CN106069940A - 一种石珊瑚室内有性繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种石珊瑚室内有性繁殖方法，S1：野外切片观察性腺成熟程度：在珊瑚性腺发育周期早期，通过组织学切片技术研究自然海区珊瑚性腺发育程度；S2:珊瑚的挑选、采集和运输：选取直径为15cm以上、生长健康、性腺发育成熟的珊瑚为对象，将单个珊瑚亲本装入多孔袋中浸水转移至培养池；S3：收集配子和受精：当珊瑚性腺准备排精排卵时，将珊瑚母株放置于受精桶内，待珊瑚排完卵子和精子，将珊瑚母株移出受精桶；S4：孵化：当受精率达到80%以上后，将受精卵转移至孵育缸里里进行孵育，当受精卵发育成浮浪幼虫，进入下一步幼虫底播；S5：珊瑚母株回归自然：将步骤S3移出的珊瑚母株送回原海区。

Description

一种石珊瑚室内有性繁殖方法

技术领域

本发明涉及珊瑚人工繁殖领域，具体涉及一种石珊瑚室内有性繁殖方法。

背景技术

珊瑚礁生态系统作为地球上最复杂、生物种类最丰富的海洋生态系统之一，为海洋提供着巨大的生产力资源和物种多样性，珊瑚生长在高于摄氏二十度的赤道及附近热带、亚热带地区，分布面积约二十八万平方公里，仅占全球海洋的百分之零点二，却是十亿以上人口赖以生存的生态系统。但人类活动诸如海洋捕捞业、水产增养殖业、港口建设、沿海城镇的工业废水和生活污水的排放，以及大面积滩涂围垦等已构成对珊瑚礁生物多样性及生态系统的严重威胁。研究人员发现，由于海水温度升高及其他因素作用，全球范围内的珊瑚礁系统正在遭到损害。澳大利亚研究理事会珊瑚礁研究中心的一份最新报告显示，大堡礁海岸约有93%的珊瑚礁出现白化。因此，很有必要通过人工手段对珊瑚进行人工繁育以加快珊瑚礁的修复工作。

珊瑚繁殖方式分为有性繁殖和无性繁殖两种。珊瑚的无性繁殖技术已经得到广泛的应用，这种简单经济的无性繁殖方式广泛被研究者、从业者以及珊瑚爱好者应用于软珊瑚和硬骨珊瑚的人工繁育，并获得了较高的存活。但是无性繁殖也存在一些缺陷，尤为重要的一点是：无性繁殖在扩展出一个种群后，这种繁殖方式并不能使得种群发生任何变化，即无性繁殖产生的所有生物体都相当于复制品，所以它们带有相同的遗传信息和亲代特征。只有在环境条件不变的情况下，无性繁殖系才能形成和维持一个健康的种群；然而，一旦环境中任何事物发生了变化，这个种群就会突然间面临危险。因为所有个体都是一样的，降临到其中一个细胞的任何灾难都可能危害到其他所有个体。相反，有性繁殖中产生的珊瑚幼虫能带着独特的基因进行扩散，这种独特的基因在生命周期中起至关重要的作用，它保证了群体的生存和进化，使得当环境发生改变时不会造成整个种群都面临危险。对于了解遗传结构和种群及其对种群动态的影响，以及群体对自然和人为干扰的适应能力，因此有性繁殖是必不可少的。

现有技术中，相对于无性繁殖技术的广泛应用，珊瑚的有性繁殖技术相对发展滞后。因此，仍需研究一种珊瑚的有性繁殖方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种石珊瑚室内有性繁殖方法，本发明提供的珊瑚的有性繁殖具有繁殖力强、受精率高，在全程监管下珊瑚受精卵的孵化率高，产出的浮浪幼虫具有活力高、健康的特征。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种石珊瑚室内有性繁殖方法，具体包括如下步骤：

S1：野外切片观察性腺成熟程度

在珊瑚性腺发育周期早期，通过组织学切片技术研究自然海区珊瑚性腺发育程度；

S2: 珊瑚的挑选、采集和运输

选取直径为15cm以上、生长健康、性腺发育成熟的珊瑚母株为对象，将单个珊瑚亲本装入多孔袋中浸水转移至培养池；

S3：收集配子和受精

当珊瑚性腺准备排精排卵时，将珊瑚母株放置于受精桶内，待珊瑚排完卵子和精子，将珊瑚母株移出受精桶；

S4：孵化

当受精率达到80%以上后，将受精卵转移至孵育缸里里进行孵育，当受精卵发育成浮浪幼虫，进入下一步幼虫底播；

S5：珊瑚母株回归自然

将步骤S3移出的珊瑚母株送回原海区。

石珊瑚分为雌雄同体、雌雄异体和假雌全异株，其中石珊瑚中绝大多数为雌雄同体，小部分是雌雄异体和假雌全异株。世界范围内许多珊瑚礁中，同一种属珊瑚或多种珊瑚在一年中的某个时间段内一次排放成千上万的配子。在珊瑚的有性繁殖方式中有两种繁殖策略，分别为孵育幼生型和排放配子型，本发明提供的方法主要应用于雌雄异体或雌雄同体排放配子型的珊瑚。

优选地，步骤S2中，每个培养池内雌雄同体珊瑚的数量为4～8株，或每个培养池内雌雄异体珊瑚的数量为8株以上。

优选地，所述珊瑚母株均源自不同海区的优势种类，遗传距离稍远而非近亲群体。

优选地，步骤S2中，采集回的珊瑚母株经暂养与消毒后再移至培养池。

优选地，步骤S2中，珊瑚母株于排卵前2～3周从海域采集回。

优选地，步骤S2中，所述培养池内的池水每天更换一次，换水量为30～50%海水。

优选地，所述海水直接从当地海区引入经砂滤沉淀、臭氧消毒、0.22微米滤膜过滤后经冷暖机调节稳定温度为25.5～26.5℃时再注入培养池中。

优选地，步骤S3中，将珊瑚母株移出受精桶后，每隔10min用干净的羽毛轻轻搅动海水。

优选地，步骤S3中，在珊瑚排精排卵30～60min之后开始收集配子。

优选地，所述步骤S4中，所述孵育缸内的海水通过冷暖机使得温度稳定在25～26℃之间，并且在孵育缸四周排放气石通气。

更为具体地，本发明提供的石珊瑚室内有性繁殖方法具体如下：

1、野外切片观察性腺成熟程度

在珊瑚性腺发育周期早期（2～3月份），通过组织学切片技术研究自然海区珊瑚性腺发育程度。将珊瑚样本中的珊瑚虫用10%福尔马林海水浸泡24小时后，将其在稀硫酸（含10%氯化氢）中进行解剖，直到骨骼溶解（中途需要进行更换稀硫酸溶液），之后保存在70%的酒精中。当卵母细胞小于300 µm时，珊瑚性腺样本每3～5天进行收集，直到卵母细胞在解剖的条件下可见。之后，样本每隔2天收集1次，收集得更加频繁，直到卵母细胞在样本中消失。卵母细胞几天后在样本中消失可有力地表明了繁殖活动开始了。

2、珊瑚的挑选、采集和运输

珊瑚排卵季节之前（4月～5月），选择生长健康、直径超过15 cm、无染病、无白化、个体完整、性腺发育成熟的珊瑚作为对象，珊瑚母株源自不同海区优势种类，遗传距离稍远从而避免近亲繁殖。通过标号挂牌标记，记录每株珊瑚的来源海区区位。通过漂浮篮将珊瑚从海底转移至岸上200 L水族箱，将每株珊瑚套上一个剪有水流交换洞的塑料薄膜袋，浸水转移至养殖基地生态馆养殖缸，整个转移过程尽量缩短珊瑚暴漏空气时间，保持水温变化小于2℃，同时采用气石曝气使水中溶氧达8%以上。每种雌雄同体珊瑚采集4～8株，每种雌雄异体珊瑚至少采集8株。

3、暂养与消毒

珊瑚排卵前2～3周从海域采集回的珊瑚暂养于暂养池内，暂养海水直接从珊瑚礁区引入经沙滤沉淀、臭氧消毒、0.22μm滤膜过滤后注入暂养池中。先用灭菌海水冲洗2～3min，再从低到高浓度浸泡于含Seachem(海化) Reef Dip专用消毒液，消毒液浓度依次为5ppm、10ppm、20ppm、40ppm和80ppm，分别浸泡30秒时间，再用无菌水冲洗1分钟，重复3次。

4、珊瑚母株培养

个体完整的珊瑚母株经消毒后被转移至培养池中，不同种类珊瑚分开不同培养池进行培养，池水每天更换一次，换水量30%～50%，海水直接从当地海区引入经沙滤沉淀、臭氧消毒、0.22μm滤膜过滤后经冷暖机调节稳定温度25.5～26.5℃注入培养池中。水处理维生系统循环水流速度2～4t/h，保持水体稳定。养殖池一侧配备两组造浪泵，间歇式运转造浪，模拟自然海区水环境。珊瑚养殖车间顶棚为透光材质，光照强度模拟自然环境，夜晚观察及操作过程使用弱光电灯或带红色滤膜的电灯，最大程度减少对珊瑚母株的刺激。

5、观察

根据组织学技术结合历史当地海域珊瑚排卵日期资料，并且在每个培养池安装3～5个摄像探头，在当月月圆前3天开始保持每天夜间观测。为防止珊瑚病害发生，当珊瑚发生白化或感染病菌，应及时隔离并且加大水更换效率。

5、收集配子和受精

在进行人工有性繁育之前用高锰酸钾对实验的容器和工具进行消毒，一旦发现某种珊瑚排卵发生，定位排卵珊瑚位置及珊瑚种类，同时简单记录排卵特征及配子颜色等。一旦群落开始产卵，精子和卵子将从珊瑚虫的口中释放出来。

对于雌雄同体或雌雄异体的品种来说，配子束通常是有浮力的，会慢慢地浮现在水面上。在收集配子之前，确定同一个池中所有群落都开始产卵了。在不同水箱中同样品种的珊瑚产卵通常是在15～30分钟内。一旦数个群落完成产卵活动，会形成配子包裹的浮油，其中包括精子和卵子，收集工作这时开始展开。

收集工作：在排卵30～60min之后开始收集配子，用一个干净的塑料杯子（烧杯或者碗）来收集。每个勺子中收集尽可能多的配子束，尽量减少海水的收集。用勺子的边缘放置在稍微低于水面来让配子束流入勺中。然后将配子束转移到一个5～20L的干净容器中（材质为塑料或者聚碳酸酯），装着干净灭菌过滤过的海水，容器的三分之一到一半水量最适合受精。或者 ：在排卵30～60min之后开始收集配子，具体操作：用烧杯轻舀漂浮在水面的卵子和精子，至少收集两个群落的配子是至关重要的，将卵子和精子加入一15L含灭菌海水玻璃钢桶里。或者在珊瑚大量排卵前将珊瑚置于干净海水中，待珊瑚排完卵子和精子之后将珊瑚移出玻璃钢桶。精卵采集完毕后每隔10min用羽毛轻轻进行搅拌混匀，使其充分受精，每隔10min进行镜检，直至镜检发现受精卵分裂，再将其移入200L的玻璃钢容器中进行胚胎孵化。受精过程中每隔15min同一方向用羽毛轻轻搅拌一会，防止胚胎粘附在容器壁上。同时，增加搅拌也可增加水面积，保持容器中溶解氧的水平。

使用生物显微镜及其数码分析系统对肉质扁脑珊瑚胚胎发育进行观察和拍照记录，从受精卵开始每隔30min对胚胎发育进行一次镜检，在精卵采集结束，受精2h进行计数，统计受精率。

6、孵化

当受精率达到80%以上之后，将受精卵转移至200～500L的孵育缸里，孵育缸内海水通过冷暖机使得温度稳定在25～26℃之间，并且在孵育缸四周排放气石通气，微微打出细小气泡，转移后2h内每20min取样5mL一次，镜检受精卵密度及状态。一旦产生圆球形胚胎后逐渐增加换气程度，直至伴随幼虫发育。期间补充新鲜海水以确保个体数量 300个/L左右。

7、珊瑚母株回归自然

在天气良好条件下，将珊瑚母株按原来运输方式移送回原海区标记的采集点。

8、幼虫底播

受精40～60h之后，珊瑚受精卵开始发育成早期浮浪幼虫，可用于自然海区底播。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明提供的石珊瑚室内有性繁殖方法与无性繁殖相比，采用不同区域遗传距离稍远的不同亲本，本方法繁殖出的珊瑚幼体具有高遗传多样性，可带来更高的基因多样性；

（2）本发明提供的方法应用范围广，珊瑚的有性繁殖具有繁殖力强，受精率高，在全程监管下，珊瑚受精卵的孵化率高，产出浮浪幼虫具有活力高，健康的特征；

（3）本发明提供的方法将繁殖后的珊瑚回归至自然海区，不损伤母体珊瑚,对珊瑚礁的无意伤害降至最低。

附图说明

图1为实施例1中将珊瑚移植珊瑚培养池示意图；

图2为实施例1中珊瑚排精的示意图；

图3为实施例1中的珊瑚开始配子束的示意图；

图4为实施例1中采集的受精卵的示意图；

图5为实施例1中采集的配子的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法：所使用原料、助剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场购买等商业途径得到的原料和助剂。

实施例1

本方法已于2014年在徐闻珊瑚礁自然保护区实施，珊瑚配子受精率为72.3%，受精卵的孵化率为18.5%，成功育出蜂巢珊瑚、滨珊瑚和盔形珊瑚等种类珊瑚共至少350万珊瑚浮浪幼虫。

具体过程如下：

2014年4月28日开始对自然海域珊瑚性腺进行切片观察，将珊瑚样本中的珊瑚虫用10%海水福尔马林浸泡24小时后，将其在稀硫酸（含10%氯化氢）中进行解剖，直到骨骼溶解（中途需要进行更换稀硫酸溶液），之后保存在70%的酒精中。当卵母细胞小于300 µm时，珊瑚性腺样本每3～5天进行收集，直到卵母细胞在解剖的条件下可见。之后，样本每隔2天收集1次，收集得更加频繁，直到卵母细胞在样本中消失。卵母细胞几天后在样本中消失可表明了繁殖活动开始了。5月3日珊瑚排卵之前，选择生长健康、直径超过15 cm、无染病、无白化、个体完整、性腺发育成熟的珊瑚作为对象，珊瑚母株源自不同海区优势种类，遗传距离稍远从而避免近亲繁殖。通过标号挂牌标记，记录每株珊瑚的来源海区区位。通过漂浮篮将珊瑚从海底转移至岸上200 L水族箱，将每株珊瑚套上一个剪有水流交换孔的塑料薄膜袋，浸水转移至养殖基地生态馆养殖缸，整个转移过程尽量缩短珊瑚暴漏空气时间，保持水温变化小于2℃，同时采用气石曝气使水中溶氧达8%以上。每种雌雄同体珊瑚采集6株，每种雌雄异体珊瑚采集12株。珊瑚排卵前从海域采集回的珊瑚暂养于暂养池内，暂养海水直接从珊瑚礁区引入经沙滤沉淀、臭氧消毒、0.22μm滤膜过滤后注入暂养池中。先用灭菌海水冲洗2～3min，再从低到高浓度浸泡于含Seachem(海化) Reef Dip专用消毒液，消毒液浓度依次为5ppm、10ppm、20ppm、40ppm和80ppm，分别浸泡30秒时间，再用无菌水冲洗1分钟，重复3次。个体完整的珊瑚母株经消毒后被转移至培养池（如图1）中，不同种类珊瑚分开不同培养池进行培养，池水每天更换一次，换水量30%-50%，海水直接从当地海区引入经沙滤沉淀、臭氧消毒、0.22μm滤膜过滤后经冷暖机调节稳定温度25.5～26.5℃注入培养池中。水处理维生系统循环水流速度2～4t/h，保持水体稳定。养殖池一侧配备两组造浪泵，间歇式运转造浪，模拟自然海区水环境。珊瑚养殖车间顶棚为透光材质，光照强度模拟自然环境，夜晚观察及操作过程使用弱光电灯或带红色滤膜的电灯，最大程度减少对珊瑚母株的刺激。5月15日夜间7点开始发现个别珊瑚排卵发生（图1和图2），等同种珊瑚全部排卵结束30～60分钟后，开始用干净烧杯分别收集一部分配子至一15L的塑料容器（如图3、4），里面盛有50%的灭菌干净过滤海水，从15L塑料容器取3个15ml样本在显微镜下进行计数，拍照并记录，补充新鲜海水确保桶内2～3个配子/mL左右的密度。所有收集了配子的容器均半浮于500L养殖水桶表面（养殖水桶水体温度控制在海域温度±1℃）后进行计数。配子混合后，配子束开始破裂后，水变浑浊或变白，有油状物质产生，此时每隔10min采用羽毛一个方向轻轻搅动，使配子均匀，维持30-60min，受精将发生； 2h内每20min取样5mL一次，检验受精情况，统计、拍照、存样。一旦产生圆球形胚胎后逐渐增加换气程度，直至伴随幼虫发育。受精发生后，每20h取样10mL，取样检验个体（受精卵, 胚胎 ，幼虫）数量，补充新鲜海水确保个体数量 300个/L左右。5月18日夜间23点将经过人工授精、胚胎发育过程培育得到的大量不同种类珊瑚幼虫移送至海区进行底播。

Claims (10)

1.一种石珊瑚室内有性繁殖方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1：野外切片观察性腺成熟程度

在珊瑚性腺发育周期早期，通过组织学切片技术研究自然海区珊瑚性腺发育程度；

S2:珊瑚的挑选、采集和运输

选取直径为15cm以上、生长健康、性腺发育成熟的珊瑚母株为对象，将单个珊瑚亲本装入多孔袋中浸水转移至培养池；

S3：收集配子和受精

当珊瑚性腺准备排精排卵时，将珊瑚母株放置于受精桶内，待珊瑚排完卵子和精子，将珊瑚母株移出受精桶；

S4：孵化

当受精率达到80%以上后，将受精卵转移至孵育缸里里进行孵育，当受精卵发育成浮浪幼虫，进入下一步幼虫底播；

S5：珊瑚母株回归自然

将步骤S3移出的珊瑚母株送回原海区。

2.根据权利要求1所述石珊瑚室内有性繁殖方法，其特征在于，步骤S2中，每个培养池内雌雄同体珊瑚的数量为4～8株，或每个培养池内雌雄异体珊瑚的数量为8株以上。

3.根据权利要求1所述石珊瑚室内有性繁殖方法，其特征在于，所述珊瑚母株均源自不同海区的优势种类，遗传距离稍远而非近亲群体。

4.根据权利要求1所述石珊瑚室内有性繁殖方法，其特征在于，步骤S2中，采集回的珊瑚母株经暂养与消毒后再移至培养池。

5.根据权利要求4所述石珊瑚室内有性繁殖方法，其特征在于，步骤S2中，珊瑚母株于排卵前2～3周从海域采集回。

6.根据权利要求1所述石珊瑚室内有性繁殖方法，其特征在于，步骤S2中，所述培养池内的池水每天更换一次，换水量为30～50%海水。

7.根据权利要求6所述石珊瑚室内有性繁殖方法，其特征在于，所述海水直接从当地海区引入经砂滤沉淀、臭氧消毒、0.22微米滤膜过滤后经冷暖机调节稳定温度为25.5～26.5℃时再注入培养池中。

8.根据权利要求1所述石珊瑚室内有性繁殖方法，其特征在于，步骤S3中，将珊瑚母株移出受精桶后，每隔10min用干净的羽毛轻轻搅动海水。

9.根据权利要求8所述石珊瑚室内有性繁殖方法，其特征在于，步骤S3中，在珊瑚排精排卵30～60min之后开始收集配子。

10.根据权利要求1所述石珊瑚室内有性繁殖方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述孵育缸内的海水通过冷暖机使得温度稳定在25～26℃之间，并且在孵育缸四周排放气石通气。