CN105379651A - 一种盐度驯化花鲈仔鱼的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种盐度驯化花鲈仔鱼的方法，属于水产养殖技术领域，本发明的盐度驯化花鲈仔鱼的方法是在第1-4天进行淡化养殖，第5-10天进行稳定培养；初始海水盐度为30，第1-4天，每日降低1-4个盐度；养殖条件为：温度16～20℃，日光灯控制光照强度为400～1000lux；第4日开始投喂经室外池塘培育的轮虫，密度保持在5～10个/mL，每日吸污并稳定培育至10d。本发明的盐度驯化花鲈仔鱼的方法能够提供花鲈的存活率，更加有利于花鲈生长，改善ATP酶活性和抗氧化酶活性，为花鲈早期阶段进行淡水养殖奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖技术领域，尤其涉及一种盐度驯化花鲈仔鱼的方法。
背景技术
花鲈(Lateolabraxmaculatus)隶属于硬骨鱼纲(Osteichsthyes)、鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、花鲈属(Lateolabrax)，又称白花鲈、鲈子鱼、板鲈、青鲈、七星鲈、鲈鱼、寨花。分布于中国和朝鲜沿海,是东北亚特有种。
鱼类胚胎和仔鱼发育阶段对盐度要求较高，当水体中的盐度超出胚胎发育的适宜盐度范围时，将导致胚胎发育异常、孵化率与成活率减低，畸形率升高，仔鱼生存活力下降(Kawahara等，1997)。当胚胎或仔鱼无法对盐度胁迫进行缓解时，将导致器官或组织的崩溃(Shi等，2008)。盐度的变化主要体现为水体比重、渗透压和离子组成的变化。
水体比重对鱼类胚胎、仔鱼的影响：
水体比重会影响卵的沉浮性，盐度较高时，受精卵漂浮在水层表面，可以增加与空气的接触，发育过程中排出的氨氮也能及时与下层水交换，为胚胎发育提供良好的水质条件；盐度较低时，受精卵容易沉底堆积成块，造成胚胎缺氧，且易受死亡胚胎的污染，造成孵化率降低和畸形率升高(王妍妍，2009)。同时盐度偏低会使正常发育的卵沉底与死卵混在一起，不利于生产中吸污操作。
盐度较低时，水体比重较低，初孵孵仔鱼进入浮游水层中开口摄食需要消耗大量能量游动，影响主动摄食，最终导致不能较好的完成内源性营养向外源性营养的转换。另外在开鳔期，低盐度也会影响仔鱼上浮到水面吞咽空气使鳔膨胀，导致鳔器官发育不良。
渗透压对鱼类胚胎、仔鱼的影响：
盐度对鱼类胚胎、仔鱼的影响的直接表现为打破鱼体内渗透压平衡。盐度太低或太高都会造成卵膜内外渗透压差的剧烈变化，当胚胎难以调节卵膜内外的渗透压平衡时，将导致发育中的胚胎细胞不能正常分裂，引起胚胎死亡或者仔鱼畸形，如出现分裂细胞融合、解体，胚盘收缩、仔鱼心包肿大、脊柱弯曲等(徐永江等，2005)。也有研究表明许多海水鱼类的受精卵能够在高于或低于自然海水盐度(30)的一定范围内保持其形态不发生改变。Helvik(1992)指出这主要是因为受精卵发育到神经胚期以后，卵黄栓关闭，与外界环境之间的物质交换降低，并且建立起较为完善的盐度调节系统。但当盐度变化范围超过卵膜的调节范围时，细胞与周围介质之间的物质平衡将被打破，卵细胞会发生损伤、破裂。盐度对于孵化期的影响因鱼类的不同而不同。
Potts等(1973)研究发现，外界水环境的高渗作用对鱼类的胚胎发育有一定的促进作用，能缩短受精卵的孵化时间。易祖盛等(1999)在尖鳍鲤(Cyprinusacutidorsalis)、黄永春等(2006)在鮸状黄姑鱼(Nibeamiichthioides)的研究中均发现受精卵的孵化时间随着盐度的升高而缩短。但是对于另外一些鱼类，盐度升高反而会减慢胚胎发育的速度。施兆鸿等(2008)在点带石斑鱼(Epinepheluscoioiaes)、强俊等(2009)在奥尼罗非鱼(0reochromisniloticus×0.aureus)、张寒野等(1998)在大银鱼(Protosalanxhyalocranius)的研究中均发现精卵的孵化时间随着随着盐度的增加逐渐延长。在适宜的盐度范围内，鱼类的胚胎孵化时间受到盐度的影响，但并不明显。
Johnson等(1986)认为初孵仔鱼的渗透压调节机制不完善，当环境盐度较低时，接近仔鱼的等渗点，仔鱼用于维持体内渗透压的稳定所消耗的能量减少，有利于仔鱼的生存；在高盐度水体中，仔鱼会因其渗透调节能力弱而大量失水，导致能量快速消耗，活动能力减弱，最终因为不能主动摄食而引起死亡率急剧上升(Tsukamoro等，1984)。Tytler等也认为渗透压调节耗能过多会使得初孵仔鱼内源性营养消耗严重而达到不可逆点。海水硬骨鱼初孵仔鱼体液中的盐度通常为12～l6，当环境盐度较低时，仔鱼用于维持体内渗透压的稳定而消耗的能量也减少，从而有利于仔鱼的生存(Tytler等，1988)
离子组成对鱼类胚胎、仔鱼的影响：
海水盐度变化往往造成海水中不同离子含量和比例的变化，而鱼类胚胎、仔鱼的发育均会受到水体中的离子成分的影响。Lee等认为鲻鱼(Mugilcephalus)的受精卵在没有Ca2+的人工海水中不能破膜；而在没有Mg2+的人工海水中能够发育到破膜阶段，但不能孵出仔鱼或孵出的仔鱼会立即死亡(Lee等，1983)。施兆鸿等在黑鲷(Sparusmacrocephalus)的研究中得到了相似的结论，即在没有Ca2+的海水中不能孵出仔鱼；在没有Mg2+的海水中仅能孵出少量崎形仔鱼；低K+对黑绸受精卵孵化没有明显影响，但对早期仔鱼影响显著(施兆鸿等，1995)。王广军等认为Ca2+/Mg2+比值对日本鳗鲡(Anguillajaponica)的受精卵孵化率有影响(王广军等，2002)。
Ca2+是控制细胞膜对其他离子和水渗透的一个重要离子，与跨膜转运相关，而且分布在血浆中的Ca2+(血钙)与成骨作用相关(王广军等，2002)。王波等(1996)认为水体中总硬度特别是Ca2+对鱼类的生长和生存有显著的影响，并证明了淡水和海水中的Ca2+严重影响眼斑拟石首鱼(Sciaenopocellatus)的生存。多种研究表明，Mg2+是新陈代谢过程中参与许多生化反应的辅酶；当细胞膜中参与物质主动运输的载体Na泵缺少Mg2+时，便不具有活力(王义强等，1990)，进而影响机体的正常生理功能。
房文红等(1999)报道了不同K+对大银鱼仔鱼存活率的影响。Forsberg等(1996)用地下咸水养殖美国红鱼(Sciaenopsocellatus)发现其存活率与地下咸水的Na+/k+比值显著负相关，同时和K+/Cl+比值正相关。
专利201410578949.X公开了一种花鲈无公害淡水人工养殖技术，包括如下内容：通过一系列措施改变花鲈生长条件：整理消毒淡化池、精选优质鱼苗并选用与鱼苗产地同浓度海水养殖、按一定浓度梯度逐步淡化海水、鱼糜饵料喂养、待幼鱼达到一定标准后转入成鱼方式养殖、并调节此过程中天气、水温、摄食等对花鲈生长的影响，使花鲈适应人工养殖环境，从而有效提高其产量和效益，获得优质无公害花鲈，推动花鲈养殖业的发展。
发明内容
本发明提供了一种盐度驯化花鲈仔鱼的方法。
本发明采用如下技术方案：
本发明的盐度驯化花鲈仔鱼的方法是在第1-4天进行淡化养殖，第5-10天进行稳定培养；初始海水盐度为30，第1-4天，每日降低1-4个盐度；养殖条件为：温度16～20℃，日光灯控制光照强度为400～1000lux；第4日开始投喂经室外池塘培育的轮虫，密度保持在5～10个/mL，每日吸污并稳定培育至10d。
淡化通过添加自来水完成。
每日降低2和4盐度，同时添加钙、镁离子浓度至海水浓度。
本发明的积极效果如下：
本发明的盐度驯化花鲈仔鱼的方法能够提供花鲈的存活率，更加有利于花鲈生长，改善ATP酶活性和抗氧化酶活性，为花鲈早期阶段进行淡水养殖奠定了基础。
附图说明
图1是不同盐度驯化下花鲈仔鱼的存活率图；
注：数值用平均值±标准误表示，标有不同字母的数值表示显著差异(P<0.05)，否则表示差异不显著(P＞0.05)。
图2是不同盐度驯化下0～4Dph(A)和4～10Dph(B)花鲈仔鱼的生长率图；
注：数值用平均值±标准误表示，标有不同字母的数值表示显著差异(P<0.05)，否则表示差异不显著(P＞0.05)。
图3是不同盐度驯化下花鲈仔鱼卵黄囊(A)和油球(B)的消耗图；
注：数值用平均值±标准误表示，标有不同字母的数值表示显著差异(P<0.05)，否则表示差异不显著(P＞0.05)。
图4是不同盐度驯化下4Dph内花鲈仔鱼的卵黄囊和油球的利用效率图；
注：数值用平均值±标准误表示，标有不同字母的数值表示显著差异(P<0.05)，否则表示差异不显著(P＞0.05)。
图5是不同盐度驯化下10dph花鲈仔鱼Na+、K+-ATP酶相对活性图；
注：数值用平均值±标准误表示，标有不同字母的数值表示显著差异(P<0.05)，否则表示差异不显著(P＞0.05)。
图6是不同盐度驯化下10dph花鲈仔鱼Ca2+、Mg2+-ATP酶相对活性图；
注：数值用平均值±标准误表示，标有不同字母的数值表示显著差异(P<0.05)，否则表示差异不显著(P＞0.05)。
图7是不同盐度驯化下10dph花鲈仔鱼过氧化氢酶相对活性图；
注：数值用平均值±标准误表示，标有不同字母的数值表示显著差异(P<0.05)，否则表示差异不显著(P＞0.05)。
图8是不同盐度驯化下10dph花鲈仔鱼超氧化物歧化酶相对活性图；
注：数值用平均值±标准误表示，标有不同字母的数值表示显著差异(P<0.05)，否则表示差异不显著(P＞0.05)。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例1
1实验材料
1.1受精卵孵化
实验用受精卵购于广东江门某水产养殖场，为福建沿海网箱养殖的亲鱼经室内暂养、人工催产和授精后得到。在水温16℃条件下，受精卵收集完毕并运至珠海市斗门区河口渔业研究所时处于原肠胚晚期。每个0.5m3孵化桶里孵化约20万粒受精卵，微充气，盐度30，加热棒控温15～18℃，经36h孵出。
1.2实验用水来源
实验用海水为珠海近海海水，通过运水车运至珠海市斗门区河口渔业研究所。淡水为珠海自来水厂供应的自来水。分别用CaCl2、MgCl2(分析纯)在自来水中添加钙、镁离子至海水的浓度以得到添加钙镁的自来水。用ATAGO手持式折光仪测定盐度，用EDTA络合滴定法测定钙、镁离子浓度，用火焰原子吸收光谱法测定钠、钾离子浓度，各实验用水离子浓度如(表1)。以上实验用水都经充分沉淀和曝气后用于盐度驯化或淡化实验。
表1实验用水离子浓度
2实验方法
2.1盐度驯化实验
本实验为降盐度驯化实验，1～4d进行淡化，5～10d稳定培养。设置降盐度梯度为每日降1、降2、降3、降4、降2补充钙镁(钙、镁离子浓度至海水浓度)、降4补充钙镁(钙、镁离子浓度至海水浓度)，对照组为海水，盐度30。每个处理组设置3个平行，7×3共21个水箱。
每处理组各选取200尾健康初孵仔鱼放入装有25L海水的水箱内。温度16～20℃，日光灯控制光照强度为400～1000lux，微充气。其中日降1、降2、降3、降4的处理组用自来水进行淡化；日降2补充钙镁、日降4补充钙镁的处理组用添加钙镁的自来水进行淡化。各处理组盐度变化如(表2)。第4日开始投喂经室外池塘培育的轮虫，密度保持在5～10个/mL，每日吸污并稳定培育至10d。每日吸除死亡仔鱼2次(以玻璃棒亲触无反应的为死亡)并计数，观察仔鱼分布状态。分别于0、2、4、10d每处理组采样15尾，用江南SE2200体视镜观察，并用图森IS500显微相机拍照后测量仔鱼全长、卵黄囊长径、卵黄囊短径、油球直径。第10d实验结束时每处理组各取样50～100尾，用蒸馏水洗净后投入液氮中保存备用。
表2各处理组的盐度变化
2.2指标测定
生长率＝(L1-L0)/T
公式中，L0为开始时测量(0d)的仔鱼全长，L1为结束时测量(4d)的仔鱼全长；T为开始到结束的天数。
卵黄囊体积和油球体积计算公式参照(Alderdice等，1979)的方法：
卵黄囊体积＝4/3·π·(r/2)2·R1/2
油球体积＝4/3·π·(R2/2)3
公式中，r为卵黄囊短径，R1为卵黄囊长径，R2为油球直径。
卵黄囊利用效率和油球利用效率计算公式参照(Rideout等，2004)的方法做出改良：
卵黄囊利用效率＝(L1-L0)/(Y0-Y1)
油球利用效率＝(L1-L0)/(O0-O1)
公式中，L0为开始时测量(0d)的仔鱼全长，L1为结束时测量(4d)的仔鱼全长；Y0为开始时测量(0d)的仔鱼卵黄囊体积，Y1为结束时测量(4d)的仔鱼卵黄囊体积；O0为开始时测量(0d)的仔鱼油球体积，O1为结束时测量(4d)的仔鱼油球体积。
10d龄的仔鱼样品采用全鱼整体匀浆的方法制备组织匀浆液，匀浆后取上清液备用。采用南京建成生物工程公司生产的试剂盒测定ATP酶、过氧化氢酶、抗氧化酶的活性。总蛋白含量依据Bradford(1976)的方法测定，用以计算ATP酶、过氧化氢酶、抗氧化酶的相对活性。
2.3数据分析
运用SPSS统计软件(19.0)对存活率、生长率、卵黄囊体积、油球体积、卵黄囊利用效率、油球利用效率、Na+、K+—ATPase相对活性、Ca2+、Mg2+—ATPase相对活性、过氧化氢酶相对活性、抗氧化酶相对活性进行ANOVA单因素方差分析，并进行DUNCAN多重比较，以P＜0.05为有显著性差异；所有数据用平均数±标准误表示(Mean±SEM)，最后用EXCEL2013作图。
3结果
3.1不同盐度驯化下花鲈仔鱼的分布状态
表3显示了实验过程中仔鱼在水层中的分布状态。4dhp前，仔鱼在不同盐度中的分布水层与受精卵在不同盐度中的分布水层相同，盐度驯化低于23的处理组，仔鱼沉底；4～5dph所有处理组的仔鱼都处于中层以上；6～10dph盐度低于18的处理组的仔鱼沉底，9dph后原处于上层水层的处理组也分布于中层水层。
表3不同盐度驯化下花鲈仔鱼的分布状态
注：上层为水体上部20％水层，底层为水体下部20％水层，中层为水体中部60％水层，根据70％以上仔鱼分布的区域界定其分布水层
3.2不同盐度驯化下花鲈仔鱼的存活率
不同梯度的盐度驯化对花鲈仔鱼的存活率有影响(图1)。4dph(淡化处理结束时)，各处理组的存活率没有显著性差异(P＞0.05)。10dph时各处理组的存活率随着降盐幅度的增大而降低，其中日降3、日降4、日降4补钙镁的存活率要比对照组低(P＜0.05)；在同一降盐度梯度中，补充钙、镁离子不影响仔鱼的存活率(P＞0.05)。
3.3不同盐度驯化下花鲈仔鱼的生长
不同梯度的盐度驯化对花鲈仔鱼的生长有影响(图2)。4dph内的日生长率，随着盐度的降低先增大后减小，在日降3组有最大值。日降4和日降4补充钙镁组与对照组没有显著性差异(P＞0.05)。
4～10dph的日生长率，随着盐度的降低先减小后增大，日降3有最小值(P＜0.05)。其中日降2(-.0042±.03001mm)、日降2补充钙镁(-.0019±.06067)、日降3(-.0136±.06340)出现了负生长。日降4和日降4补充钙镁有最大值(P＜0.05)。
3.4不同盐度驯化下花鲈仔鱼卵黄囊和油球的变化
不同梯度的盐度驯化对花鲈仔鱼卵黄囊消耗和油球消耗均没有显著性影响(P＞0.05，图3)。0～2dph仔鱼卵黄囊已完成大部分消耗，2～4dph仔鱼卵黄囊消耗速率相对降低(图3A)。2dph时仔鱼油球消耗了大约50％(图3B)，4dph后仔鱼油球体积变化速率相对降低，而油球颜色逐渐由鲜黄转为透明。
不同梯度的盐度驯化对花鲈仔鱼4dph内的油球利用效率和卵黄囊利用效率有显著性影响(P＜0.05，图4)。油球利用效率和卵黄囊利用效率变化规律相同，并且与4dph内的生长率有相同变化趋势，随着盐度的降低先增大后减小。
在日降3组，油球利用效率(43.58±2.50mm/mm3)和卵黄囊利用效率(0.91±0.05mm/mm3)有最大值；同一降盐度梯度中，补充钙、镁离子对油球利用效率和卵黄囊利用效率没有显著性影响(P＞0.05)。
3.5不同盐度驯化下花鲈仔鱼ATP酶的活性
不同梯度的盐度驯化对10dph花鲈仔鱼的Na+、K+-ATPase相对活性有影响(图5)。各正常降盐度组与对照组相比，10dph仔鱼的Na+、K+-ATPase相对活性没有显著性差异(P＞0.05)。补充了钙、镁离子的处理组Na+、K+-ATPase酶活性与对照组相比出现了显著性增大，并随着补充钙、镁离子量的增加而增大。
不同梯度的盐度驯化对10dph花鲈仔鱼的Ca2+、Mg2+-ATPase相对活性有影响(图6)。日降4和日降4补充钙镁组的Ca2+、Mg2+-ATPase相对活性与对照组相比出现了显著性增大(P＜0.05)，并且补充钙镁组要高于未补充钙镁组。
3.6不同盐度驯化下花鲈仔鱼抗氧化酶的活性
不同梯度的盐度驯化对10dph花鲈仔鱼的过氧化氢酶相对活性有影响(图7)。日降4、日降2补充钙镁和日降4补充钙镁的CAT酶相对活性显著高于对照组(P＜0.05)。同一降盐度梯度中，补充钙、镁离子的处理组CAT相对活性要高于未补充的；但日降4的盐度组中，CAT相对活性在统计上并没有显著性差异(P＞0.05)。
不同梯度的盐度驯化对10dph花鲈仔鱼的抗氧化酶相对活性有影响(图8)。日降4和日渐4补充钙镁组SOD活性显著高于对照组(P＜0.05)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种盐度驯化花鲈仔鱼的方法，其特征在于：所述的方法是在第1-4天进行淡化养殖，第5-10天进行稳定培养；初始海水盐度为30，第1-4天，每日降低1-4个盐度；养殖条件为：温度16～20℃，日光灯控制光照强度为400～1000lux；第4日开始投喂经室外池塘培育的轮虫，密度保持在5～10个/mL，每日吸污并稳定培育至10d。
2.如权利要求1所述的盐度驯化花鲈仔鱼的方法，其特征在于：淡化通过添加自来水完成。
3.如权利要求1所述的盐度驯化花鲈仔鱼的方法，其特征在于：每日降低2和4盐度，同时添加钙、镁离子浓度至海水浓度。
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