体以比液体慢的速度向上流动。将含水浆料加入反应器的步骤前或期间，将纤维素酶添加至含水浆料。分离包括水解产物和未水解固体的含水物流，并在同一反应器中再循环未水解的纤维素。文中也描述了包括纤维素酶和絮凝剂的酶组合物，使酶暴露于底物，进行水解过程。相应酶载量为32单位/克纤维素至485单位/克纤维素的条件下，纤维素转换为葡萄糖所需的时间是48至200小时。
US20100255554公开了一种优化分批进料水解过程的方法，其中水解时间通过控制进料添加体积和/或分批添加频率或预水解物和酶原料而最小化。上述方法包括：用水填充反应容器；加入纤维素酶；并向反应容器顺序加入木质纤维素预水解物生物质进料以产生反应混合物，其中在20小时的总进料时间内以预定的批体积和批添加频率分批次添加预水解物进料，以获得最终反应混合物中的预选择的终浓度和预选择的干物质含量。在反应混合物中达到70-90％的理论上的纤维素向葡萄糖的转化，其中批加入频率为每80-105分钟一批，预选择的终浓度为24％，总进料时间为80-120小时。
根据现有技术所描述的方法，生物燃料生产采用的主要方法包括三个主要步骤，即生物质处理、酶水解以及糖发酵，以获得生物燃料。酶水解过程面临的主要障碍是反应速率低，酶的成本高，产物浓度低。如现有技术中所描述的方法，上述问题通过用高不溶性固体浓度操作酶水解来克服。然而，高不溶性固体浓度的糖化反应将不得不面临浓稠纤维悬浮液的流变学性质所致的粘性增加、混合所需的能量高、酶剪切活化和传热不良的挑战。因此，需要开发一种能够克服上述问题的方法。
发明内容
本发明的一个方面是提供一种生产可溶性糖用的酶介导的生物质水解方法，其中所述方法包括向酶溶液中稳定添加小部分生物质，实现迅速溶解。这使得添加生物质而在反应混合物中具有高浓度的底物，而实现高底物载量下有效的糖化。与可溶性酶一起再循环未水解的生物质确保所述酶全部再用于反复水解，从而提高所用酶的总生产率。
本发明的另一方面是提供一种由生物质生产可溶性糖的方法，其中所述方法包括：在40-60℃范围的温度下，在反应容器中以4-6的pH范围制备酶溶液；将一批全纤维素(holocellulose)百分比(％)在70-100％范围且含水量在10-80％(w/w)的生物质添加至步骤(a)的酶溶液，同时保持pH值在4-6的范围且温度为40-60℃，得到含有预定生物质：酶比例的初始反应混合物，其中该初始反应混合物中的预定生物质：酶比例在1:104至l:106(kg生物质/酶FPU)范围内；在30-90分钟内如步骤(b)反复分批添加剩余生物质，以获得最终反应混合物中10-30％的固体载量，其中生物质:酶比保持在1:103至1:105(kg酶生物质/酶FPU)的范围内。使该最终反应混合物补充反应5-120分钟，得到生物质水解物，其中实现40-80％的生物质溶解。将来自步骤(d)的生物质水解物的固体液体成分进行分离，以获得包括可溶性糖和酶的滤液，以及未水解生物质和吸附的酶的残渣；将可溶性酶从滤液中存在的可溶性糖分离；和将来自步骤(e)的残渣和来自步骤(f)的分离的可溶性酶再循环至步骤(b)，以保持生产可溶性糖用的预定的生物质:酶比例。
本发明的一个方面提供了一种反应容器系统中预处理后生物质进行酶介导水解以生产可溶性糖的方法。用于酶糖化的方法主要分为三类，即，(a)提高反应器中的累积生物量；(b)再循环酶；(c)减少抑制作用。因此，本发明增加了可溶性糖生产中总固体含量。
附图说明
将参照以下附图进一步描述本发明：
图1描绘了逐渐进料添加生物质以获得高底物浓度的方法。该方法涉及以稳定的时间间隔添加进料，使获得15％的最终固体载量。对由此产生的溶解反应混合物进行超滤，以分离由未水解残渣和可溶性酶组成的渗余物以及由可溶性糖组成的渗透物。本文使用的术语“进料份”是指向反应混合物逐步添加的底物批次。本文使用的术语“未水解残渣”是指溶解后剩下的不溶性生物质，其被再循环进入反应供进一步使用。
具体实施方式
本发明中，多个术语用于描述本发明。术语的定义如下：
定义：
本文使用的术语“生物质”是指生物质，其包括玉米芯、玉米秸秆、玉米纤维、玉米壳、锯末、小麦秸秆、甘蔗渣、柳枝稷、稻草秸秆和草；并适当地预处理，以得到含量超过70％的富集的全纤维素，使全纤维素可由酶反应处理。
本文使用的术语“生物质水解物”是指来自反应容器的水解产物，其包括已水解生物质、酶和未水解生物质的混合物。
本文使用的术语“可溶性糖”是指水溶性的并可在发酵过程中用作微生物的碳源底物以生产生物燃料、生物化学品和/或也可在任何食品、药品和/或其它应用中用作糖的所有多糖和单糖及其混合物。
本文使用的术语“留底料(heel)”是指在引入预处理的生物质和开始糖化过程之前加入反应器的初始液体或浆料。
本发明涉及一种用于生产可溶性糖的酶介导的生物质水解方法，其中使纤维素溶解而实现用于水解反应的高生物质载量的酶可再循环并可产生糖浓度高的生物质水解物。
本发明的一个目的是提供一种酶再循环以得到高载量生物质的方法，其产生具有高糖浓度的生物质水解物。
本发明的另一个目的是评测底物浓度，以在涉及纤维素转化的酶水解期间增加生物质载量，并在水解时降低粘度，目的是探讨生物质载量、粘度和生物质材料的酶催化纤维素降解之间的相互作用。
本发明的又一个目的是从生物质水解物再循环和再利用酶，将其进一步用于酶水解。
本发明的另一个目的是提供一种避免底物抑制和终产物抑制的方法，其在生物质向葡萄糖的转化中发挥关键作用。
本发明的一个实施例提供了一种从生物质生产可溶性糖的方法，其中所述方法包括：
a.在40-60℃范围的温度下，在反应容器中以范围在4至6的pH制备酶溶液；
b.将一批全纤维素(％)在70-100％范围且含水量在10-80％(w/w)范围的生物质添加至步骤(a)的酶溶液，同时保持pH值在4-6的范围且温度为40-60℃，以获得含有预定生物质:酶比例的初始反应混合物，其中该初始反应混合物中的预定生物质:酶比例在1:104至l:106(kg生物质/酶FPU)的范围内；
c.在30-90分钟内如同步骤(b)反复分批添加剩余的生物质，以获得最终反应混合物中10-30％的固体载量，其中生物质:酶比例保持在1:103至1:105(kg生物质/酶FPU)的范围内；
d.使该最终反应混合物补充反应5-120分钟，以获得生物质水解物，其中实现40-80％的生物质溶解；
e.分离来自步骤(d)的生物质水解物的固-液成分，以获得包括可溶性糖和酶的滤液，以及未水解生物质和吸附的酶的残渣；
f.将可溶性酶从滤液中存在的可溶性糖分离；和
g.将来自步骤(e)的残渣和来自步骤(f)的分离的可溶性酶再循环至步骤(b)，以保持生产可溶性糖用的预定的生物质:酶比例。
本发明也提供一种在反应容器系统中用于生产可溶性糖的酶介导的预处理生物质的水解方法。用于酶糖化的方法主要分为三类，即，(a)增加反应器中的累积生物质；(b)再循环酶；(c)减轻抑制效应。由此，本发明增加了可溶性糖生产中得到的总固体含量。
本发明的一个最优选实施例提供了一种通过生物质水解来生产可溶性糖的方法，其中用于水解过程的生物质是农产品，其选自但不限于由玉米芯、玉米秸秆、玉米纤维、玉米壳、锯末、小麦秸秆、甘蔗渣、柳枝稷、稻草秸秆和草组成的组；并适当地预处理，使纤维素和半纤维素含量对于酶反应可处理。
根据本发明的又另一实施例，用于水解过程的生物质可以经预处理，以得到含有超过70％的富集的全纤维素，并使全纤维素对于酶反应可处理。
根据本发明的另一个实施例，可通过本领域技术人员已知的任何方法预处理生物质，例如，用酸、碱、有机溶剂、氧化剂或其它化学物质和/或结合蒸气或单独用蒸气，通过例如粉碎、研磨或切断等机械破坏等。
本发明的又另一实施例提供了一种从预处理的生物质生产可溶性糖的方法，其中水解过程前使预处理的生物质经过多个粒径减小步骤，并且在水解期间充分混合反应器内容物，实现pH和温度控制。
根据本发明又另一个实施例，粒径减小，更快的酶水解和以稳定方式添加生物质的组合使生物质有效地混合，从而导致建立降低的生物质粘度。减小粒径步骤使润湿的固体生物质快速溶解。
在本发明中，在酶水解时进行作为底物的预处理生物质的顺序加载，用于生产可溶性糖。对反应逐渐加载底物，以使底物水平从10％升高至30％干质量(DM)(w/w)。2小时后，最高终葡萄糖浓度在50-150gm/升的范围内。
本发明的另一个实施例提供了一种生物质加载方法，其中初始地将生物质加载到该反应容器中，作为特定浓度为1％-10％的可混合浆料。
根据本发明的又另一个实施例，在0.5-1.5小时内将初始加载生物质中的生物质以二、三、四、五、六、七、九、十和十二个进料份稳定地加入，使固体载量增加至少约30％(w/v)。
本发明的另一个实施例中，在0.5-1.0小时内稳定地添加三到九个进料份的生物质，使固体载量增加至少约15％(w/v)。
本发明的又另一个实施例中，提供了一种由生物质生产可溶性糖的方法，其中进料时间为约0.5-1.5小时。
本发明的又一个最优选实施例中，待添加到反应混合物的总生物质份数是一份完成，或分多份以每2.5-50分钟一份完成，以获得范围在10％-30％的预定的固体生物质载量和0.5-1.5小时的预定的总进料时间。
本发明的另一个实施例中，提供了一种由生物质生产可溶性糖的方法，其中在用搅拌能力为200-400rpm的顶置式搅拌器的搅拌下稳定地将生物质添加至酶溶液，使生物质完全混合，导致水解过程中生物质粘度较低和pH及温度的控制。
本发明的最优选实施例中，在反应开始时加入所有糖化酶。
根据本发明又一个实施例，用于水解的这些糖化酶选自由纤维素酶、肽酶、脂肪酶、木质素酶和阿魏酸酯酶，以及其它辅助酶组成的组，最优选纤维素酶。
本发明的一个实施例中，以蛋白载量为生物质的约2mg/g至约95mg/g向反应体系添加酶。
本发明的另一个实施例中，从水解过程开始时反应容器中存在的生物质的形式为可混合浆料，在该搅拌系统的作用下其变得基本上均质，并在糖化酶浓度的作用下变得粘度较低。
根据本发明，生物质的完全混合提供更好的pH和温度可控性，由此得到干重生物质含量高、可溶性糖收率高的生物质水解物。
本发明的一个优选实施例中，初始反应混合物的温育在40-60℃温度范围和4-6的pH范围下进行2.5-120分钟。
本发明的另一个实施例中，浆料中部分水解的生物质可能变得粘度较低，使其它生物质可加入该浆料中，同时又保持足够的混合程度和浆料粘性，使加载到水解浆料中的总固体百分含量增加。
本发明的又另一个实施例中，生物质的水解在4-6的pH范围，40℃-60℃的最佳温度范围下进行，以获得40-80％的生物质溶解。
根据本发明，可根据欲使用的糖化酶所需的最佳温度和待处理的生物质的特定类型，对生物质进行加热，而获得范围在40℃-60℃的所需温度，以获得可能的最佳糖化反应速率。
在生物质浆料混合的同时，通过添加所需的酸或碱达到所需的浆料pH值，以确保整个生物质材料中具有基本上均一的pH值。
本发明的最优选的实施例中，通过使用酸和/或碱实现浆料pH值的调节和控制，该酸选自由HC1、H2SO4、CH3COOH、H3PO4、HNO3组成的组，或者该碱选自由NaOH、KOH、NH3、Na2CO3和K2CO3组成的组。
本发明的一个实施例提供了一种生物质水解的方法，其中水解过程得到的生物质水解物含有可溶性糖溶液、酶和未水解生物质的混合物。
根据本发明，所述的方法是：生物质水解，使得最大量的酶吸附在生物质上，并产生浓缩的糖物料流。
本发明的另一个实施例，利用微滤膜(MF)将酶和/或未水解生物质从水解物中分离或过滤出来，该微滤膜的截留分子量(MWCO)为100kDa至500kDa。
本发明的另一个实施例，通过利用截留分子量(MWCO)为1kDa至20kDa的滤膜进行超滤后从获得的渗余物中分离可溶性糖溶液和纤维素酶而实现纤维素酶的回收和再循环。
未水解的生物质浆料部分及其上吸附的大量酶被再循环。水解物中存在的其它酶与可溶性糖一起通过过滤回收并再利用。
根据本发明的另一个实施例，1-4小时内生物质被转化为可溶性糖。
超滤后得到的包括可溶性糖的渗透物可进入发酵过程。
本发明的优选实施例之一，本方法产生的水解物中的可溶性糖的浓度为至少75g/L，它通常被认为是高糖浓度。
根据本发明的又另一个实施例，本发明方法产生的可溶性糖可用于发酵过程，以生成诸如燃料和化学品等有价值的产品，包括乙醇。
本发明的有益效果如下：
1)与传统批处理方法相比，本发明具有多个经济优点，例如，由于体积小，所以投资成本低，由于产品浓度较高，所以降低操作成本，降低下游加工成本。
2)所提供的方法更有效，所以与传统的公知方法相比，粘度下降更快，可溶性糖的生成更高效。
3)尽管水解过程使用的酶价格贵，但本发明提供了所用酶的的回收和再循环，使该方法更经济，实现由生物质连续生产可溶性糖。
4)本发明提供了一种水解前将酶吸附在生物质上的方法，其增加了反应速率和酶回收。
以下实施例仅用于对本发明进行说明，并不意图限制本发明的保护范围。
实施例
实施例1
不同纤维素含量的生物质的糖化
在保持在在温度50℃和pH值5.0下的酶溶液中，以15.0％的总干固体载量溶解由酸/碱处理小麦秸秆所得到的包含不同全纤维素含量(70-95％)的预处理的生物质。包含以干重计37.5g的生物质的初始基料与酶溶液混合，该酶溶液包含纤维素酶BTM(AdvancedEnzyme Technology Ltd.,Thane,India)和750gm酸化水，蛋白质载量为27.75mg/g生物质。在温度保持在50℃和pH值5.0条件下，以300rpm速率搅拌反应物料。0.5-1.0小时内逐渐加入剩余的生物质，使固体载量增加到15％。溶解的全纤维素的百分比测定为加入反应中的总全纤维素的干重下降，并表示为下面给出的％溶解：
％溶解×100＝反应结束时未水解全纤维素的干重/加入反应中的总全纤维素的干重
表1：不同纤维素含量的生物质的糖化
实施例2
不同生物质载量的生物质的糖化
在保持在温度50℃和pH值5.0下的酶溶液中，以15.0％、20.0％和30.0％的不同总干固体载量溶解由酸/碱处理小麦秸秆所得到的包含不同全纤维素含量(70-95％)的预处理的生物质。包含以干重计37.5g的生物质的初始基料与酶溶液混合，该酶溶液包含纤维素酶BTM(Advanced Enzyme Technology Ltd.,Thane,India)和750gm酸化水，蛋白载量为27.75mg/g生物质。温度保持在50℃和pH值5.0下，以300rpm速率搅拌反应物料。0.5-1.0小时内逐渐加入剩余的生物质，使固体载量增加到15.0％、20.0％和30.0％。溶解百分率的测定如以上实施例1所述。
表2：不同生物质载量的生物质的糖化
实施例3
预处理的生物质的糖化
在保持在50℃和pH值5.0下的酶溶液中，以15.0％的总干固体载量溶解由酸/碱处理小麦秸秆所得到的预处理的生物质。包含以干重计37.5g的生物质的初始基料与酶溶液混合，该酶溶液包含纤维素酶BTM(Advanced Enzyme Technology Ltd.,Thane,India)和750gm酸化水，蛋白载量为27.75mg/g生物质。温度保持在50℃和pH值5.0下，以300rpm速率搅拌反应物料。0.5-1.0小时内逐渐加入剩余的生物质，使固体载量增加到15％。溶解百分率的测定如以上实施例1所述。
表3：通过纤维素酶B的预处理生物质的糖化
实施例4
进料份对于生物质溶解(～85％全纤维素)
向温度保持在50℃和pH值5.0的2L酶溶液中添加100gm(干重)预处理的生物质(～85％全纤维素)，以获得1:106(kg生物质/酶FPU)的底物：酶比率。在下一个一小时内，以三、五、七和九进料份逐渐加入200gm预处理的生物质，以获得1:105(Kg生物质/酶FPU)的底物：酶比率。在上述条件下使反应进行1小时。离心全部反应混合物，以从溶解的物料中分离出固体残渣，进一步经过膜过滤分离出糖和酶。溶解百分率的测定如以上实施例1所述。下表显示可实现的％溶解：
表4：进料份对生物质溶解的作用(～85％全纤维素)
实施例5
进料份对于生物质溶解(～92％全纤维素)
向温度保持在50℃和pH值5.0的2L酶溶液中添加100gm(干重)预处理的生物质(～92％全纤维素)，以获得1:106(kg生物质/酶FPU)的底物：酶比率。在下一个一小时内，以三、五、七和九进料份逐渐加入200gm预处理后生物质，以获得1:105(Kg生物质/酶FPU)的底物：酶比率。在上述条件下使反应进行1小时。离心全部反应混合物，以从溶解的物料中分离出固体残渣，进一步经过膜过滤分离出糖和酶。溶解百分率的测定如以上实施例1所述。下表显示可实现的％溶解：
表5：进料份对生物质溶解的作用(～92％全纤维素)
实施例6
用于生物质溶解的粒径
减小水稻秸秆的尺寸，并用碱进行全纤维素的预处理(>80％纤维素)。将上述预处理样品添加至温度保持在50℃和pH为5.0的酶溶液，使初始浓度为5％。下一个一小时内慢慢加入预处理后生物质，使生物质浓度达到15％。在上述条件下使反应再进行1小时。离心全部反应混合物，以从溶解的物料中分离出固体残渣，进一步经过膜过滤分离出糖和酶。溶解百分率的测定如以上实施例1所述。下表显示可实现的％溶解：
表6：粒径对生物质溶解的作用
实施例7
批和补料分批纤维素水解的比较
以两种不同的反应模式，向保持在50℃和pH值5.0的2L酶溶液中添加300gm(干重)预处理后生物质(>80％纤维素)加入2L酶溶液，这两种模式为：a)单次添加-批和b)1小时内逐渐添加-补料分批。离心全部反应混合物，以从溶解的物料中分离出固体残渣，进一步经过膜过滤分离出糖和酶。溶解百分率的测定如以上实施例1所述。下表显示可实现的％溶解：
表7：生物质溶解度-操作模式的比较
实施例8
酶载量对生物质水解的作用
向含有不同蛋白质载量的2L酶溶液中添加100gm(干重)预处理的生物质(>80％纤维素)，以获得1:104至1:107(Kg生物质/酶FPU)的底物:酶比率。反应在50℃温度和pH值5.0条件下进行。下一个一小时内缓慢添加200gm预处理的生物质，使生物质浓度达到15％，并且在上述条件下使反应再进行1小时。离心全部反应混合物，以从溶解的物料中分离出固体残渣，进一步经过膜过滤分离出糖和酶。溶解百分率的测定如以上实施例1所述。下表显示可实现的％溶解：
表8：酶载量对生物质溶解的作用
实施例9
全纤维素(～85％全纤维素)的连续水解和酶再循环
向保持在50℃和pH 5.0的2L酶溶液添加100gm(干重)预处理的生物质(>85％全纤维素)，以获得1:106(Kg生物质/酶FPU)的底物:酶比率。在下一个一小时内逐渐添加200gm预处理的生物质，以获得1:105(Kg生物质/酶FPU)的底物:酶比率。在上述条件下使反应进行1小时。离心全部反应混合物，以从溶解的物料中分离出固体残渣，进一步经过膜过滤分离出糖和酶。再循环固体残渣和可溶性酶，并在下一个一小时内逐渐加入150g新鲜的生物质，以获得1:105(Kg生物质/酶FPU)的底物:酶比率。再次对全部反应混合物进行离心和膜过滤，以获得固体残渣和可溶性酶，可溶性酶再次在3个连续循环中再循环。溶解百分率的测定如以上实施例1所述。
表9：全纤维素的连续水解和酶再循环
实施例10
反应混合物的底物:酶比率
在1.5小时内分5次逐渐将300gm(干重)预处理的生物质(>80％全纤维素)添加至保持在50℃和pH5.0的不同底物:酶比率(1:102至1:107)的2L酶溶液。在上述条件下搅拌反应物1小时。全部反应混合物通过尼龙网过滤，以从溶解的物料中分离出固体残渣，进一步进行膜过滤(微滤+超滤)分离可溶性糖和酶。溶解百分率的测定如以上实施例1所述。下表显示％溶解度，下表显示可实现的％溶解：
表10：底物:酶比率对生物质溶解的作用
实施例11
酶重用于全纤维素溶解(>95％全纤维素)
在1.5小时内，向保持在50℃和pH5.0的2L酶溶液中分5次逐渐添加300gm(干重)预处理的生物质(>95％全纤维素)。在上述条件下将反应物搅拌1小时。全部反应混合物通过尼龙网过滤，以从溶解的物料中分离出固体残渣，进一步经过膜过滤(微滤+超滤)分离出可溶性糖和酶。膜过滤后回收的酶溶液与过滤后得到的固体残渣混合。现在将新的预处理的生物质份加入混合物，使固体载量为15％。上述操作方案重复5个循环。溶解百分率的测定如以上实施例1所述。下表显示各循环中可实现的％溶解：
表11：酶重用于生物质溶解
实施例12
可溶性酶再循环用于生物质溶解
在1.5小时内，分5次逐渐将450gm(干重)预处理的生物质(>85％全纤维素)添加至保持在50℃和pH 5.0下的2L酶溶液。在上述条件下搅拌反应物1小时。全部反应混合物通过尼龙网过滤，以从溶解的物料中分离出固体残渣，进一步经过膜过滤(微滤+超滤)分离出可溶性糖和酶。膜过滤后回收的酶溶液用新鲜的酸化缓冲液稀释到2L。现在将新的预处理的生物质份添加至酶溶液，使固体载量为15％。上述操作方案重复5个循环。溶解度百分率的测定如以上实施例1所述。下表显示各循环中可实现的％溶解：
表12：可溶性酶再循环用于生物质溶解
实施例13
通过改变酶浓度溶解纤维素(mg/g生物质)
在50℃温度和pH为5.0下对小麦秸秆进行碱处理后得到的干固体载量为15.0％的纤维素被用于反应。初始基料包含1000g水(pH为5)和37.5g纤维素。以300rpm搅拌反应物料。温度保持在50℃和pH值保持为5.0。加入该反应体系的酶是纤维素酶BTM(AdvancedEnzyme Technology Ltd.,Thane,India)，蛋白载量为4.625mg/g、11.56mg/g、18.5mg/g、27.75mg/g和46.25mg/g生物质。液化后，在1.0-1.5小时内，以5个进料份逐渐加入剩余的生物质，使固体载量增加到15％。通过糖测量方法(Ghose等人，Measurement of celluloseactivity.Pure and Applied Chemistry,59(2)257-268,1988)测定反应物料中的糖含量。释放的葡萄糖的量随酶含量增加而增加，如表13所示。
表13：不同酶浓度对纤维素溶解的影响

Claims (12)

1.一种从生物质生产可溶性糖的方法，所述方法包括：
a.在40-60℃范围的温度下，在反应容器中以范围在4至6的pH制备酶溶液；
b.将一批全纤维素％在70-100％范围且含水量在10-80％(w/w)范围的生物质添加至步骤(a)的所述酶溶液，同时保持pH值在4-6的范围且温度为40-60℃，以获得含有预定生物质:酶比例的初始反应混合物，其中所述初始反应混合物中的所述预定生物质:酶比例在1:104至l:106(kg生物质/酶FPU)的范围内；
c.在30-90分钟内如同步骤(b)反复分批添加剩余的生物质，以获得最终反应混合物中10-30％的固体载量，其中生物质:酶比例保持在1:103至1:105(kg生物质/酶FPU)的范围内；
d.使所述最终反应混合物补充反应5-120分钟，以获得生物质水解物，其中实现40-80％的生物质溶解；
e.分离来自步骤(d)的所述生物质水解物的固体-液体成分，以获得包括可溶性糖和可溶性酶的滤液，以及未水解生物质和吸附的酶的残渣；
f.将所述可溶性酶从所述滤液中存在的可溶性糖分离；和
g.将来自步骤(e)的所述残渣和来自步骤(f)的分离的所述可溶性酶再循环至步骤(b)，以保持生产可溶性糖用的所述预定的生物质:酶比例。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物质是选自但不限于包括以下的组的农产品：玉米芯、玉米秸秆、玉米纤维、玉米壳、锯末、小麦秸秆、甘蔗渣、柳枝稷、稻草秸秆和草；并经适当预处理，以富集全纤维素至>70％，使全纤维素可由酶反应处理。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶选自由纤维素酶、肽酶、脂肪酶、木质素酶、阿魏酸酯酶以及其它辅助酶组成的组，最优选纤维素酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在反应容器中以约2mg/g至约95mg/g生物质、最优选4.625-46.25mg/g生物质的蛋白载量制备所述酶溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其中将所述生物质最初地加入所述反应容器中，作为浓度在1-10％(w/v)范围的可混合浆料。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在0.5-1.5小时内稳定地添加二、三、四、五、六、七、九、十和十二个进料份的剩余的所述生物质，以使固体载量增加至少30％(w/v)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在0.5-1.0小时内，稳定地加入三到九个进料份的所述生物质，使固体载量增加至少15％(w/v)。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述最终生物质:酶比例在1:103至1:105的范围内(Kg生物质/酶FPU)。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物质水解物中的可溶性糖浓度为至少75g/L的总可溶性高浓度糖。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物质在0.5-2小时内转化为可溶性糖。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述可溶性糖包括多糖和单糖，最优选葡萄糖。
12.根据权利要求1所述的方法，其中获得的可溶性糖中最高的最终葡萄糖浓度在50至150g/L之间。
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