CN106102912A - 圆形提取器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于洗脱和来自固相的分析物的方法和系统。本发明还提供了一种用于将液体分析试剂混合物从固相转移到诸如微滴定板井的第二容器的方法和系统。本发明在诸如核酸、碳水化合物、蛋白质和肽的生物分子的操作中是有用的。特别地，本发明对于在等电聚焦凝胶中操作蛋白质和肽具有实用性。

Description

圆形提取器
技术领域
本发明涉及生物分子处理的领域，且具体涉及一种用于在固相上分离的生物分子的洗脱和转移的方法和系统。本发明提供了一种用于转移包括从固相到诸如微滴定板井(microtitre plate well)的容器的生物分子片段的洗脱液分析试剂混合物的方法和系统。
背景技术
为了允许确定生物分子(诸如蛋白质、肽或核酸)的特性和组成，生物分子首先通过酶或化学手段被切成片段。以蛋白质为例，常见的方法是使用在特定氨基酸残基处切割蛋白质的酶，一个典型的实例是赖氨酸或精氨酸残基之后水解蛋白质的胰蛋白酶。当胰蛋白酶在含有非常有限数量的蛋白质上进行消化时，有可能的是例如使用质谱分析法(MS)从消化所得的大量的肽确定该蛋白质的特性。施加到基质辅助激光解吸/电离(MALDI)MS目标的样品只允许含有有限数量的肽并且类似地电喷雾电离(ESI)MS仅能接受每单位时间内的有限数量的肽。样品通常是含有成千上万的蛋白质的非常复杂的混合物，蛋白质在其消化后可以很容易地对应于十万至一百万超过一百万的肽。因此，肽的严格分离需要在定性和定量之前进行。
在生物分子的识别和定量之前或平行于它们的识别和定量，生物分子的分离可以通过包括电泳和层析法的多种技术来实现。电泳是一种通常基于它们的尺寸和/或它们的电荷用于分离生物分子的技术。像等电聚焦(IEF)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的电泳技术通常比层析的替代品给出更好的分辨率和产量。高分辨率IEF(HiRIEF)基于其等电点(pI)使用固定pH梯度(IPG)条状物分离肽。第一步在IEF仪器中分离肽以及在第二步中，IPG条状物被移动到在液体中溶解肽的提取器，然后将液体移动到通过大多液相色谱法(LC)和MS仪器支撑的标准微板形式。当进行分离非常复杂的样品时，基于IEF和PAGE的组合的2-D电泳也是常用的方法。然而，电泳技术的缺点是它们是劳动集约的，经常需要手艺，并且很难实现自动化。
提出了一种针对解决与电泳技术相关缺点的方案是已经在WO 2006/1136296和WO2006/1136297中描述的肽提取器仪器。直井模(，straight well-former)安装在每个IPG条状物并且将肽从井模转移到微板。然而，用这种技术，仍需要一些操作。另外，用针头机器人传送的既定方式取决于一系列从安装有井模的凝胶条状物转移到微板的时耗。采用涉及使用手动吸液管或针头机器人的公知方法将肽从IPG条状物提取并转移到微板。通常有具有72片的2-8IPG胶条，每条胶条应通过添加液体的方式可进行溶解。添加和提取液应在几次内完成以优化样品的转移。样品需要在加入液体之后并且在液体中提出样品之前扩散一段时间。
因此，就需要一种用于从其上已经分离的固相提取和转移生物分子的较少劳动密集和耗时较少的方法。
发明内容
本发明描述了对于将在固相中的生物分子样品提取和转移到诸如微板的容器以用于诸如使用液相色谱法(LC)和MS仪器的进一步分析有用的系统和方法。具体地，本发明提供了一种用于从固相洗脱分析物的装置，其中样品可以并行处理，由此与公知方法相比提供了更少的劳动密集且更少的耗时的方法。
在一个方面，本发明提供了一种用于与装置(100)一起使用以用于从固相(8)洗脱分析物的井模(1)，其中所述井模(1)包括圆柱体(2)，圆柱体(2)具有上表面(3)、下表面(4)、周向表面(5)和多个腔室(6)，其中所述多个腔室(6)中的每一个限定所述上表面(3)、所述下表面(4)和所述周向表面(5)中的每一个上的开口，由此限定所述上表面(23)、所述下表面(24)和所述周向表面(25)中的每一个上的多个开口。
在所述井模(1)的一个实施例中，所述上表面(23)上的所述多个开口彼此之间以离圆柱体(2)的周向表面(5)相同的距离而定位。
在所述井模(1)的一个实施例中，所述下表面(24)上的所述多个开口彼此之间以离圆柱体(2)的周向表面(5)相同的距离而定位。
在所述井模(1)的一个实施例中，所述上表面(23)上的所述多个开口中的每一个与所述下表面(24)上的所述多个开口中的相应的一个直接覆盖配准。
在所述井模(1)的一个实施例中，所述周向表面(25)上的所述多个开口彼此之间以离圆柱体(2)的上表面(3)相同的距离而定位。
在所述井模(1)的一个实施例中，所述多个腔室(6)中的每一个限定延伸在所述上表面(3)、所述下表面(4)和所述周向表面(5)之间的T形。
在所述井模(1)的一个实施例中，还包括压缩环(7)，其与所述周向表面(5)上的所述多个开口覆盖配准地定位。
在所述井模(1)的一个实施例中，还包括所述固相(8)，其夹在所述压缩环(7)和所述周向表面(5)之间并且与所述周向表面(5)上的所述多个开口覆盖配准地定位。
在所述井模(1)的一个实施例中，所述固相(8)是电泳凝胶或印迹膜(blottingmembrane)。
在所述井模(1)的一个实施例中，所述固相(8)是条状物。
在所述井模(1)的一个实施例中，所述条状物为固定PH梯度(IPG)条状物。
在所述井模(1)的一个实施例中，所述圆柱体包括从所述上表面(3)延伸至所述下表面(4)的中央开口(9)。
在另一个方面，本发明提供了一种用于从固相(108)洗脱分析物的装置(100)，其中分析物已经沿所述固相(108)上的分离方向分离，其中所述装置(100)包括如前文所限定的井模(101)以及与所述井模(101)中的多个腔室(106)流体连通的多个液体分配通道(110)，其中所述多个液体分配通道(110)中的每一个限定邻近于所述多个腔室(106)中的一个的入口(111)和通过延伸于其间的通路(113)流体地连接至所述入口(111)的出口(112)。
在所述装置(100)的一个实施例中，所述多个液体分配通道(110)中的每一个从所述井模(101)的所述多个腔室(106)中的每一个向外延伸。
在所述装置(100)的一个实施例中，所述多个液体分配通道(110)中的每一个沿直线延伸，并且和所述多个液体分配通道(110)中的每一个彼此为相同的长度。
在所述装置(100)的一个实施例中，所述多个液体分配通道(110)通过复合箔堆(114)来限定。
在所述装置(100)的一个实施例中，所述复合箔堆(114)通过基底(115)而支撑。
在所述装置(100)的一个实施例中，所述多个液体分配通道(110)中每一个的所述出口(112)流体地连接至收集腔室(116)。
在所述装置(100)的一个实施例中，所述收集腔室(116)为微滴定板井。
在所述装置(100)的一个实施例中，所述微滴定板井被提供为微滴定板井(117)的可弯曲的行的一部分。
在所述装置(100)的一个实施例中，还包括杆头(118)，其与所述井模(101)的所述圆柱体(102)的所述上表面(103)覆盖配准地定位，其中所述杆头(118)包括多个杆(119)，其中的每一个经由所述井模(101)的所述上表面(123)上的所述多个开口中的每一个装配到所述井模(101)的所述多个腔室(106)中的一个，并且施加压力到所述多个腔室(106)内以有助于所述分析物的洗脱。
关于任何对应的特征，本发明的装置的进一步的实施例如关于本发明的井模在前文所限定的。
在另一方面，本发明提供了一种用于从固相(8)洗脱分析物的方法，其中所述分析物已经沿所述固相(8)中的分离方向分离，其中所述方法包括：
(i)提供如前文所限定的井模(1)；
(ii)将包括所述分离的分析物的所述固相(8)与所述井模(1)的所述圆柱体(2)的所述周向表面(5)上的所述多个开口覆盖配准地定位；
(iii)将压缩环(7)与所述固相(8)覆盖配准地定位，以便所述固相(8)夹在所述井模(1)的所述圆柱体(2)的所述周向表面(5)和所述压缩环(7)之间；
(iv)从所述固相(8)洗脱所述分析物。
在一个实施例中，本发明的方法还包括借助于将杆头(118)定位到所述井模(1)的所述圆柱体(2)的所述上表面(23)上的所述多个开口内而施加压力到所述多个腔室(6)，以有助于所述分析物的洗脱。
在本发明的方法的一个实施例中，所述洗脱步骤后面是沿着多个液体分配通道(110)转移所述洗脱分析物的另一个步骤(iv)。
在本发明的方法的一个实施例中，所述多个液体分配通道(110)中的每一个流体地连接至如前文所限定的收集腔室(116)，且其中所述方法还包括经由所述多个液体分配通道(110)将所述洗脱分析物从所述多个腔室转移到所述收集腔室(116)中。
关于任何对应的特征，本发明的方法的进一步的实施例如关于本发明的井模或装置在前文所限定的。
附图说明
图1示出了展示圆柱体细节的本发明的井模。
图2示出了更详细地展示圆柱体的某些特征并且还包括固相和压缩环的本发明的井模的剖视图。
图3示出了在图2中以横截面示出的井模的解构图。
图4示出了当固相已经放置到位时的本发明的井模。
图5示出其中固相和压缩环二者均已经放置到位的本发明的井模。
图6示出了本发明的装置，该装置包括用于在腔室上施加压力的杆头，在该腔室内，分析物从固相以及液体分配通道洗脱，以用于将洗脱的分析物从腔室转移到收集腔，该收集腔为微板井。
图7示出了微板井的可弯曲的条如何能够布置在本发明的装置中。
图8示出了微板井的可弯曲的条如何能够容易地装配成微板形式，从而允许直接转移到下一个处理阶段。
具体实施方式
图1示出了本发明示例性的井模(1)，示出了具有其上表面(3)、下表面(4)和周向(5)表面以及中央开口(9)的圆柱体(2)。多个腔室(6)不能完整地被看到，但是作为在周向表面(25)上的开口内而被表示。在表面中的每一个上的开口一直围绕圆柱体(2)以规则的间隔呈现。在该图中，指出了处于上表面(23)和周向表面上的开口中的三个。在该图中，处于下表面(4)上的开口是不可见的，但是与处于所述上表面(23)上的所述开口直接覆盖配准而定位，由此限定了在每种情况下从上表面(3)到下表面(4)的开口端的圆柱形通道，其另外包括至周向表面(5)的另一条通道，使得腔室(6)基本为T形。
图2示出了本发明的井模(1)的特写区段，其中以横截面示出了T形腔室(6)中的一个。另外，在图2中包括以夹在井模(1)的圆柱体(2)和压缩环(7)之间的条状物的形式的固相(8)。在这种布置中，可以认识到的是，压缩环(7)起到保持固相(8)就位以促进分析物的洗脱的作用。
出现在固相中的“分析物”为诸如蛋白质、肽或核酸的生物分子。在井模上处理之前，分析物已经沿着所述固相(8)上的分离方向分离。通常，分析物在被施加到用于分离的固相之前被裂解成片段。裂解可通过任何数量的公知的方法而进行，例如，对于DNA分子，使用DNA限制性核酸内切酶(或限制酶)，DNA可被切成较小的片段，对于蛋白质，可以使用将蛋白质切在特定的氨基酸残基上的酶，一个典型的实例为胰蛋白酶。在固相上可进行分离，其中固相是电泳凝胶或印迹膜。在一个实施例中，当定位在本发明的井模(1)时，包括所述分离的分析物的所述固相是条状物的形式。设想，无论固相是不是以条状物的形式存在，当进行分离时，例如，当条状物为固定pH梯度(IPG)条状物，或固相紧跟着分离被转换成条状物形状，即其中固相是随后被切成条状物的平面形式或平板形式。在平板切成条状物的情况下，需要当心以在处理期间确保固相不受其它生物分子的污染，例如，来自操作者，来自使用的仪器或来自环境。避免污染的方法是诸如在WHO“手册：实验室工作规范(GLP)：用于管制的非临床研究与发展的质量实践”(2009年，第二版)中所述的为本领域技术人员熟知的，可以在这个链接中找到该手册：http：//www.who.int/tdr/publications/documents/glp-handbook.pdf。
图3示出了在固相(8)和压缩环(7)放置到圆柱体(2)之前如在图2中示出的相同的元件。条状物连接(28)是可见的，其将该条状物转化成可以容易地放置在圆柱体(2)上的环。在操作中，条状物(8)在压缩环(7)之前放置到位，以便达到图2的布置。图4示出了仅仅具有固相(8)到位的圆柱体。图5示出了图2的井模如何将以其整体的形式观察。
图6示出了本发明的示例性装置(100)。本发明的示例性井模(101)放置于装置(100)的中央位置，并且位于通过基座(115)而被自身支撑的复合箔堆(114)的顶部。叠层箔(114)限定了一系列的液体分配通道(110)，其中三个液体分配通道(110)在图6中表示。这些液体分配通道(110)以规则的间隔布置，并且从井模(101)辐射出。每个液体分配通道(110)包括入口(111)和出口(112)，入口(111)邻近于所述井模(101)的所述多个腔室(106)中的一个，且出口(112)远离所述井模(101)，其中所述入口(111)和出口(112)通过延伸在其间的通道(113)流体地连接。利用这种布置，从固相(8)洗脱的分析物能够经由入口(111)中的一个经过腔室(106)并进入液体分配通道(110)，并由此沿着通道(113)以达到出口(112)，在该处，能够在合适的收集腔室(116)中收集洗脱的分析物。在图6中，收集腔室(116)是微滴定板井。通过借助于杆头(118)施加压力到每个腔室(106)而促进分析物从固相的洗脱，这在图6的装置(100)中的位置中示出。杆头(118)包括向下延伸到所述井模(101)的所述多个腔室(106)内的多个杆(119)。在图6中，杆(119)具有匹配腔室(106)的形状的圆柱形，使得杆(119)兼容地配合在其中。
图7提供了本发明的装置(100)的仰视图，其示出了位于基底(115)上部的复合箔堆(114)，并且示出了液体分配通道的多个出口(112)中的若干个。图7提供了微滴定板井(116)如何能够以可弯曲的行(117)的形式使用以附接到装置(100)的边缘的图示。便利地，微滴定板井的这些可弯曲的行(117)很容易从装置(100)分离，以形成微滴定板井的组，其能够通过将他们放置在合适的框架而构成标准微滴定板形式内。以这种方式，洗脱分析物可以通过各种适于接收微滴定板的公知的装置而能够容易地进行分析。
图8提供了微滴定板井的可弯曲的行(117)如何分离以及如何随后布置在框架(120)中以形成微滴定板的更详细的图示。在图8中，本发明的装置(100)的一半以横截面的形式显示，示出了各种特征的相对位置。
在一个实施例中，本发明的装置(100)是圆形的结构，用于接收包含到井模上的已分离的肽的IPG条状物。当肽已使用合适的洗脱剂溶解后，压力通过圆形转换板将溶解的肽推进到装置边沿(即，盘边缘)上的微滴定板井内。这些微滴定板井通过铰链连接并附接到转移板。完成转移后，微滴定板井能被分离并放入微滴定板框架中，给出与能够在LC-MS/MS仪器中进一步处理的标准微滴定板相同的微滴定板形式。优点是同时将肽提取到标准的微滴定板形式，从而与公知的针系统相比减少了转移时间。转移板和可折叠的微滴定板可被制成一次性的，其还极小化洗涤时间。
本发明的方法的洗脱步骤是借助于适当的缓冲液(buffer)进行的。适当的洗脱缓冲液可以是水中0-XX％的有机/无机酸或水中0-XX％的有机溶剂。酸的非限制性实例包括甲酸、乙酸、磷酸等；本领域技术人员将意识到其它的是适合的。有机溶剂的非限制性实例包括乙腈、甲醇、乙醇等；本领域技术人员将意识到其它的是适合的。对于百分比的酸，典型但非限制的浓度将达到0.1％。对于有机溶剂，典型但非限制的浓度将达到5.0％。以及对于高达5％的有机溶剂，但不是确切限制洗脱缓冲液一次或更多次地被添加到井模中的每个腔室中，使得分析物从固相洗脱并进入洗脱缓冲液。
在特定生物分子的评估中，通常感兴趣的是仅其子集使用例如LC-MS/MS应用以通过评估。因此，例如，选择并转移位于井模中的片段子集中的肽，获知每个片段的肽等电点(pI)范围是重要的。对于所感兴趣的肽的pI可以通过使用预测算法或事先实验数据库查找来确定。由于制造的原因，IPG条状物具有独特的pI梯度，为了确定每个片段范围，可以使用内部标准荧光标记。本发明因此可包括针对井模中自动检测荧光标记而自定义的检测器。目的是检测在其中定位具有公知PI的片段标记。标记的定量是不感兴趣的。检测原理几乎与荧光显微镜相同。
检测器可以使用标准的激光器来激发呈现在生物分子(例如，Cy5标记的肽)上的荧光标记。激光荧光清理过滤器是必要的，以防止激光中断来自荧光发射光谱的分布，其中检测将发生。在检测器的光路中，发射过滤器阻塞激光光谱，并允许通过荧光标记物发射光谱。检测器(可以是光电二极管、光电倍增管等)测量发射的光。
有三种传输光至或自样本的方法，1：激光-光纤(fibre)-样品-光纤-检测器，2：激光-光纤-样品-透镜-检测器，3：激光-样品-透镜-检测器。
对于方法1，检测器包移动到井模上的片段位置。激光可以通过光纤传输到井模片段，样品被激发并发射光，其通过光纤将光传输到发射滤光器，并且然后到聚焦透镜，然后到检测器来收集。一个缺点是到发射光滤波器的较高入射角，结果是具有降低的过滤器性能。在收集光纤之前，光收集透镜可能是必要的。
对于方法2，激光被传输到样品，如在方法1。发射的荧光团光需要使用透镜距样品以焦距距离而收集。光以平行光通过发射过滤器而被传输，并且最后通过将光线聚焦在检测器上的透镜。发射光角度通过井模而被限制，因此其在当收集光而不是使光纤直接被定位在上述样品以上时是重要的。
对于方法3，激光以特定角用于使光在井模壁上反射到达井模片段中的样品。如在方法2中检测光。分束器将激光在与也可以使用发射光的相同的光路反射到样品(与荧光显微镜原理一样)。

Claims (25)

1.一种用于与装置(100)一起使用以用于从固相(8)洗脱分析物的井模(1)，其中所述井模(1)包括圆柱体(2)，所述圆柱体(2)具有上表面(3)、下表面(4)、周向表面(5)和多个腔室(6)，其中所述多个腔室(6)中的每一个限定所述上表面(3)、所述下表面(4)和所述周向表面(5)中的每一个上的开口，由此限定所述上表面(23)、所述下表面(24)和所述周向表面(25)中的每一个上的多个开口。
2.根据权利要求1所述的井模(1)，其特征在于，所述上表面(23)上的所述多个开口彼此之间以离所述圆柱体(2)的所述周向表面(5)相同的距离而定位。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的井模(1)，其特征在于，所述下表面(24)上的所述多个开口彼此之间以离所述圆柱体(2)的所述周向表面(5)相同的距离而定位。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的井模(1)，其特征在于，所述上表面(23)上的所述多个开口中的每一个与所述下表面(24)上的所述多个开口中的相应的一个直接覆盖配准。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的井模(1)，其特征在于，所述周向表面(25)上的所述多个开口彼此之间以离所述圆柱体(2)的所述上表面(3)相同的距离而定位。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的井模(1)，其特征在于，所述多个腔室(6)中的每一个限定延伸在所述上表面(3)、所述下表面(4)和所述周向表面(5)之间的T形。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的井模(1)，其特征在于，还包括压缩环(7)，其与所述周向表面(5)上的所述多个开口覆盖配准地定位。
8.根据权利要求7所述的井模(1)，其特征在于，还包括所述固相(8)，其夹在所述压缩环(7)和所述周向表面(5)之间并且与所述周向表面(5)上的所述多个开口覆盖配准地定位。
9.根据权利要求1至8中的任一项所述的井模(1)，其特征在于，所述固相(8)是电泳凝胶或印迹膜。
10.根据权利要求1至9中的任一项所述的井模(1)，其特征在于，所述固相(8)是条状物。
11.根据权利要求10所述的井模(1)，其特征在于，所述条状物为固定PH梯度(IPG)条状物。
12.根据权利要求1至11中的任一项所述的井模(1)，其特征在于，所述圆柱体包括从所述上表面(3)延伸至所述下表面(4)的中央开口(9)。
13.一种用于从固相(108)洗脱分析物的装置(100)，其中所述分析物已经沿所述固相(108)上的分离方向分离，其中所述装置(100)包括如权利要求1至6中的任一项所限定的井模(101)以及与所述井模(101)中的多个腔室(106)流体连通的多个液体分配通道(110)，其中所述多个液体分配通道(110)中的每一个限定邻近于所述多个腔室(106)中的一个的入口(111)和通过延伸于其间的通路(113)流体地连接至所述入口(111)的出口(112)。
14.根据权利要求13所述的装置(100)，其特征在于，所述多个液体分配通道(110)中的每一个从所述井模(101)的所述多个腔室(106)中的每一个向外延伸。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的装置(100)，其特征在于，所述多个液体分配通道(110)中的每一个沿直线延伸，并且和所述多个液体分配通道(110)中的每一个彼此为相同的长度。
16.根据权利要求13至15中的任一项所述的装置(100)，其特征在于，所述多个液体分配通道(110)通过复合箔堆(114)来限定。
17.根据权利要求16所述的装置(100)，其特征在于，所述复合箔堆(114)通过基底(115)而支撑。
18.根据权利要求13至17中的任一项所述的装置(100)，其特征在于，所述多个液体分配通道(110)中的每一个的所述出口(112)流体地连接至收集腔室(116)。
19.根据权利要求18所述的装置(100)，其特征在于，所述收集腔室(116)为微滴定板井。
20.根据权利要求19所述的装置(100)，其特征在于，所述微滴定板井被提供为微滴定板井(117)的可弯曲的行的一部分。
21.根据权利要求13至20中的任一项所述的装置(100)，其特征在于，还包括杆头(118)，其与所述井模(101)的所述圆柱体(102)的所述上表面(103)覆盖配准地定位，其中所述杆头(118)包括多个杆(119)，其中的每一个经由所述井模(101)的所述上表面(123)上的所述多个开口中的一个装配到所述井模(101)的所述多个腔室(106)中的一个，并且施加压力到所述多个腔室(106)内以有助于所述分析物的洗脱。
22.一种用于从固相(8)洗脱分析物的方法，其中所述分析物已经沿所述固相(8)中的分离方向分离，其中所述方法包括：
(i)提供如权利要求1至6中的任一项所限定的井模(1)；
(ii)将所述固相(8)与所述井模(1)的所述圆柱体(2)的所述周向表面(5)上的所述多个开口覆盖配准地定位；
(iii)将压缩环(7)与所述固相(8)覆盖配准地定位，以便所述固相(8)夹在所述井模(1)的所述圆柱体(2)的所述周向表面(5)和所述压缩环(7)之间；
(iv)从所述固相(8)洗脱所述分析物。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，还包括借助于将杆头(118)定位到所述井模(1)的所述圆柱体(2)的所述上表面(23)上的所述多个开口内而施加压力到所述多个腔室(6)，以有助于所述分析物的洗脱。
24.根据权利要求22至24中的任一项所述的方法，其特征在于，所述方法的所述洗脱步骤后面是沿着多个液体分配通道(110)转移所述洗脱分析物的另一个步骤(iv)。
25.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述多个液体分配通道(110)中的每一个流体地连接至如权利要求18至20中的任一项所限定的收集腔室(116)，且其中所述方法还包括经由所述多个液体分配通道(110)将所述洗脱分析物从所述多个腔室转移到所述收集腔室(116)中。
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