CN106061491A

CN106061491A - 细菌通过模拟Alpha‑MSH的CLPB蛋白对食欲调节的影响

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Publication number: CN106061491A
Application number: CN201480066463.6A
Authority: CN
Inventors: 谢尔盖·费特苏; 艾曼纽乐·德; 纳欧·特诺尼; 乔纳森·布里顿; 菲利普·陈-特池-松; 皮埃尔·德彻乐特; 罗曼·勒格朗
Original assignee: Rouen University Medical Center; Rouen, University of; National Medical And Health Research Institute
Current assignee: Rouen University Medical Center; Rouen, University of; National Medical And Health Research Institute
Priority date: 2013-12-05
Filing date: 2014-12-04
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2034-12-04
Also published as: EP3076985A1; JP2017503768A; JP2019089815A; CN106061491B; EP3076985B1; KR102332078B1; JP6876732B2; US20160313348A1; WO2015082633A1; CA2932488A1; KR20160101944A

Abstract

本发明涉及细菌Clp B蛋白和表达Clp B的细菌以及它们对饮食障碍的影响。本发明还涉及包含针对至少一种表达Clp B之细菌的抗生素的组合物和包含不表达Clp B蛋白的益生菌的组合物以及它们在治疗或预防饮食障碍中的用途。本发明还涉及用于测定对象是否可能应答于饮食障碍治疗方法或针对饮食障碍的免疫方法的诊断工具。

Description

细菌通过模拟Alpha-MSH的CLPB蛋白对食欲调节的影响

本发明涉及细菌ClpB蛋白和表达ClpB的细菌以及它们对饮食障碍的影响。本发明还涉及包含针对至少一种表达ClpB之细菌的抗生素的组合物和包含不表达ClpB蛋白的益生菌的组合物以及它们在治疗或预防饮食障碍中的用途。本发明还涉及用于测定对象是否有可能应答于饮食障碍治疗方法或针对饮食障碍的免疫方法的诊断工具。

在过去的50年间，饮食障碍在世界范围内在男性和女性中间均有增长。有证据表明，西方国家的人尤其具有发生饮食障碍的最高风险，并且西方化程度增加该风险。随着最近的进展，科学家对食欲的中枢处理了解得越来越多。已知饮食行为涉及诱导的、自我平衡的和自我调节的控制过程之间的相互作用，这是饮食障碍的关键因素。

近期的科学研究发现了另一个调节子，人微生物组(microbiome)。高通量DNA测序技术的进展使得能够进行对人微生物组的探索，从而向理解宿主与其微生物群之间的分子关系迈进一大步。在该“第二基因组”(微生物组)中描述了超过4-5百万个的无冗余微生物推定基因和1至2000个普遍微生物物种的类别。每个个体具有至少160个共有物种，多个良好平衡的宿主-微生物分子关系限定个体的类群。

认为理解微生物群体与其人宿主之间的共生关系的基本特征可允许从内在群体的具体特征预测宿主表型，例如健康状态。

例如，肠微生物群的构成已经与包括肥胖、糖尿病和一些神经精神障碍在内的宿主代谢表型相关联，这提示肠细菌可影响由脑控制的功能和行为。

在这种背景下，确定将微生物群与宿主行为相联系的分子机制因而成为确定特定微生物在宿主生理中的作用的必要步骤。

引起饮食障碍包括神经性厌食症(AN)、神经性贪食症(BN)和暴食症(BED)的分子机制目前未知。之前的数据暗示，与α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)有反应性的免疫球蛋白(Ig)或自身抗体(auto-Ab)参与调节进食和情绪；然而，这种自身抗体的起源未知。

本发明人使用蛋白质组发现，共生肠细菌E.Coli K12的ClpB伴侣蛋白是参与能量代谢和情绪调节的一种神经肽α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)的构象模拟物。

本发明人证明，经ClpB免疫的小鼠产生与α-MSH交叉反应的抗-ClpB IgG，影响食物摄取、体重、焦虑和黑皮质素受体4信号转导。此外，本发明人证明，在小鼠中长期经胃递送E.coli降低食物摄取并刺激ClpB反应性和α-MSH反应性抗体形成，而ClpB缺陷型E.coli不影响食物摄取或抗体水平。最后，本发明人证明，与α-MSH交叉反应的抗ClpB IgG的血浆水平在患有AN、BN和BED的患者中增加，以及饮食障碍患者中的ED(饮食障碍)量表-2评分与抗ClpB IgG和IgM相关。

因此，本发明人证明，在若干共生和病原性微生物中存在的细菌ClpB蛋白可负责产生与α-MSH有交叉反应性的自身抗体，与患有饮食障碍的人中的进食和情绪改变相关。

此外，本发明人证明，患有饮食障碍的患者中ClpB蛋白的血浆浓度升高。

因此，ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的存在可以与饮食障碍以及食欲和情绪失调相联系。

已经将ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的存在与饮食障碍和食欲失调相关联，从而降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平可导致对食欲的调节，并因此被用作对饮食障碍的疗法。

因此，本发明涉及包含针对至少一种表达ClpB的细菌的至少一种抗生素的组合物，其用于治疗或预防饮食障碍。

本发明还涉及调节对象的食欲的非治疗方法，其包括向所述对象施用有效量的组合物，所述组合物包含针对至少一种表达ClpB的细菌的至少一种抗生素。

因此，本发明涉及包含不表达ClpB蛋白的益生菌的组合物，其用于治疗或预防饮食障碍。

本发明还涉及调节对象的食欲的非治疗方法，其包括向所述对象施用有效量的包含不表达ClpB的益生菌的组合物。

本发明还涉及作为疫苗或免疫原性组合物使用的包含ClpB蛋白的组合物。

特别地，所使用的组合物用于针对饮食障碍进行免疫。

特别地，所使用的组合物用于预防饮食障碍。

本发明还涉及用于诊断对象中的饮食障碍的体外方法，所述方法包括：

a)测量来自所述对象的生物样品中ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平；

b)将测量的所述ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平与参考值相比较；以及

c)从中推断所述对象是否患有饮食障碍。

本发明还涉及将患有饮食障碍的对象选择为对降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体水平的治疗有应答可能性的体外方法，其包括：

c)选择用于降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体水平的治疗的对象，其中所述降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体水平的治疗包括：向所述对象施用有效量的包含针对至少一种表达ClpB的细菌的一种抗生素的组合物，和/或向所述对象施用有效量的包含不表达ClpB的益生菌的组合物，和/或其组合。

本发明人已经证实，在小鼠中经胃递送E.coli由于细菌中ClpB蛋白的存在降低了食物摄取和体重增加，本发明还涉及用于治疗或预防肥胖症的包含超表达(surexpress)ClpB蛋白的益生菌的组合物。

发明详述

本发明人使用蛋白质组发现，共生肠细菌E.Coli K12的ClpB伴侣蛋白是参与能量代谢和情绪调节的一种神经肽α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)的构象模拟物，并且表达ClpB的细菌的存在导致食欲失调。

本文中所用的“表达ClpB的细菌”是指表达伴侣蛋白ClpB的细菌。

“蛋白解聚伴侣蛋白”、“伴侣蛋白ClpB”、“ClpB蛋白”或“ClpB”也被称为热休克蛋白F84.1，其是六聚AAA+-ATP酶的HSp100/ClpB家族的成员。该家族包括细菌、真菌和植物Hsp100ATP酶，其中ClpB为细菌中的代表。作为压力诱导的多伴侣蛋白系统的一部分，其参与细胞从热诱导损伤中的恢复，在蛋白质解聚中与Hsp70系统(DnaK、DnaJ和GrpE)协作，其中蛋白质解聚为对于细胞在压力条件下存活很关键的过程。

在感染过程中，细菌病原体遭遇由旨在清除它们的宿主防御所产生的压力条件，并通过增加热休克和其他压力蛋白的合成来应答这种宿主防御。对此，已经将ClpB描述为对获得的热耐受和对若干革兰氏阴性和革兰氏阳性病原菌例如Staphylococcus aureus、Francisella turalensis、Listeria monocytogenes、Yersinia enterocolitica和Salmonella thyphimurium的毒力和感染性重要的因子。

在E.coli K12中，伴侣蛋白ClpB也被称为热休克蛋白F84.1或htpM，是857个氨基酸的蛋白质。

通常，伴侣蛋白ClpB包含具有SEQ ID NO：1(NCBI参考号:NP_417083.1，如2013年11月6日可得的，和/或UniProtKB/Swiss-Prot号：P63284，如2013年11月6日可得的)的来自E.coli K12的伴侣蛋白ClpB的氨基酸序列或由该序列组成。优选地，伴侣蛋白ClpB的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列80至100％相同的氨基酸序列或者由这样的氨基酸序列组成。优选地，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列90至100％相同，更优选95至100％、最优选95、96、97、98、99或100％相同。

因此，表达ClpB的细菌涉及表达或过表达以上所限定的伴侣蛋白ClpB或以下多肽的细菌，所述多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列80至100％相同，更优选与SEQ ID NO：1的氨基酸序列95至100％、最优选95、96、97、98、99或100％相同的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。

具有与本发明的查询氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽是指，除了所述多肽序列可包含每100个查询氨基酸序列的氨基酸至多5个氨基酸改变外，所述多肽的氨基酸序列与查询序列相同。换言之，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，所述序列中的至多5％(100中5个)的氨基酸残基可以被插入、缺失或者被另一氨基酸替换。

在本发明的上下文中，同一性百分比使用全局比对计算(即，两个序列在它们的全长上进行比较)。用于比较两个或更多个序列的同一性的方法是本领域公知的。例如可以使用“needle”程序，其使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman和Wunsch,1970J.Mol.Biol.48:443-453)来寻找两个序列的在考虑它们全长时的最优比对(包括缺口)。needle程序例如可从ebi.ac.uk因特网网址获得。根据本发明的同一性百分比优选使用EMBOSS::needle(全局)程序计算，其中“缺口开放”参数等于10.0，“缺口延伸”参数等于0.5，并使用Blosum62矩阵。

与参照序列相比，由与参照序列“至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同”的氨基酸序列组成的蛋白质可以包含突变，例如缺失、插入和/或替换。在替换的情况下，由与参照序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成的蛋白质可对应于源自于与参照序列所源自的物种不同的另一物种的同源序列。氨基酸替换可以是保守的或非保守的。优选地，替换是保守替换，其中一个氨基酸被具有相似结构和/或化学特性的另一氨基酸替换。替换优选对应于下表所示的保守替换。

保守替换	氨基酸类型
		Ala,Val,Leu,Ile,Met,Pro,Phe,Trp	具有脂肪族疏水侧链的氨基酸
Ser,Tyr,Asn,Gln,Cys	具有不带电但极性侧链的氨基酸
		Asp,Glu	具有酸性侧链的氨基酸
Lys,Arg,His	具有碱性侧链的氨基酸
		Gly	中性侧链

表达ClpB的细菌是技术人员公知的并且可以通过任何常规技术鉴定。

在一个实施方案中，表达ClpB的细菌选自由以下构成的组：Staphylococcusaureus、Francisella turalensis、Listeria monocytogenes、Yersinia enterocolitica、Salmonella thyphimurium、Escherichia Coli、Enterobacteriaceae、Shigella sonnei、Shigella flexneri、Shigella dysenteriae、Shigella boydii、Citrobacter youngae、Salmonella bongori和Salmonella enterica属。

ClpB蛋白包含两个核苷酸结合结构域(ATP1和ATP2)和两个寡聚化结构域(NBD1和NBD2)。N端结构域可作为底物区分结构域行使功能，将聚集的蛋白质募集到ClpB六聚体和/或稳定结合的蛋白。NBD2结构域负责寡聚化，而NBD1结构域稳定六聚体，该稳定可能以ATP依赖的方式进行。在功能性六聚体中通过相邻ClpB亚基的卷曲基序结合的卷曲结构域的运动对于ClpB将蛋白质从聚集状态释放的能力是关键的，其可能是通过将大的聚集蛋白质拉开。

本发明人证实，共生肠细菌E.Coli K12的ClpB伴侣蛋白是参与能量代谢和情绪调节的一种神经肽α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)的构象模拟物。

“α-MSH”也称为“α-黑素细胞刺激激素”、“alpha-MSH”、“α-MSH”、α-促黑素、α-黑皮质素或α-中叶素，其是黑皮质素家族的天然内源肽激素，具有十三肽结构。α-MSH的氨基酸序列优选地包含氨基酸序列SYSMEHFRWGKPV(SEQ ID NO：3)(Gen Pept序列ID，PRF:223274，如2013年12月2日可得的)或由该序列组成。然而，存在乙酰状态不同的三种α-黑素细胞刺激激素：无乙酰α-MSH，其缺乏乙酰基团；单乙酰α-MSH，其中SEQ ID NO：3的Ser-1的氨基被乙酰化；以及二乙酰α-MSH，其中SEQ ID NO：3的Ser-1的氨基和羟基二者均被乙酰化。本文使用的α-MSH特别指单乙酰α-MSH。

α-MSH关键性地参与能量平衡的调节并通过激活黑皮质素4型受体(MC4R)增加能量消耗，其在中枢和外周均起作用。在人和小鼠中，血浆α-MSH水平与体重改变相关。此外，α-MSH通过提升焦虑来调节心境和情绪。

“模拟物”指的是模拟另一蛋白质的蛋白质。该模拟由于蛋白质与其所模拟的蛋白质共有特定特性而成为可能。

“构象模拟物”指的是蛋白质与另一蛋白质共有至少部分的相同构象。

本发明人证实，ClpB蛋白在SEQ ID NO：1的第542至548位氨基酸与α-MSH有不连续序列同源性，为氨基酸序列“RWTGIPV”(以SEQ ID NO：2表示)。不受理论的束缚，这种ClpB的构象使得能够刺激针对ClpB和α-MSH二者的抗体的产生。

因此，本文的“构象模拟物”优选指的是能够刺激针对ClpB的抗体的产生以及针对α-MSH的自身抗体的产生。

“针对至少一种表达ClpB的细菌的抗生素”指的是抑制表达ClpB的细菌的生长和/或降低表达ClpB的细菌的量和/或破坏表达ClpB的细菌的抗微生物化合物。

优选地，针对至少一种表达ClpB的细菌的抗生素选择性地或优先地抑制表达ClpB的细菌的生长、降低表达ClpB的细菌的量和/或破坏表达ClpB的细菌。所述抗生素优选地不对真核细胞造成不利影响。

特异性靶向表达ClpB的细胞的抗生素是技术人员公知的，并且在Martin,I等人(Journal of Medicinal Chemistry,2013,56:7177-7189)中进一步描述。

针对至少一种表达ClpB的细菌的抗生素可以与ClpB结合并调节其活性。

特别地，针对至少一种表达ClpB的细菌的抗生素调节：

i)ClpB的ATP酶活性，和/或

ii)抑制ClpB的游离形式和/或底物结合形式，和/或

iii)抑制ClpB的激活。

在一个实施方案中，针对至少一种表达ClpB的细菌的抗生素是苄基苯骨架上的水杨醛衍生物，特别地，5-(2-氯苄基)-2-羟基-3-硝基苯甲醛(CAS号292644-32-7，SigmaAldrich)或(2-{[(3,4-二氯苯基)氨基]硫代甲基硫代}乙氧基)-N-苯酰胺(供应商号ST034398，TimTec)。

本发明的针对至少一种表达ClpB的细菌的抗生素的通常剂量可以为例如在约0.01mg/kg至约30mg/kg的范围内；然而，预想到了在该示例性范围之下或之上的剂量，尤其是考虑到上述因素。口服日剂量方案可以是约0.01mg/kg至约30mg/kg总体重，特别是0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30mg/kg体重。可以通过定期评估来监控患者的进展，并据此调节剂量。

在本发明的上下文中，本文所用术语“治疗”指的是逆转、减轻、抑制使用该术语的障碍或这种障碍或病症的一种或更多种症状的进展。

“预防”指的是为了防止使用该术语的障碍发生或者在障碍的早期阶段采取的措施。预防还指抑制使用该术语的障碍进一步发展。

治疗或预防饮食障碍在本文中优选地指在待治疗对象中降低表达ClpB细菌的量或浓度。

在本发明的上下文中，“对象”指的是人或非人哺乳动物，例如啮齿动物(大鼠、小鼠、兔)、灵长动物(黑猩猩)、猫科动物(猫)或犬科动物(狗)。优选地，所述对象是人。根据本发明的对象可以特别地为雄性或雌性。

优选地，根据本发明的对象超过13岁。

优选地，所述对象是雌性。

“饮食障碍”指的是根据第5版精神障碍诊断和统计手册(Diagnostic andStatistical Manual of Mental Disorders 5^th Edition,DSM-5)和更早版本(DSM-4等)的标准定义的精神病学疾病。异常的饮食习惯可涉及有害于个体的生理和精神健康的食物摄取不足或过度。神经性贪食症(BN)、神经性厌食症(AN)和暴食症(BED)是最常见的饮食障碍的具体形式。根据DSM-5标准，诊断为患有神经性厌食症的人必须表现出：持续限制能量摄取导致显著的低体重(比照根据年龄、性别、发育轨迹和身体健康预期的最低体重)，对增重或变胖的强烈惧怕，或影响体重增加(即便在显著的低体重的情况下)的持续行为，对体重或体型的感知方式的异常，体型或体重对自我评价的过度影响，或者对现有低体重的严重性持续缺乏认知。

根据DSM-5标准，诊断为神经性贪食症的人必须表现出暴食的重复发作。暴食发作的特征为以下二者：在分离的时间段(例如在任何2小时时间段中)中进食明显高于大部分人在相似时间段和相似情况下会进食的食物量和在发作期间对进食缺乏控制的感觉(例如，不能停止进食或不能控制吃什么或吃多少的感觉)，为了防止体重增加的重复的不适当的补偿行为，例如自诱的呕吐，滥用泻药、利尿剂或其他药物，禁食或过度锻炼。暴食和不适当的补偿行为平均均每周发生至少一次，持续三个月。自我评价被体型和体重过度影响。

根据DSM-5标准，诊断为暴食症的人必须表现出暴食的重复发作。暴食发作的特征为以下二者：在分离的时间段(例如在任何2小时时间段中)中进食明显高于大部分人在相似时间段和相似情况下会进食的食物量，在发作期间对进食缺乏控制的感觉(例如，不能停止进食或不能控制吃什么或吃多少的感觉)。暴食发作伴随以下的三种或更多种情况：

-进食比正常的快得多；

-进食直至感觉撑得不舒服；

-在身体未感觉饥饿时进食大量食物；

-之后感觉自我厌弃、抑郁或非常愧疚。

暴食平均每周发生至少一次，持续三个月。

其他类型的饮食障碍包括其他特异性喂食或饮食障碍(OSFED)。

根据DSM-5标准，诊断为OSFED的人必须表现出这样的喂食或进食行为，其导致临床显著的苦恼和机能方面的损伤，但不满足任何其他喂食和进食障碍的全部标准。然后可进行诊断以具体给出病情为何不满足另一疾病的特征的具体原因(例如，神经性贪食症-低频率)。以下为OSFED的另一些实例：

-非典型神经性厌食症：除了尽管有显著的体重减轻但个体的重量在正常范围之内或之上外，满足所有标准；

-暴食症(低频率和/或有限的持续时间)：除了较低的频率和/或短于三个月之外，满足BED的所有标准；

-神经性贪食症(低频率和/或有限的持续时间)：除了暴食和不适当的补偿行为以较低频率发生和/或发生短于三个月，满足神经性贪食症的所有标准；

-清除异常(purging disorder)：在没有暴食的情况下为了影响体重或体型的重复清除行为；

-夜食综合征：夜食、从睡眠中醒过来后进食或晚餐后过度摄取食物的重复发作。行为并不能被环境影响或社会标准更好地解释。行为导致显著的苦恼/损伤。行为不能被另一精神健康疾病更好地解释(例如，BED)；非特异性喂食或进食障碍(UFED)。根据DSM-5标准，该类别用于行为导致临床上显著的苦恼/机能损伤，但不满足任何喂食或进食障碍标准的全部标准的情况。在临床医师选择不具体确定为何未满足标准的情况下，临床医师可以使用该类别，包括可能没有进行更确定的诊断所需的足够信息的病情(例如在急诊室的情况下)。

在本发明的上下文中，进食障碍选自由以下组成的组：神经性厌食症(AN)、神经性贪食症(BN)、暴食症(BED)、过度饮食(overeating)、食欲过剩(hyperphagia)、消耗性疾病例如恶病质(cachexia)。

“食欲”是指食用食物的期望，感觉上表现为饥饿。食欲在所有高等生命形式中存在，并且起调节足量的能量摄取以保持代谢需要的作用。食欲由消化道、能量储存例如脂肪组织和肝中的能量储存、以及脑之间的紧密相互作用来调节。通过测量摄入食物的量并且通过评估对象进食的期望来评估对象的食欲。

“食欲失调”指的是异常的食欲，其包括增加的食欲和减少的食欲，其长久存在或者一周中重复出现若干次，从而造成神经性厌食症、神经性贪食症、恶病质、消耗性疾病、过度饮食、暴食症和食欲过剩。

在一个实施方案中，对象患有选自由以下组成的组的进食障碍：神经性厌食症、神经性贪食症、暴食症、恶病质和消耗性疾病，以及更特别地，神经性厌食症、神经性贪食症和暴食症。

“厌食症”指的是对食欲感知的降低，从而导致食欲降低。尽管在非科学性出版物中该术语经常与神经性厌食症互换使用，但食欲降低有许多可能原因，其中有些可以是无害的，而另一些指示严重的临床病症或构成严重风险。

本发明上下文中的“神经性厌食症(AN)”指的是特征为过度食物限制的进食障碍，过度食物限制的特征为不能将体重保持为正常体重的至少85％。此外，患有神经性厌食症的对象对于体重增加有非理性的恐惧，并且具有歪曲的自我身体认知，其中对象将其自身视为超重的，尽管有压倒性证据证明并非如此。

因此，患有神经性厌食症的人优选地具有至少一个选自由以下组成的组的心理特征：对身体不满意、追求清瘦、完美主义、效率低、不信任他人、社交不安全感和快感缺乏。优选地，患有神经性厌食症的人具有至少一个选自由以下组成的组的心理特征：对身体不满意、追求清瘦和完美主义。还优选的是，患有神经性厌食症的人具有至少一个选自由以下组成的组的心理特征：效率低、不信任他人、社交不安全感和快感缺乏。

在另一实施方案中，患有神经性厌食症的对象具有低于17的BMI。

“BMI”或“身体质量指数”被定义为对象的身体质量除以其身高的平方。在医药中普遍使用的该公式产生了kg/m²的测量单位。

“贪食症”或“神经性贪食症”是具有以下特征的进食障碍：暴食和清除，或在短时间内摄取大量食物然后努力使自身摆脱摄取的食物(清除)，该努力通常是通过呕吐、吃泻药或利尿剂和/或过量运动。一些对象可倾向于在神经性贪食症和神经性厌食症之间交替。患有贪食症的对象可以表现为正常的BMI范围，通常低于25。

“暴食症”或“BED”指的是以暴食为特征的进食障碍，由以下构成：在分离的时间段(例如在任何2小时时间段中)中进食明显高于大部分人在相似时间段和相似情况下会进食的食物量，并且伴随有失去控制感。暴食平均每周发生至少两次，持续6个月。与贪食症不同，暴食症不与重复使用不适当的补偿行为相联系。患有BED的对象对于暴食有严重焦虑。此外，患有BED的对象进食直至由于摄入的食物量而身体不舒服并且恶心和/或在无聊或抑郁时进食和/或甚至在不太饿的时候进食大量食物和/或由于对于食物感觉到不好意思而在正常进食时间独自进食和/或在暴食后感觉到厌恶、抑郁或愧疚。患有暴食症的对象对其进食行为冲动并且感觉到缺乏控制。此外，患有暴食症的对象在应对压力、焦虑、愤怒、悲伤、无聊和担心方面有问题。

在本发明的上下文中，患有BED的对象优选地肥胖以及具有高于30的BMI。

“过度饮食”是相对于机体消耗(或通过排泄排出)的能量摄取过量食物，导致体重增加。过度饮食有时可以是暴食症或贪食症的症状。强迫型过度饮食的人在有压力、多次感觉抑郁和感觉无助时依赖于食物来安慰自身。

“食欲过剩”也称为“多食症”，指的是过度的饥饿(强迫型)或增加的食欲。在一个实施方案中，食欲过剩可由例如糖尿病、克-列二氏综合征、遗传疾病Prader-Willi综合征和Bardet Biedl综合征的疾病引起。

“消耗性疾病”指的是衰弱性疾病导致肌肉和脂肪组织“消耗”掉的过程。消耗可以由极低的能量摄入(例如由饥荒引起)、感染引起的营养丧失或低摄入和高损失的组合引起。

“恶病质”是与体重减轻和/或肌肉萎缩和/或疲乏、衰弱和食欲显著缺失相联系的消耗性疾病，其可以由癌症、AIDS、慢性阻塞性肺病、多发性硬化、充血性心力衰竭、结核病、家族性淀粉样多神经病、汞中毒(肢痛症)和激素缺乏造成。恶病质(也可称为消耗)见于若干疾病，例如AIDS、癌症、后髋骨折、慢性心衰、慢性肺病例如慢性阻塞性肺病(COLD)和/或慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、肝硬化、肾衰竭和自身免疫疾病例如类风湿性关节炎和系统性狼疮、败血症和严重感染。此外，消耗也见于衰老。

在一些实施方案中，恶病质由癌症引起。

恶病质的最重要标志是体重减轻，不止减轻脂肪组织，还减轻肌肉组织甚至骨骼。该非脂肪性组织也被称为“瘦体重”。

此外还有食欲丧失、衰弱(无力)和血红蛋白水平下降(贫血)。

恶病质以许多不同的临床病症的终末阶段或在慢性疾病中出现，例如癌症、感染、AIDS、充血性心力衰竭、类风湿性关节炎、结核病、后髋骨折、囊性纤维化和克罗恩氏病。恶病质还可以在不具有任何明显疾病症状的老年人中出现。

“增加的食欲”是指对象相比身体所需的具有更高的食物摄入的食欲。这可以或可以不导致体重增加。

“正常食欲”因而指的是对象具有对应于身体所需食物量的食物摄入。

“降低的食欲”和/或“减少的食欲”是指对象相比身体所需的具有更低的食物摄入的食欲。这可以或可以不导致体重减轻。

“食物摄入”可以使用多种技术测量，包括使用例如日志或调查问卷自报告、通过在摄取之前对食物称重或称重并分析成对的食物量来测量自助进餐的卡路里摄入。可以以餐、天、周或月为基础测量食物摄入。

在一个实施方案中，所述组合物用于降低对象的体重增加。

所述组合物可以被用于例如降低食欲，其中增加的食欲是由于暴食症或过度饮食引起。

在本发明的一个实施方案中，所述治疗导致食物摄入相对于开始治疗之前的平均食物摄入降低至少1％，例如降低2％、更优选地3％或5％或7％以及更优选10％。

在另一个实施方案中，所述治疗导致卡路里摄入的降低而无关食物摄入的改变，因为所摄取食物量可能不与摄取的卡路里摄入直接相关，这是由于多种食物项目例如脂肪、碳水化合物和蛋白质在单位量食物中含有不同量的卡路里。

在本发明的一个实施方案中，所述治疗导致卡路里摄入相对于开始治疗之前的平均卡路里摄入降低至少1％，例如降低2％、更优选地3％或5％或7％以及甚至更优选卡路里摄入降低10％。

在一个实施方案中，所述组合物用于增加对象的体重增加。

所述组合物可以被用于例如刺激食欲，其中食欲降低是由于厌食症、神经性厌食症、神经性贪食症、恶病质或消耗性疾病，特别是厌食症、神经性厌食症或神经性贪食症。

在本发明的一个实施方案中，所述治疗导致食物摄入相对于开始治疗之前的平均食物摄入增加至少1％，例如增加2％、更优选地3％或5％或7％以及甚至更优选10％。

在另一个实施方案中，所述治疗导致卡路里摄入的增加而无关食物摄入的改变，因为所摄取食物量可能不与摄取的卡路里摄入直接相关，这是由于多种食物项目例如脂肪、碳水化合物和蛋白质在单位量食物中含有不同量的卡路里。

在本发明的一个优选实施方案中，所述治疗导致与开始治疗之前相比卡路里摄入增加至少1％，例如增加2％、更优选地3％或5％或7％以及甚至更优选卡路里摄入增加10％。

在一些实施方案中，所述组合物用于治疗或预防选自由以下组成的组的障碍：神经性厌食症(AN)、神经性贪食症(BN)、暴食症(BED)、过度饮食、食欲过剩、消耗性疾病例如恶病质，以及更特别地神经性厌食症(AN)、神经性贪食症(BN)和暴食症(BED)。

还提供了一种治疗对象的饮食障碍或者降低其发生的可能性的方法，所述方法包括，对有此需要的对象施用组合物，所述组合物包含针对至少一种表达ClpB的细菌的至少一种抗生素，和/或向所述对象施用有效量的包含不表达ClpB的益生菌的组合物，和/或其组合，如以下所述。

有此需要的对象是患有如本文所限定的饮食障碍的对象，所述饮食障碍特别地是选自由以下组成的组的障碍：神经性厌食症(AN)、神经性贪食症(BN)、暴食症(BED)、食欲过剩、消耗性疾病例如恶病质，以及更特别地神经性厌食症(AN)、神经性贪食症(BN)和暴食症(BED)。

还提供了包含针对至少一种表达ClpB的细菌的至少一种抗生素的组合物在制备用于治疗或预防如本文所限定的饮食障碍的药物中的用途。

本发明人发现，食欲失调与以下相关：ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的存在，以及抗-α-MSH-反应性抗体优选抗ClpB IgG和/或IgM和抗-α-MSH-反应性IgG和/或IgM的升高的血浆水平。

在一个实施方案中，降低对象中表达ClpB的细菌的量或浓度导致所述对象食欲的正常化。

不被理论束缚，包含针对至少一种表达ClpB的细菌的至少一种抗生素的组合物降低表达ClpB的细菌的量，从而降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平或浓度，和/或降低抗-α-MSH-反应性抗体的水平，从而导致正常化的食欲。

在一个实施方案中，在本发明上下文中使用的组合物是药物组合物。

在本发明上下文中使用的药物组合物优选地被设计为适于所选定的施用模式或施用途径，并且适当时使用可药用稀释剂、载剂和/或赋形剂，例如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。这种组合物可以根据例如Remington,TheScience and Practice of Pharmacy,第19版,Gennaro编,Mack Publishing Co.,Easton,PA 1995中公开的常规技术设计。

用于药物组合物的合适载剂包括在与本发明的抗生素组合时保持分子活性并且与对象的免疫系统无反应性的任何物质。

根据本发明的药物组合物可以以合适的药物单位剂型的形式经口施用。本发明的药物组合物可以以多种形式制备，包括片剂、硬或软明胶胶囊、水性溶液剂、悬液剂、和脂质体以及其他缓慢释放制剂，例如成形的聚合物凝胶。

施用模式和剂型与对于给定的治疗应用期望和有效的治疗剂或治疗组合物的特性紧密相关。合适的剂型包括但不限于经口、静脉内、经直肠、舌下、经肌肉、经鼻、经眼、皮下、肌内、透皮、经脊椎、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、经支气管和经淋巴施用，以及用于系统递送活性成分的其他剂型。

本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于透皮(被动的通过贴片、凝胶、乳、油膏或离子电渗)；静脉内(团注、输注)；皮下(输注、储库)；经肌肉(经颊和舌下，例如经口可分散的片剂、薄片、膜和泡腾制剂；经结膜(滴眼剂)；经直肠(栓剂、灌肠剂))；或皮内(团注、输注、储库)。

经口液体药物组合物可以为例如水性或油性悬液剂、溶液剂、乳液剂、糖浆或酏剂的形式，或者可以以在使用前用水或其他可溶载体构建的干燥产品的形式呈现。这种液体药物组合物可以含有常规的添加剂，例如悬浮剂、乳化剂、非水性载体(其可包括食用油)或防腐剂。

本发明的药物组合物还可以被配制用于肠胃外施用(例如通过注射，例如团注或连续输注)，并且可以在安瓿、预填装注射器、小体积输注容器或多剂量容器(具有添加的防腐剂)中以单位剂型呈现。药物组合物可以采用的形式例如是悬液剂、溶液剂或油性或水性载体中的乳液剂，并且可以含有配制试剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，本发明的药物组合物可以是使用前用合适载体例如无菌的无热原水构建的粉末形式，其通过无菌固体的无菌分离或通过溶液的冻干获得。

其中载剂为固体的适用于经直肠施用的药物组合物最优选以单位剂量的栓剂呈现。合适的载剂包括可可脂和本领域通常施用的其他物质，栓剂可以通过以下常规地形成，通过将药物组合物与软化或熔化的载剂混合然后冷却并在模具中定形。

对于吸入施用，根据本发明的药物组合物从吹药器、喷雾器或加压包装或者递送气溶胶喷雾的其他方便方式方便地递送。加压包装可以包含合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合适气体。在加压气溶胶的情况下，单位剂量可以通过提供阀以递送计量的量来确定。或者，对于吸入或吹入施用，本发明的药物组合物可以采用干粉组合物的形式，例如，药物组合物与合适的药物基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末组合物可以以在可在吸入器或吹药器的帮助下从其施用粉末的例如胶囊或药筒或明胶或泡罩包装中的单位剂型呈现。

对于鼻内施用，本发明的药物组合物可以通过液体喷雾施用，例如通过塑料瓶喷雾器。其的典型为Mistometerg(异丙基肾上腺素吸入器-Wintrop)和(异丙基肾上腺素吸入器-Riker)。

本发明的药物组合物还可以含有赋形剂，例如调味剂、着色剂、抗微生物剂或防腐剂。

施用方案可以为例如进行至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100天的时间。

剂量范围取决于待施用的组合物并且如以上所限定。

如医药领域公知的，用于任一对象的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。

在本发明的一个方面，本发明的治疗或预防方法使得能够通过施用包含针对至少一种表达ClpB的细菌的至少一种抗生素的组合物维持稳定的体重。

超重或体重过低在一些文化背景下也可能被认为是较缺乏吸引力的身体外观。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种调节对象的食欲的非治疗方法，其包括，向所述对象施用有效量的组合物，所述组合物包含针对至少一种表达ClpB的细菌的至少一种抗生素。

以上所提及的所有限定也适用于所述非治疗方法。

在一个实施方案中，有效量或治疗有效量是对对象赋予治疗益处或益处所需的活性剂的至少最低剂量，但低于毒性剂量。换言之，用于治疗饮食障碍的这种量例如是诱导、改善或以其他方式导致对象状态改进例如食物摄入调整的量。

在一个实施方案中，所述非治疗方法是美容方法。

如上所述，本发明还涉及用于治疗或预防饮食障碍的组合物，其包含不表达ClpB蛋白的益生菌。

以上所提及的所有限定也适用于所述组合物。

在一个实施方案中，所述饮食障碍选自由以下组成的组：神经性厌食症(AN)、神经性贪食症(BN)、暴食症(BED)、食欲过剩、消耗性疾病例如恶病质，以及更特别地神经性厌食症(AN)、神经性贪食症(BN)和暴食症(BED)。

本发明还涉及调节对象的食欲的非治疗方法，其包括，向所述对象施用有效量的组合物，所述组合物包含不表达ClpB蛋白的益生菌。

以上所提及的所有限定也适用于所述非治疗方法。

“益生菌”是指旨在被引入膳食中的包含有效量的微生物的食品添加剂。根据WHO，益生菌是活的微生物，其在以足量施用时对宿主健康有益处(WHO，2001)。

在本发明的上下文中，被引入膳食的所述细菌是不表达ClpB蛋白的细菌。特别地，其是在正常情况下表达ClpB蛋白质但其中所述蛋白质的表达已经被缺失的细菌。

表达ClpB的细菌是本领域技术人员公知的，并且可以通过常规技术鉴定。

在一个实施方案中，其中所述蛋白质的表达已经被缺失的表达ClpB的细菌选自由以下构成的组：已知为人中的益生或共生的非病原性的细菌，例如非病原性Escherichiacoli。

不表达ClpB蛋白的细菌可以通过本领域技术人员已知的方法制备。这可以例如通过DNA重组进行。

在本发明的上下文中，“有效量”是指允许展现治疗或预防饮食障碍的期望效果的细菌量。特别地，其意指10亿到100亿UFC.天^-1的量。

如上所述，本发明还涉及作为疫苗或免疫原性组合物使用的组合物，其包含ClpB蛋白。

“免疫原性组合物”在本发明的上下文中是指包含ClpB蛋白的组合物，其在施用给个体时触发免疫应答或对免疫应答进行免疫调节(即免疫抑制或免疫刺激)，或在施用给个体时诱导抗体产生。

“疫苗”是指施用其以免疫调节免疫应答的例如本文所述的免疫原性组合物的组合物，其将保护或治疗个体使其免受疾病，特别是由于所述试剂。本发明的疫苗特别地是预防性(防止性)疫苗，其在个体发生饮食障碍之前被施用。

特别地，所述组合物被用于针对饮食障碍进行免疫。

更特别地，所述组合物用于预防饮食障碍。

还提供了在对象中进行免疫或接种的方法，所述方法包括，向有此需要的对象施用包含ClpB蛋白的组合物。

特别地，所述方法用于降低对象中饮食障碍发生的可能性。

有此需要的对象是被怀疑患有饮食障碍的对象。

还提供了包含ClpB蛋白的组合物在制备用于针对饮食障碍进行免疫的疫苗或免疫原性组合物中的用途。

特别地，所述组合物用于预防饮食障碍。

特别地，所述饮食障碍选自：神经性厌食症(AN)、神经性贪食症(BN)、暴食症(BED)、过度饮食、食欲过剩、消耗性疾病例如恶病质，特别是神经性厌食症、神经性贪食症和暴食症。

在一个实施方案中，疫苗或免疫原性组合物还可以包含本文公开的多种ClpB蛋白的组合。

获得疫苗组合物或免疫原性组合物的方法是本领域公知的。一般地，这种方法涉及使用例如超声、蛋白裂解消化、热处理、冻融处理、渗透冲击处理等的技术从细菌制备物提取蛋白质。人工细菌制剂的实例包括部分或全部通过合成或重组方法获得的蛋白质制剂。

包含ClpB的疫苗或免疫原性组合物的典型剂量可以为例如在约0.01nmol/kg至约1000nmol/kg的范围内；然而，预想到了在该示例性范围之下或之上的剂量。特别地，所述剂量为约0.1nmol/kg至约100nmol/kg总体重，优选是约0.1nmol/kg至约20nmol/kg，更特别地从约0.1nmol/kg至约10nmol/kg，特别是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10nmol/kg体重。

对于所述疫苗和免疫原性组合物，适合于可注射用的形式包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且流动程度必须使得具备易于注射的能力。所述形式必须在制备和储存条件下稳定，并且必须被保护以免受微生物例如细菌和真菌的污染作用。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。可以通过例如使用涂层例如卵磷脂、通过在悬浮液的情况下保持需要的粒径和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过多种抗菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来赋予可注射组合物延长的吸收。

对于在水性溶液中的肠胃外施用，例如，需要的情况下溶液应该被合适地缓冲并且液体稀释液首先应用足够的盐水或葡萄糖变成等渗。这些特定的水性溶液特别适合用于静脉内、动脉内、肌内、皮下、瘤内和腹膜内施用。对此，可以应用的无菌水性介质是本领域技术人员根据本公开内容已知的。例如，一个剂量可以被溶解在1ml的等渗NaCl溶液中，添加到1000ml的皮下输注液或者在输注的建议位点注射(参见例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第21版,Lippincot和Williams,2005)。根据被治疗的对象的状况将需要进行剂量的一些改变。此外，对于人的施用，制剂应该满足FDA生物标准办公室所要求的无菌性、热原性、一般安全和纯度标准。

通过过滤灭菌通过将所需量的活性化合物掺入合适的溶剂来制备无菌可注射溶液。

本文所用的“载剂”包括但不限于溶剂、分散介质、载体、涂层、稀释剂、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬液、胶体、脂质体和病毒体，如Bomsel等(2011)Immunity 34:269-280中所描述的。这种介质和试剂在药物活性物质中的使用是本领域公知的。

词语“可药用”或“药理上可接受”是指在施用给人时不产生变态或类似不利反应的分子实体和组合物。含有作为活性成分的蛋白质的水性组合物的制备是本领域中公知的。通常，这种组合物被制备为液体溶液或悬液形式的可注射剂；还可以制备在注射前适于溶于或悬浮于液体中的固体形式。

在本发明的一个具体实施方案中，所述免疫原性或疫苗组合物还包含一种或几种佐剂。

本文使用的术语“佐剂”指的是被添加到免疫原性组合物特别是疫苗的内容物中的、增加在施用所述组合物的宿主中诱导的免疫反应的强度的产品。佐剂特别地可以增加施用所述组合物后所述哺乳动物能够产生的特异性抗体的量，从而提高免疫效力。

优选地，佐剂在人宿主中没有副作用。

佐剂包括发挥提高保护性免疫应答作用的任何化合物。佐剂可以包括例如乳化剂；胞壁酰基二肽；阿夫立定；水性佐剂例如氢氧化铝；含氧金属盐；基于壳聚糖的佐剂和多种皂素中的任意种、油和本领域已知的其他物质，例如Ampfaigen、LPS、细菌细胞壁提取物、细菌DNA、CpG序列、合成的寡核苷酸及其组合(Schijns等(2000)Curr.Opin.Immunol,12:456)、Mycohacterialplilei(phlei)细胞提取物(CWE)(美国专利No.4,744,984)、M.phleiDNA(M-D A)和M-DNA-M phlei细胞壁复合体(MCC)、不耐热肠毒素(LT)、霍乱毒素(CT)、霍乱毒素B亚基(CTB)、聚合脂质体、突变毒素例如LTK63和LTR72、微胶囊、白介素(例如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、INFγ)、GM-CSF、MDF衍生物、CpG寡核苷酸、LPS、MPL、磷酸磷腈(phosphophazenes)、葡聚糖、抗原制剂、脂质体、DDE、DHEA、DMPC、DMPG、DOC/铝复合体、弗氏不完全佐剂、LT口服佐剂、胞壁酰基二肽、单磷酰酯A、胞壁酰基三肽和磷酸二酰乙醇胺。可用作乳化剂的化合物包括天然和合成的乳化剂，以及阴离子、阳离子和非离子型化合物。含氧金属盐包括Al、K、Ca、Mg、Zn、Ba、Na、Li、B、Be、Fe、Si、Co、Cu、Ni、Ag、Au和Cr的盐，其为硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、硝酸盐、碘酸盐、溴酸盐、碳酸盐、水化物、乙酸盐、柠檬酸盐、草酸盐和酒石酸盐及其混合物形式，包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、硫酸铝钾、磷酸钙、Maalox(氢氧化铝和氢氧化镁的混合物)、氢氧化铍、氢氧化锌、碳酸锌、氯化锌和硫酸钡。在合成的化合物中，阴离子型乳化剂包括例如月桂酸和油酸的钾、钠和铝盐，脂肪酸的镁和铝盐，以及有机磺酸盐，例如十二烷基硫酸钠。合成的阳离子型试剂包括例如cetyltrhethylarnmonlum bromide，而合成的非离子型制剂的例子为甘油酯(例如甘油单硬脂酸酯)、聚氧乙二醇酯和醚，和山梨聚糖脂肪酸酯(例如山梨聚糖单棕榈酸酯)及其聚氧乙烯衍生物(例如聚氧乙烯山梨聚糖单棕榈酸酯)。天然乳化剂包括阿拉伯胶、明胶、卵磷脂和胆固醇。

可以用油组分形成其他合适的佐剂，例如单一油、油的混合物、油包水乳剂或水包油乳剂。所述油可以是矿物油、植物油或动物油。矿物油是通过蒸馏技术从石油获得的液体烃，在本领域中也被称为液体石蜡、液体石油或者白矿物油。合适的动物油包括例如鳕鱼肝油、大比目鱼油、鲱油、橘棘鲷鱼油和鲨鱼肝油，它们所有均市售可得。合适的植物油包括例如芥花油、杏仁油、棉花籽油、玉米油、橄榄油、花生油、藏红花油、芝麻油、大豆油等。弗式完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)是在疫苗制备中常用的两种常用佐剂，它们也适用于本发明。FCA和FIA二者均是矿物油包水乳剂；然而，FCA还含有杀灭的分枝杆菌属物种。用于经粘膜疫苗的特别优选的佐剂为半乳糖神经酰胺(GalCer)，如Lee等(2011)Vaccine 29:417-425中所述。

所述疫苗组合物中还可使用免疫调节性细胞因子来增强疫苗效力，例如，佐剂。这种细胞因子的非限制性实例包括干扰素α(IFN-α)、白介素-2(IL-2)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其组合。

所述疫苗和免疫原性组合物可以通过以下施用：静脉内施用、动脉内、经内窥镜、损伤内、经皮、皮下、肌内、鞘内、眶内、皮内、腹膜内、经气管、表皮下、通过胸骨内注射、静脉内、动脉内、皮内、透皮、肌内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、通过吸入或经鼻喷雾、通过气管内途径等等。所述组合物的施用可以通过输注或注射(例如静脉内、肌内、皮内、皮下、鞘内、十二指肠内、腹膜内等等)。此外，所述组合物可以通过“无针”递送系统施用。

所述注射可以被分开为多个注射，这种分开的接种优选地基本同时施用。当以分开接种的形式施用时，免疫原的剂量优选(但不必须)在每个单独的注射中比例相等。如果在疫苗组合物中存在佐剂，佐剂的剂量优选(但不一定)在每个单独的注射中比例相等。用于分开接种的单独的注射优选地在患者身体上大体彼此邻近的位置施用。在一些优选的方面，在身体上彼此相距至少约1cm的位置施用所述注射。在一些优选的方面，在身体上彼此相距至少约2.5cm的位置施用所述注射。在一些极为优选的方面，在身体上彼此相距至少约5cm的位置施用所述注射，在一些方面，在身体上彼此相距至少约10cm的位置施用所述注射，在一些方面，在身体上彼此相距大于10cm的位置施用所述注射，例如在身体上彼此相距至少约12.5、15、17.5、20或更多cm的位置。

可以使用多种替代性药物递送系统。这种系统的非限制性实例包括脂质体和乳剂。也可以使用某些有机溶剂例如二甲亚砜。此外，可以施用持续释放系统递送所述疫苗组合物，例如含有所述蛋白质的固体聚合物的半渗透基质。本领域技术人员公知多种持续释放材料。持续释放胶囊可以根据其化学特性在几天至几周至几个月的范围内释放疫苗组合物。

理想地，在有饮食障碍之前或者在饮食障碍的任何症状之前向对象施用组合物。

可以通过肠胃外或非肠胃外途径进行施用。施用途径包括例如静脉内、动脉内、皮内、透皮、肌内、经粘膜、皮下、经皮、气管内、腹膜内、灌注和灌洗。例如，施用可以通过经粘膜途径，例如通过经鼻、经口(经过消化系统的粘膜)、经阴道、经颊、经直肠、舌下、经眼、经尿道、经肺或经耳途径。

免疫可以包括多个“单位剂量”。

不一定将单位剂量作为单次注射施用，而是其可以包括经一定时间段的连续输注。单位剂量可以包含约0.01nmol/kg至约1000nmol/kg。特别地，所述剂量为约0.1nmol/kg至约100nmol/kg总体重，优选是约0.1nmol/kg至约20nmol/kg，更特别地从约0.1nmol/kg至约10nmol/kg，特别是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10nmol/kg体重。

在一个实施方案中，所述疫苗组合物可以以单个日剂量施用，或者总日剂量可以以多个剂量施用，例如每日2、3或4次。此外，所述疫苗组合物可以以经鼻形式通过合适经鼻载体的局部使用，通过透皮途径使用本领域技术人员公知的那些透皮皮肤贴剂形式，通过可植入泵，或通过任何其他合适施用方式施用。为了以透皮递送系统的形式施用，例如，剂量的施用将当然在剂量方案期间是是连续的而非间歇的。

疫苗施用还可包含引发-加强方案。在这些方法中，一个或更多个引发免疫之后是一个或更多个加强免疫。对于每个免疫，实际的免疫原性组合物可以相同或不同，免疫原性组合物的类型、途径和免疫原制剂也可以不同。一种有用的引发-加强方案提供间隔4周的两次引发免疫，然后是在最后的引发免疫之后第4周和第8周的两次加强免疫。

对于动物(包括人)的免疫时间表(或方案)是公知的，并且可以针对具体的对象和组合物容易地确定。因而，可以对对象施用一次或更多次组合物。优选地，在免疫原性组合物的分开的施用之间有确定时间间隔。尽管该间隔对于每个对象不同，但是通常其范围为10天到几周，通常是2、4、6或8周。对于人，间隔通常是2至6周。在一个本发明的特别有利的实施方案中，间隔更长，有利地约10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周、30周、32周、34周、36周、38周、40周、42周、44周、46周、48周、50周、52周、54周、56周、58周、60周、62周、64周、66周、68周或70周。

免疫方案通常具有组合物的1到6次施用，但是可以具有少至1、2、3、4或5次。诱导免疫应答的方法还可以包括伴随组合物施用佐剂。在一些情况下，每年、每两年或其他更长间隔(5-10年)的加强免疫可以补充起初的免疫方法。

本发明的一个特定实施方案提供在对象中诱导针对饮食障碍的免疫应答的方法，其通过向对象施用一次或更多次本发明的疫苗或免疫原性组合物实现，其中ClpB的水平足以在对象中诱导特异性免疫应答。这种免疫可以根据期望的免疫方案以至少2、4或6周(或更长)的时间间隔重复多次。

本发明人发现了ClpB蛋白和抗ClpB抗体之间的关系，特别是抗ClpB IgG和饮食障碍特别是神经性厌食症和神经性贪食症之间的关系。

因此，本发明还涉及用于诊断对象的饮食障碍的体外方法，所述方法包括：

a)测量来自所述对象的生物样品中的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平；

c)推断所述对象是否患有饮食障碍。

在本发明的上下文中，所述对象产生针对细菌蛋白ClpB的抗体，称为抗ClpB抗体。

本发明的上下文中由所述对象产生的抗体可以是IgM、IgD、IgG、IgA和/或IgE抗体，特别是IgG和/或IgM抗体。

在本发明的上下文中，以表达ClpB之细菌菌株的形式存在的所述ClpB蛋白增加针对ClpB的抗体和/或针对α-MSH的抗体的产生。

针对α-MSH的由所述对象产生的抗体也称为自身抗体。

术语“自身抗体”是指由免疫系统产生的针对对象自身蛋白的抗体。

优选地，抗ClpB抗体如以上定义的与α-MSH交叉反应。

因此，在一个实施方案中，抗ClpB抗体也是抗α-MSH抗体。

“抗体”或“免疫球蛋白”(Ig)可以是天然或常规抗体，其中两个重链通过二硫键彼此连接，每个重链通过二硫键与轻链连接。有两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。有五种主要的重链类型(或同种型)，其确定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每个链含有不同的序列结构域。轻链包括两个结构域或区域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)二者的可变结构域决定结合识别行为和对抗原的特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域赋予重要的生物特性，例如抗体链结合、分泌、穿过胎盘的运动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N端部分，由一个轻链和一个重链的可变部分组成。抗体的特异性依赖于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变或互补决定区(CDR)的残基构成。偶尔地，来自非高变或框架区(FR)的残基影响整体结构域结构，从而影响结合位点。互补决定区或CDR是指一起限定了天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和性和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个CDR，分别命名为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。因此，常规抗体的抗原结合位点包含6个CDR，包括来自重链和轻链V区域的CDR组。

“框架区”(FR)是指在CDR之间的氨基酸序列，即在一个物种中的不同免疫球蛋白之间相对保守的免疫球蛋白轻链和重链的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有4个FR，分别命名为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。

本文所用“人框架区”是与天然人抗体的框架区基本相同(约85％或更多，特别地90％、95％、97％、99％或100％)的框架区。

本文所用的“用于诊断的方法”或“诊断方法”或简单的“诊断”是指确定或鉴定对象中的可能疾病或障碍的方法。在本发明的上下文中，诊断方法涉及确定或鉴定饮食障碍，特别是选自神经性厌食症(AN)、神经性贪食症(BN)、暴食症(BED)、过度饮食、食欲过剩、消耗性疾病例如恶病质，特别是神经性厌食症、神经性贪食症和暴食症的饮食障碍。

本文所用术语“生物样品”是指生物来源的物质。生物样品的示例包括但不限于血液、血浆、血清或唾液。优选地，根据本发明的生物样品是血液、血清和/或血浆样品，特别是血浆样品。根据本发明的生物样品可以通过本领域已知的任何合适取样方法从对象获得。

根据本发明的诊断饮食障碍的方法包括步骤b)：将测量的所述ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平与参考值相比较。

优选地，所述参考值在与本发明所述方法步骤a)的对象的生物样品具有相同的组织来源。

优选地，“参考值”对应于ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的正常水平。

本文所述的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的“正常水平”是指生物样品中ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平在ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的标准截断值之内。所述标准取决于生物样品的类型和用于测量生物样品中ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平的方法。特别地，所述正常水平是健康群体中ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的平均水平。

特别地，参考值对应于健康对象中ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平。因此，参考值可以对应于来源于健康对象的参考样品中的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平。

特别地，参考值对应于健康对象中ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平，特别在步骤a)中测量ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平时。

本文所用的“健康群体”指的是由之前未被诊断为饮食障碍的对象构成的群体。健康群体的对象优选地不另外地显示饮食障碍的任何症状。换言之，如果由专业医生检查，这样的对象将被表征为健康并且没有疾病症状。

因此，“健康对象”指的是之前未被诊断为饮食障碍的对象。健康对象不另外地显示饮食障碍的任何症状。换言之，如果由专业医生检查，这样的健康对象将被表征为健康并且没有疾病症状。

优选地，健康对象不显示以上提及的任何饮食障碍。

在本发明的上下文中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法检测ClpB蛋白抗ClpB抗体的水平，例如通过酶联免疫吸附测定。

特别地，例如，ClpB蛋白的水平通过免疫测定或免疫印迹或通过分析方法如质谱(MS)、毛细电泳-质谱(CE-MS)、液相色谱偶联质谱(LC-MS、LC-MS/MS)测量。

根据本发明使用的术语“免疫测定”包括竞争、直接反应或夹心型测定。这种测定包括但不限于凝集测试、酶标记和介导的免疫测定，例如ELISA，生物素/亲和素型测试、放射免疫测定、免疫电泳和免疫沉淀，更直接地涉及ELISA。

质谱(MS)、毛细电泳-质谱(CE-MS)、液相色谱偶联质谱(LC-MS、LC-MS/MS)均为本领域技术人员公知的分析方法，并且适用于进行根据本发明的方法。

在一个具体的实施方案中，通过对对象粪便中的ClpB DNA进行定量来测量ClpBDNA水平，例如通过在以下实验部分在ClpB DNA测定下公开的方法，或者如下方法：从细菌菌株的培养物中提取并使用QIAamp^R DNA Stool Mini Kit(QIAGEN,France)从粪便纯化DNA。将细菌溶解在水中并在100℃下煮5分钟，在11,000r.p.m.下离心1分钟后，将含有DNA的上清液储存在-20℃。使用NCBI引物设计工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/)，设计扩增编码含有一个经鉴定α-MSH样表位的ClpB蛋白片段的180bp DNA区域的以下核苷酸引物，正向5'-GCAGCTCGAAGGCAAAACTA-3'(SEQ ID NO:4)和反向：5'-ACCGCTTCGTTCTGACCAAT-3'(SEQ ID NO:5)(Invitrogen Custom Primers,CergyPontoise,France)。在具有MicroAmp管(Eppendorf,Hambourg,Germany)的热循环仪中进行PCR。反应在含有25μl Go Taq^R Green Master Mix 2X(Promega,Madison,WI)、1μl(20pmol)各引物、21μl双蒸水和1μl细菌DNA的50μl体积中进行。PCR反应条件如下：94℃ 3分钟，然后35个循环的94℃ 30s，60℃ 30s和72℃ 1.5min。在1％琼脂糖凝胶(Sigma)上可视化PCR产物，具有预期的大小180bp，使用ClpB突变菌株确认特异性。

特别地，与ClpB反应的抗体的水平使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量。

通常，在通常的pH 9.6的100mM NaHCO₃缓冲液中使用例如100μl和2μg/ml浓度的ClpB蛋白(Delphi Genetics)包被通常的Maxisorp平板(Nunc,Rochester,NY)，通常在4℃下进行72小时。用通常含有0.05％Tween 200、pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗平板例如(5分钟x 3)，然后用1:200的在PBS中稀释的100μl小鼠或大鼠血浆孵育例如在4℃过夜以确定游离抗体水平，或用1:200的在通常的pH 8.9的解离3M NaCl,1.5M甘氨酸缓冲液中稀释的100μl小鼠或大鼠血浆孵育例如在4℃过夜以确定以确定总抗体水平。清洗平板(3x)并用通常的100μl碱性磷酸酶(AP)-缀合的山羊抗大鼠IgG(1:2000)、抗大鼠IgM(1:1000)、抗小鼠IgG(1:2000)或抗小鼠IgM(1:1000)(全部来自Jackson ImmunoResearchLaboratories,Inc.,West Grove,PA)孵育。清洗(3x)后，通常加入100μl对硝基苯磷酸缓冲液(Sigma)作为碱性磷酸酶底物。在通常的40分钟室温下孵育后，通过加入3N NaOH停止反应。使用通常的读板器Metertech960(Metertech Inc.,Taipei,Taiwan)典型地在405nm测定OD(光密度)。从样品OD值中减去读自未添加血浆样品的空白OD值。每个测定通常一式两份地进行。一式两份的值之间的变化通常小于5％。

典型地，使用类似的方案测量使用通常的相应抗人IgG或IgM AP缀合的抗体通常1:400稀释的人血浆中的抗ClpB IgG和IgM抗体。

优选地，特别在使用酶联免疫吸附测定测量抗ClpB抗体的水平时，抗ClpB抗体的参考值特别地以血浆中抗ClpB IgG的OD测量，并且OD值在0-3之间，优选地在2.0-3.0之间和/或在0.0-1.0之间。

优选地，在本发明的方法中，确定所测量的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体的水平是否高于(增加)或低于(降低)根据本发明的参考值。

本发明人还发现，尽管在对照中抗ClpB IgG与几种心理特性的正常范围负相关，在AN患者中，抗ClpB IgG与核心心理特性例如对身体不满意和追求清瘦正相关。

因此，所述方法还可以包括步骤b2)，其中评估表征饮食障碍的心理特性。

在一个实施方案中，抗ClpB IgG的值相比于参考值增加指示存在饮食障碍，特别在AN中。

在一个实施方案中，指示存在饮食障碍的心理特性是对身体不满意和追求清瘦。

在一个具体的实施方案中，抗ClpB IgG的值相比于参考值增加和/或在步骤b2)中检测到与饮食障碍相关的心理特性表明存在饮食障碍，特别是AN。

评估与饮食障碍相关的“心理特性”的方法是本领域技术人员已知的。

在一个示例中，与饮食障碍相关的心理特性可以使用饮食障碍量表-2测定。

“饮食障碍量表(EDI)”是用于评估以下饮食障碍的存在与否的自报告调查问卷，(a)限制性和暴食/清除型神经性贪食症；(b)神经性厌食症；和(c)其他未指出的饮食障碍包括暴食症(BED)。最初的调查问卷由64个问题组成，分为8个亚标度。EDI-2是指1991年复核的版本。

在一个实施方案中，本发明诊断方法的步骤c)涉及推断对象是否患有饮食障碍，其中抗ClpB抗体相比于参考值的升高优选地指示存在饮食障碍。

在另一实施方案中，检测到步骤b2)中检测的具有饮食障碍的心理特性指示存在饮食障碍。

所述方法因此可以包括另一步骤预-c)，其确定相比于步骤a)中确定的抗ClpBIgG总水平，所述样品中与α-MSH交叉反应的抗ClpB IgG水平的比率。

与α-MSH交叉反应的抗ClpB IgG水平的比率可以通过以下确定：例如通过用通常的10^-6Mα-MSH肽(Bachem)预孵育以1:400在PBS中稀释的人血浆样品例如在4℃下过夜，之后将样品添加至通常的包被有ClpB蛋白(Delphi Genetics)的96孔Maxisorp平板(Nunc)。通常地通过ELISA使用相应的抗人AP缀合抗体(Jackson)检测与ClpB反应的IgG抗体。与α-MSH交叉反应的抗ClpB IgG的百分比可以相对于等于100％的在各个血浆样品中无吸附的抗ClpB IgG的水平计算。

在一个具体的实施方案中，相比于抗ClpB抗体总水平的与α-MSH交叉反应的抗ClpB IgG水平的比率比参考值升高指示存在进食障碍。

本发明还涉及治疗对象的饮食障碍或者降低其发生的可能性的方法，所述方法包括，对所述对象施用包含针对至少一种表达ClpB的细菌的至少一种抗生素的组合物，和/或向所述对象施用包含不表达ClpB的益生菌的组合物，和/或其组合，其中所述对象通过以下被诊断为患有进食障碍：

c)推断所述对象是否患有饮食障碍。

以上所提及的所有限定也适用于所述方法。

在一个实施方案中，相比参考值具有升高的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体值的对象被选择为对降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体水平的治疗有应答可能性。

在一个实施方案中，所述方法因此可以包括步骤b2)，其中如上所述评估表征饮食障碍的心理特性。

本发明的所述诊断方法的步骤c)涉及选择用于降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体水平的治疗的对象，其中相比参考值具有升高的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体值的对象被选择为对降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体水平的治疗有应答可能性。

在一个具体的实施方案中，相比参考值具有升高的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体值和/或在步骤b2)中检测为具备与进食障碍相关的心理特性的对象被选择为对降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体水平的治疗有应答可能性。

在一个实施方案中，指示存在进食障碍的生理心理特性为对身体不满意和追求清瘦。

此外，本发明人证实，在小鼠中长期经胃递送E.coli减少食物摄取，本发明还涉及用于治疗或预防肥胖症的包含过表达ClpB蛋白的益生菌的组合物。

“肥胖症”在本文中指对象优选地具有高于30的BMI的医学病症。

“过表达”是指由于以提高的量表达基因而人工表达蛋白，这里表达提高的基因编码ClpB蛋白。

过表达ClpB蛋白的细菌可以通过技术人员已知的方法制备。这例如可以通过用表达ClpB DNA的载体转化细菌来进行。

在一个实施方案中，过表达ClpB的细菌选自已知的人中的益生或共生非病原菌的细菌，例如非病原性Escherichia coli。

“有效量”是指允许展现期望效果的细菌量。特别地，其意指10亿到100亿UFC.天^-1的量。

在本申请全文中，术语“包含”、“包括”应被解释为涵盖所有具体提及的特征以及任选的、额外的未具体指出的特征。本文所用的术语“包含”、“包括”的使用还公开了其中不存在除具体提及的特征外的特征的实施方案(即，“由……组成”)。

现将参照以下附图和实施例更详细地描述本发明。

序列

SEQ ID NO：1显示了NCBI参考号:NP_417083.1和Uni-Prot收录号P63284示出的来自E.coli K12的伴侣蛋白ClpB的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2显示了SEQ ID NO：1的来自E.coli K12的伴侣蛋白ClpB的氨基酸序列的第542-548位氨基酸。

SEQ ID NO：3显示了Gen Pept序列ID,PRF:223274示出的来自智人(Homosapiens)的α-MSH的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4显示了核苷酸引物ClpB的核酸序列。

SEQ ID NO：5显示了核苷酸引物ClpB的核酸序列。

附图

图1：E.coli K12蛋白与α-MSH之间分子模拟的蛋白质组鉴定。

(a)E.coli细胞质蛋白质的2D GE。(b、c)用Rb抗α-MSH IgG检测的E.coli蛋白的免疫印迹，用α-MSH预吸附(c)或未预吸附(b)。被α-MSH IgG特异性识别的点用红圈圈出，用于蛋白质鉴定。蓝圈表示非特异性点。点1-4鉴定的蛋白质为ClpB的同种型。(d)使用Stretcher程序进行α-MSH和ClpB的氨基酸序列比对。(e)用抗α-MSH IgG显示的重组ClpB的western印迹。泳道1和2分别为20μg和10μg ClpB。

图2.小鼠中的ClpB免疫。

将ClpB免疫的小鼠(ClpB+Adj)与接收佐剂(Adj)、PBS或对照(Ctr)的小鼠比较。(a)在研究的32天期间的体重改变。在BioDAQ笼中在最后2周期间研究食物摄入和进食模式。在研究最后10天期间的平均日食物摄入(b)、餐食量(c)和进餐数(d)。(e)注射α-MSH(100μg kg^-1体重，i.p.)或PBS后24小时期间的食物摄入。(f)用10^-6Mα-MSH吸附前和吸附后ClpB反应性IgG的血浆水平。(g)作为解离平衡常数(KD值)显示的抗ClpB IgG的亲和力。(h)α-MSH反应性总IgG的血浆水平。(i)抗α-MSH IgG的亲和力(KD)。(j)在用单独的α-MSH或用与从ClpB免疫或Adj注射的小鼠合并的IgG(0.5mg ml^-1)一起进行刺激后过表达MC4R的人胚胎肾-293细胞的cAMP测定。(k)用耗尽抗α-MSH IgG的IgG进行cAMP测定。(a)α-MSH注射(100μg kg^-1体重，i.p.)前变异的双向重复测量分析(ANOVA)，Po0.0001,Bonferroni事后检验^*a至少，Po0.05ClpB组相比于Ctr；^*b至少,Po0.05Adj组相比于Ctr.；^*c,Po0.05,Student's t检验ClpB组相比于PBS；和^*d,Po0.05,Student's t检验ClpB组相比于Ctr。(b)ANOVA P＝0.0002,Tukey's事后检验^***Po0.001,^**Po0.01,#Po0.05,Student's t检验。(c)ANOVA P＝0.007,Tukey's事后检验^**Po0.01。(e)Student's t检验，^*Po0.05。(f,g)ANOVA Po0.0001,Tukey's事后检验^***Po0.001ClpB+Adj相比于其他组，配对的t检验##Po0.01,###Po0.001。(h)ANOVA P＝0.0002,Tukey's事后检验^***Po0.001,^*Po0.05；(i)Kruskal-Wallis检验P＝0.003,Dunn's事后检验^**Po0.01,(平均值±s.e.m.,n＝8)。(j)ANOVA P＝0.005,Tukey's事后检验^*Po0.05；ANOVA P＝0.04,Student's t检验#Po0.05,aClpB相比于α-MSH,bClpB相比于Adj(平均值±s.e.m.；j,n＝6,k,n＝3)。

图3：小鼠中的E.coli补充。

用E.coli K12野生型(WT)、ClpB缺陷(AClpB)E.coli K12或LB培养基对小鼠经胃每日管饲(第1-21天)对体重(a)、食物摄入(b)、餐食量(c)和进餐数(d)的作用。(e)PCR检测细菌ClpB DNA的180碱基对片段，第一泳道，分子量标记，第二泳道，来自E.coli K12WT体外培养物的DNA，第三泳道，来自E.coli K12ΔClpB的体外培养物的DNA，以及剩余泳道，在第21天收集的来自小鼠粪便的DNA。用10^-6Mα-MSH吸附前和吸附后抗ClpB IgM(f)和IgG(g)的以酶联免疫吸附测定中光强度的血浆水平。

抗α-MSH IgM(h)和IgG(i)的血浆水平。(j)抗α-MSH IgG的亲和力(平衡常数)。(a)变异的双向重复测量分析(ANOVA)，P＝0.3,Bonferroni事后检验第2天,^**Po0.01对照(Ctr)相比于E.coli WT。(b)ANOVA第1-2天,P＝0.0006,Tukey's事后检验^***Po0.001,^*Po0.05,E.coli WT相比于aCtr和bLB。(c)Kruskal-Wallis(K-W)检验第3周P＝0.0001,Dunn's事后检验，^***Po0.001,^**Po0.01,E.coli WT相比于aCtr,bLB和CΔClpB。(d)ANOVA第1-2天,P＝0.006,Tukey's事后检验^**Po0.01,^*Po0.05,K-W检验第3周Po0.0001,Dunn's事后检验,^***Po0.001,^**Po0.01,E.coli WT相比于aCtr,bLB和CΔClpB。(f)K-W检验,吸附前P＝0.02,Dunn's事后检验^*Po0.05,ANOVA吸附后,Po0.0001,Tukey's事后检验^**Po0.01,E.coli WT相比于其他组。(g)ANOVA吸附前,P＝0.01,Tukey's事后检验^*Po0.05,E.coli WT相比于其他组,配对的t检验##Po0.01。(h)Student's t检验,E.coli WT相比于其他组^*Po0.05。(j)K-W检验P＝0.02,Dunn's事后检验^*Po0.05,Mann-Whitney检验,#Po0.05.(平均值±s.e.m.,n＝8)。

图4：ED患者中的抗ClpB抗体。

健康女性(对照，Ctr)和患有AN、BN和BED的患者中抗ClpB IgG(a)和IgM(b)的血浆水平。用10^-6Mα-MSH吸附前和吸附后ClpB IgG(c)和IgM(d)的血浆水平。α-MSH交叉反应性抗ClpB IgG(e)和IgM(f)的百分比。(b)Student's t检验^*Po0.05。(c,d)配对t检验^***Po0.001,^**Po0.01。(e)Kruskal-Wallis检验Po0.0001,Dunn's事后检验，^**Po0.01,Mann-Whitney检验#Po0.05。(f)变异分析P＝0.02,Tukey's事后检验^*Po0.05。(平均值±s.e.m.,Ctr,n＝65,AN,n＝27BN,n＝32以及BED,n＝14)。

图5：患有进食障碍的患者和健康对照(Ctr)中细菌ClpB的血浆浓度。

AN，神经性厌食症；BN，神经性贪食症；BED，暴食症。^*p<0,05平均ClpB浓度相比于Ctr的Student's t检验。具有高于对照的平均值+2标准偏差(SD)的ClpB浓度的患者的百分比(％)。

实施例

以下实施例证实，共生肠细菌E.Coli K12的ClpB伴侣蛋白是参与能量代谢和情绪调节的一种神经肽α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)的构象模拟物。本发明人还揭示了表达ClpB的肠细菌与通过产生与α-MSH交叉反应的ClpB蛋白和抗ClpB抗体调节动机性行为和情绪之间的分子联系。本发明人还证明，表达ClpB的微生物参与提高ClpB蛋白和ClpB抗体的产生并建立异常喂食行为和情绪。

实施例1

材料和方法

E.Coli K12培养和蛋白质提取

在研究中使用的细菌菌株是E.Coli K12，其由法国鲁昂大学的UMR6270CNRS实验室提供。在37℃下在250ml Luria Bertani(LB)培养液(MP Biomedicals,lllkirch,France)中培养E.Coli K12 24小时。如Marti等(PLoS ONE 2011,e26030)所述进行蛋白质提取。简言之，通过在4℃在4000g下离心30分钟收获细菌，将所得沉淀重悬在提取缓冲液(300mM NaCl和20mM Tris-HCI,pH 8)中。通过超声(3x 3min，在21％振幅脉冲开1s关1s)破坏悬液，并且在4℃在10000g下离心10分钟。回收上清液并在60000g在4℃下超离心45分钟以进一步将蛋白质分离进细胞质(上清液)和包膜(沉淀)级分。使用2-D Quant试剂盒(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)测量蛋白质浓度。

二维聚丙烯酰胺凝胶电泳

对于二维(2D)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，将400μg E.coli K12蛋白质提取物添加到等电聚焦缓冲液(7M尿素,2M硫脲和0.5％两性电解质，pH 4-7,20mM DTT,2mM TBP,2％CHAPS和0.005％溴酚蓝)，并在轻微摇晃下在室温下溶解60分钟。使用ReadyStrip IPG试条(18cm,pH 4-7NL,Bio-Rad,Marnes-la-Coquette,France)进行第一维凝胶分离。用等电聚焦缓冲液被动再水化试条24小时后，将蛋白质样品通过放置在距阴极1.5cm处的进样杯添加到试条。用Ettan IPGphor 3系统(GE Healthcare,Orsay,France)以以下4个步骤进行等电聚焦(31 500Vh)：500V 1h，1000V梯度，10 000V梯度和10 000V 2h。在分别用2％DTT和2.5％碘乙酰胺进行两个平衡步骤后，在Ettan Daltsix垂直电泳系统(GE Healthcare)上以每凝胶12mA进行第二维，即SDS-PAGE(10％聚丙烯酰胺凝胶,20cm x 18-cm x 1mm)。在SDS-PAGE后，在室温下在2％(vol/vol)正磷酸和50％(vol/vol)甲醇中固定2D凝胶2小时。然后用水清洗凝胶，通过CBB G-250(Bio-Rad)染色(34％(vol:vol)甲醇,17％(wt:vol)硫酸铵,2％(vol:vol)正磷酸和0.66g CBB G-250/升)使蛋白质点可视化。

免疫印迹

2D-PAGE之后，通过干转方法(Trans Blot Cell,Bio-Rad,USA)和0.8mA.cm^-2膜体积的恒定电流经2小时将E.coli细胞质蛋白转移到Hybond-ECL PVDF膜(GE Healthcare)。转移后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS；10mmol.l^-1Tris,pH 8,和150mM.l^-1NaCl)和0.05％(vol:vol)Tween 20中的5％(wt:vol)乳(Regilait,France)封闭膜。清洗后，在4℃下用多克隆兔抗α-MSH IgG(1:1000,Peninsula Laboratories,San Carlos,CA,USA)孵育膜过夜，然后清洗，用多克隆猪抗兔辣根过氧化物酶缀合的Ig(1:3000；Dako,Trappes,France)孵育。通过ECL检测系统(GE Healthcare)显示免疫印迹，用通过使用灰度标记(Kodak)预先校准的ImageScanner II(GE Healthcare)扫描，并用Labscan 6.00软件(GE Healthcare)数字化。在用10^-6Mα-MSH肽(Bachem AG,Bubendorf,Switzerland)吸附兔抗α-MSH IgG后在4℃下进行相同过程过夜。

蛋白质鉴定

将感兴趣的蛋白质点使用Ettan Spot Picker(GE Healthcare)从CBB G-250染色的2D凝胶切出，在Ettan Digester(GE Healthcare)上进行自动化凝胶中蛋白质消化。然后将蛋白质提取物重悬在10μl 5％(vol:vol)乙腈/0.1％(vol:vol)甲酸中，然后用偶联配备有纳米喷雾源和HPLC芯片块界面的6340离子阱质谱仪的纳米-LC1200系统(AgilentTechnologies,Courtaboeuf,France)进行分析。简言之，在40-nl RPC18捕获柱上对肽进行富集和脱盐，在Zorbax(30-nm孔径,5-μm粒径)C18柱(43mm长x 75μm内径；AgilentTechnologies)上分离。使用400nl.min^-1流速的9分钟线性梯度(3-80％乙腈在0.1％甲酸中)，在离子阱质谱仪上分析洗脱物。对于蛋白质之鉴定，提取MS/MS峰列表并使用MASCOTDaemon 2.2.2版本(Matrix Science)搜索引擎与蛋白质数据库相比较。使用以下具体参数进行搜索：酶特异性，胰蛋白酶；允许一个切割缺失；没有固定的修饰；可变修饰，甲硫氨酸氧化，半胱氨酸脲基甲基化，丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸磷酸化；单一同位素；肽电荷2+和3+；前体离子的质量耐受，1.5Da；片段化的质量耐受，0.6Da；ESI-TRAP作为仪器；分类学，E.coli；国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(NCBInr 20120531(18280215序列,6265275233残基)；Bethesda,MD,USA)。如果蛋白质命中满足以下标准之一则自动确认：鉴定有至少2个具有454的MASCOT评分(Po0.01)的排名高的肽(红粗体)或至少两个具有447的MASCOT评分(Po0.05)的排名高的肽。为了评估假阳性率，使用MASCOT的“假目标”选项进行所有初始的数据库检索。如果假阳性率从未超过1％，则认为结果相关。

从OFFGEL鉴定蛋白质

使用OFFGEL pH3-10试剂盒(Agilent Technologies)在3100OFFGEL分级器上将E.Coli K12蛋白高分辨地分离成24个级分。根据Agilent快速入门指南中描述的实验方案进行蛋白质样品(400μg)制备和所有OFFGEL系统部件的组装。使用标准程序OG24PRO采用最大限量的电流参数(8000V,50μΑ和200mW)进行OFFGEL分级，直至30小时后达到64KVh。在实验结束时，将所有级分转移到0.8ml深孔(Thermo Fisher Scientific,lllkirch,France)并在-20℃下储存。如下研究从OFFGEL的中央部分回收的9个含蛋白质的级分，使用兔抗α-MSH IgG(Peninsula Laboratories)进行western印迹然后如上所述进行蛋白质鉴定。

小鼠中的免疫和行为

根据美国国立卫生院指南和EU规范进行所有实验流程，伦理学会委员会批准了动物实验。使两月龄雄性C57Bl6小鼠(Janvier Laboratories,L'Arbresle,France)适应动物设备1周，其中进行12小时的明暗循环，在0700小时开灯并且各被饲养在标准小鼠笼(n＝8)中。小鼠用标准颗粒鼠食(RM1饮食,SDS,UK)喂养并自由取食，饮用水不限量，每日通过轻柔抓握进行操作并测量体重。在适应期间，将小鼠分配到4个笼中，以使每个笼具有相似的平均体重/小鼠。在1周的适应后，将每个笼的小鼠分配到4个实验组之一并接受以下处理：(i)组1,ClpB免疫(n＝8):ClpB蛋白(Delphi Genetics,Gosselies,Belgium)50μg/小鼠，在200μl 1:1(vol:vol)的PBS与完全弗氏佐剂(Sigma,St Louis,MO,USA)中,腹膜内(i.p.)；(ii)组2,佐剂注射对照(n＝8):200μl的PBS中的完全弗氏佐剂(1:1(vol:vol),i.p.)；(iii)组3,PBS注射对照(n＝8):200μl PBS(i.p.)；和(iv)组4,未处理对照(n＝8):未接受注射，然后所有小鼠被返回其笼中。15天后，小鼠接受加强免疫和以下处理：(i)组1(n＝8),ClpB蛋白(Delphi Genetics)50μg/小鼠，200μl 1:1(vol:vol)的PBS与不完全弗氏佐剂(Sigma)i.p.；(ii)组2(n＝8):200μl的PBS中的不完全弗氏佐剂(1:1(vol:vol),i.p.)；(iii)组3,(n＝8):200μl的PBS(i.p.)；和iv)组4,(n＝8):未接受注射。加强后第二天，将小鼠单独放置在BioDAQ小鼠笼(Research Diets,Inc.,New Brunswick,NJ,USA)，每个笼配备有自动喂食监控器。自由获取食物(Serlab,Montataire France)和饮用水，并每天测量体重。在适应BioDAQ笼3天后，小鼠接受以下处理：组1、2和3(各n＝8)(即分别已经用ClpB免疫、被注射佐剂和PBS的小鼠)全部在1000小时时接受100μl PBS中100μg.kg^-1体重的α-MSH肽(BachemAG)急性注射(i.p.)。对照小鼠(n＝8)仅接受PBS(i.p.)。持续监控喂食数据并使用BioDAQdata viewer 2.3.07(Research Diets)进行分析。对于餐食模式分析，餐食间间隔被设置为300s。

在喂食研究后，将小鼠置于各个自由获取食物和水的小鼠笼，在接连2天中进行的O-迷宫(Med Associate,Inc.,St Albans,VT,USA)测试中分析自主运动和焦虑。在O-迷宫测试2小时后，通过截端机断头处死小鼠并将躯干血收集到含EDTA的管中。通过在4℃下在3500r.p.m.(1.4g)离心10分钟分离血浆，并在测定前在-80℃储存。

自主运动和焦虑测试

在BioDAQ笼中的喂食研究后，使用Versamax动物运动监测器(AccuScanInstruments,Inc.,Columbus,OH,USA)分析小鼠的自主运动。自主运动测试后的第二天，在升高的O-迷宫中检测所有小鼠的焦虑。升高的O-迷宫是更常见的被药理学验证用于啮齿动物的焦虑测试的升高十字形迷宫的变形。O-迷宫的优势是其没有传统十字形迷宫的界限模糊的中央广场。O-迷宫由在地面之上升高了80cm的圆形红外线平台(外直径120cm)组成，具有由灰色塑料制成的两个开放区段和两个封闭区段。封闭区段由延伸到高于迷宫表面20cm的墙封闭，并用黑色的红外线胶质玻璃盖覆盖。通过将小鼠置于两个封闭区段之一来起始每个测试。测试持续5分钟，用放置在O-迷宫上方的录像机和EthoVision录像追踪软件(Noldus IT,Wageningen,The Netherlands)记录。分析在开放和封闭区段中测量的行走的距离和花费的时间。在每次小鼠测试之间，用30％乙醇清洁O-迷宫。

ClpB和α-MSH自身抗体测定

根据公开的实验流程(Fetissov SO.,Methods Biol Mol 2011)使用酶联免疫吸附测定测量与ClpB、α-MSH和促肾上腺皮质激素反应的自身抗体的血浆水平。简言之，在4℃下在pH 9.6的100mM NaHCO₃缓冲液中使用100μl和2μg/ml浓度的ClpB蛋白(DelphiGenetics)、α-MSH或促肾上腺皮质激素(Bachem AG)包被96孔Maxisorp平板(Nunc,Rochester,NY,USA)72小时。用pH 7.4的PBS中0.05％Tween 200清洗平板(5分钟3次)，然后用在PBS中1:200稀释的100μl小鼠血浆孵育在4℃过夜以确定游离自身抗体水平，或用在pH8.9的解离3M NaCl和1.5M甘氨酸缓冲液中1:200稀释的100μl小鼠血浆以确定总自身抗体水平。清洗平板(3次)并用100μl碱性磷酸酶(AP)-缀合的山羊抗小鼠IgG(1:2000)或抗小鼠IgM(1:1000)(全部来自Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.(West Grove,PA))孵育。清洗(3次)后，加入100μl对硝基苯磷酸缓冲液(Sigma)作为AP底物。在40分钟室温下孵育后，通过加入3N NaOH停止反应。使用读板器Metertech 960(Metertech Inc.,Taipei,Taiwan)在405nm测定光密度。从样品OD值中减去读自未添加血浆样品的空白光密度值。每个测定一式两份地进行。一式两份的值之间的变化小于5％。使用相应抗人IgG或IgM AP缀合的抗体(1:2000,Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)采用类似的方案测量人血浆(1:400)中的抗ClpB IgG和IgM。

用α-MSH吸附ClpB抗体

通过用10^-6Mα-MSH肽(Bachem AG)预孵育以1:400在PBS中稀释的人血浆样品或以1:200在PBS中稀释的小鼠血浆样品在4℃下过夜，之后将样品添加至包被有ClpB蛋白(Delphi Genetics)的96孔Maxisorp平板(Nunc)。通过酶联免疫吸附测定使用相应的抗小鼠或抗人AP缀合抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)如上所述检测与ClpB反应的IgG和IgM抗体。与α-MSH交叉反应的抗ClpB抗体的百分比可以相对于等于100％的在各个血浆样品中无吸附的抗ClpB抗体的水平计算。

从血浆纯化IgG

根据公开的实验流程(Legrand等,Protoc Exch 2014,doi:10.1038/protex2014.004)进行IgG纯化和亲和测定。通过血浆酸化和在C18SEP柱(PhoenixPharmaceuticals,Burlingame,CA,USA)上分离进行血浆球蛋白的提取，然后将500μl小鼠血浆与500μl缓冲液A(水中的1％三氟乙酸)混合。通过在1ml缓冲液B(60％乙腈在1％三氟乙酸中)中在700r.p.m.下离心3分钟并用3ml缓冲液A洗涤3次来活化柱。将稀释的血浆(缓冲液A中1:1)添加到柱中，并保存(在-20℃下冷冻)流出液(1ml)用于进一步纯化IgG。使用Melon凝胶试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL,USA)从小鼠血浆样品的流出液中纯化总IgG。在试剂盒的纯化缓冲液中以1:4稀释血浆流出液，并添加到在柱中沉积的经洗涤melon凝胶。在6000r.p.m.旋转柱1分钟，保留含有IgG的流出液并保存在-20℃，然后冻干。将冻干的IgG在HBS-EP缓冲液(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)中重构。对于环状单磷酸腺苷(cAMP)实验，将从ClpB和从佐剂对照组的8只小鼠中纯化的IgG分别合并成两种合并物，并将其分成两部分。直接在cAMP测定中使用一部分，使用包被在经活化UltraLink珠(Pierce,Rockford,IL,USA)上的α-MSH(Bachem AG)的亲和色谱进一步纯化另一部分。保存耗尽α-MSH IgG的IgG流出液，冻干并在PBS中稀释。

亲和动力学测定

在BIAcore 1000仪器(GE Healthcare)上通过基于表面等离子共振现象的生物特异性相互作用分析来测定小鼠IgG对ClpB和α-MSH的亲和动力学。α-MSH(Bachem AG)或ClpB蛋白(Delphi Genetics)在pH 5.0的10mM乙酸钠缓冲液(GE Healthcare)中被稀释至0.5mg.ml^-1，通过使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将其共价偶联到感应器芯片CM5(GEHealthcare)。在相同的α-MSH或ClpB包被芯片上进行所有测量。对于亲和动力学分析，使用各IgG样品的5种连续稀释物来进行多循环方法：3360,1680,840,420和210(nmol)，其中包括一式两份的840nmol和空白样品(仅HBS-EP缓冲液)。每个循环包括在25℃下2分钟的分析物注射和5分钟的解离，流速为30μl.min^-1。

在各样品注射之间，用10mM NaOH再生结合表面，使得感应谱具有相同的基线水平。使用BiaEvaluation 4.1.1程序(GE Healthcare)分析亲和动力学数据。对于拟合动力学数据，使用Langmuir's 1:1模型，通过减去空白值来校正样品值。

体外cAMP测定

使用慢病毒转导技术产生的表达人MC4R的人胚胎肾-293细胞的稳定细胞系购自Amsbio(Oxon,UK)。在Amsbio和我们自己的实验室中通过逆转录PCR验证了转染细胞中MC4RmRNA的高表达。通过在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白来在每次实验前确认细胞中转基因的存在，所述绿色荧光蛋白基因用MC4R慢病毒载体插入在相同细胞中但在不同的启动子下。将α-MSH肽(Bachem AG)在诱导缓冲液(PBS,500μΜIBMX,100μΜRO 20-1724(Sigma),20mM MgCl2)中稀释到终浓度分别为2、1、750、500、250、100、75、50和10nM，分别对应于0.6、3、4.5、6、15、30、45、60和120pmol的α-MSH剂量，还包括了一个空白样品。在解冻后，在250ml组织培养烧瓶(BD-Falcon,Beckton-Dickinson,Bedford,MA,USA)中在补充有(2mM L-谷氨酰胺,10％胎牛血清,0.1mM非必需氨基酸和1％青霉素-链霉素)的Dulbecco's经修改Eagle培养基4.5g.l^-1葡萄糖(Eurobio,Courtaboeuf,France)中，在37℃,5％CO₂下在加湿细胞培养孵育器中培养细胞8-10天。在实验当天，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Sigma-Aldrich)处理培养的MC4R人胚胎肾-293细胞，将细胞沉淀重悬在未经处理的生物发光白96微孔板(Nunc,Roskilde,Denmark)PBS中以获得5000细胞/孔(10μl)。使用生物发光测定cAMP-Glo Max测定试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)根据制造商的说明书测量cAMP产生。简言之，用不同浓度的单独的α-MSH肽或α-MSH和来自ClpB免疫或佐剂对照组的小鼠IgG合并物(在临加入α-MSH之前加入)在室温下孵育细胞15分钟。在相同的微孔板中测定cAMP标准品(由试剂盒提供)的系列稀释物。将cAMP检测溶液添加到每个孔，然后通过搅拌均化细胞，在1000r.p.m.离心2分钟，然后在23℃下孵育20分钟。在每孔中添加Kinase-Glo试剂底物，在23℃下孵育10分钟后，用生物发光仪(Safas Spectrometer,Monaco)读出生物发光。在独立的孔中进行每个稀释的三个测试，并且在分别的两天进行重复，使得在使用天然IgG时cAMP活化曲线的每个点n＝6。在从抗α-MSH IgG级分耗尽天然IgG后，如上所述用各α-MSH浓度和IgG进行相同的实验。

小鼠中的E.coli管饲

使1月龄的雄性C57Bl6小鼠(Janvier Laboratories)适应动物设备1周，并且如上所述喂养。将小鼠分配到如下4个组(每组n＝8)中，(i)用108E.coli K12细菌管饲；(ii)用108ClpB缺陷E.coli K12细菌管饲；(iii)仅用LB培养基管饲；和(iv)未接受任何处理的对照。在Bernd Bukau的实验室(ZMBH,海德堡大学,海德堡,德国)产生ClpB突变菌株，AxelMogk博士善意提供了相应的野生型(WT)E.coli细菌。将小鼠单独放置在BioDAQ笼(Research Diets)中并且每天在开始暗阶段之前经胃管饲具有或不具有细菌的0.5ml培养基，持续21天。管饲后，通过断头法杀死小鼠并将躯干血液收集到含EDTA的管中。通过在4℃在3500r.p.m.(1.4g)离心10分钟分离血浆，并在测定前储存在-80℃。抗ClpB和抗α-MSHIgG和IgM的血浆水平如上所述测定。

ClpB DNA测定

从WT和ClpB突变菌株的培养物中提取DNA并使用QIAamp^R DNA Stool Mini Kit(QIAGEN,France)从小鼠粪便纯化DNA。将细菌溶解在水中并在100℃下煮5分钟，在11,000r.p.m.下离心1分钟后，将含有DNA的上清液储存在-20℃。使用NCBI引物设计工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)，我们设计了扩增编码含有一个经鉴定α-MSH样表位的ClpB蛋白片段的180bp DNA区域的以下核苷酸引物(图1e)，正向5'-GCAGCTCGAAGGCAAAACTA-3'(SEQ ID NO:4)和反向：5'-ACCGCTTCGTTCTGACCAAT-3'(SEQ IDNO:5)(Invitrogen Custom Primers,Cergy Pontoise,France)。在具有MicroAmp管(Eppendorf,Hambourg,Germany)的热循环仪中进行PCR。反应在含有25μl Go Taq GreenMaster Mix 2X(Promega)、1μl(20pmol)各引物、21μl双蒸水和1μl细菌DNA的50μl体积中进行。PCR条件如下：94℃ 3分钟，然后35个循环的94℃ 30s，60℃ 30s和72℃ 1.5min。在1％琼脂糖凝胶(Sigma)上可视化PCR产物，具有预期大小180bp，使用ClpB突变菌株确认了特异性。

细菌ClpB蛋白的血浆浓度

根据以下实验流程使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量细菌ClpB的血浆浓度。在4℃下在pH 9.6的100mM NaHCO₃缓冲液中使用100μl和2μg/ml浓度的兔多克隆抗ClpB IgG(从Delphi Genetics(Gosselies,Belgium)定制生产)包被96孔Maxisorp平板(Nunc,Rochester,NY)24小时。用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中0.05％Tween 200清洗平板(5分钟3次)。将作为标准的从Delphi Genetics定制生产的重组ClpB蛋白在相同的缓冲液(PBS,叠氮化钠0.02％,pH 7.4)中系列稀释为5、10、25、50、70、100和150pM，并一式两份添加到孔中。将来自患有进食障碍的患者和健康对照(1:25在样品缓冲液中)的血浆样品一式两份添加到剩余孔中，在室温(RT)下孵育ClpB标准和血浆样品2小时。用具有0.05％Tween200的pH 7.4的PBS清洗板(5分钟3次)。将从Delphi Genetics定制生产并且经预筛选与α-MSH没有交叉反应性的小鼠单克隆抗ClpB IgG(1:500在样品缓冲液中)添加到孔中，在室温下孵育90分钟。用具有0.05％Tween 200的pH 7.4的PBS清洗板(5分钟3次)。将来自JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc.(West Grove,PA)的碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG(1:2000在样品缓冲液中)添加到孔中，在RT下孵育90分钟。用具有0.05％Tween 200的pH 7.4的PBS清洗板(5分钟3次)，然后加入100μl对硝基苯磷酸缓冲液(Sigma,St.Louis,MO)作为碱性磷酸酶的底物。在40分钟室温下孵育后，通过加入3N NaOH停止反应。使用读板器Metertech 960(Metertech Inc.,Taipei,Taiwan)在405nm测定光密度(OD)。从样品OD值中减去读自未添加血浆样品或ClpB蛋白标准稀释液的平板的空白OD值。基于ClpB标准曲线的OD计算ClpB的血浆浓度并根据血浆稀释度调整。

统计分析

使用GraphPad Prism 5.02(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)分析数据和作图。通过Kolmogorov-Smirnov检验评估正态性。根据正态性结果，通过变异分析或无参数Kruskal-Walli检验和分别的Tukey's或Dunn's事后检验分析组的差异。使用双向重复测量变异分析和Bonferroni事后检验分析体重变化。根据正态性结果，使用Student's t检验或Mann-Whitney检验比较各个组。使用成对t检验分析ClpB抗体吸附α-MSH的效果。根据变量的正态性计算Pearson's或Spearman's相关系数。使用非线性回归拟合((log(α-MSH)相对于归一化cAMP应答)分析cAMP产生，方程为Y＝100/(1+10(LogEC50-X)xHillSlope。以平均值±s.e.m.显示数据，对于所有检验，认为Po0.05具有统计显著性。

结果

细菌α-MSH模拟物的蛋白质组鉴定

为了鉴定分子模拟α-MSH的细菌蛋白质，开发了基于蛋白质组技术的研究策略。从E.coli K12培养物提取总蛋白，通过2D凝胶电泳(图1a)解析细胞质级分，并转移到聚二氟乙烯膜。为了增加在细菌蛋白中检测多个α-MSH样表位的可能性，用多克隆抗α-MSH IgG检测膜。发现了13个免疫阳性蛋白质点(图1b)，其中在用10^-6Mα-MSH预吸附抗体后点1-8消失(图1c)，证实了特异性α-MSH模拟表位。使用质谱，将显示最强α-MSH样染色的蛋白质点1、2、3和4鉴定为名为ClpB的热休克蛋白的同种型，其为857个氨基酸的蛋白，857氨基酸蛋白质解聚伴侣或ClpB，MW 95526(分子量:95526Da,登录号:NP_417083.1,SEQ ID NO:1)。染色强度较低的α-MSH样点5-8(最高MASCOT评分分别为880、877、874和800)是548个氨基酸的蛋白伴侣素GroEL(分子量:57293Da；登录号:YP_001732912.1)。还使用了E.coli蛋白质分离的替代性策略，使用OFFGEL分级器然后进行一维凝胶电泳和用预吸附或未预吸附α-MSH的抗α-MSH IgG进行western印迹(数据未显示)。一条带被抗α-MSH IgG特异性识别，发现其含有ClpB蛋白(最高MASCOT评分1065)。基于这些结果，ClpB被选择为进一步验证其对α-MSH的分子模拟的目标蛋白。为了分析α-MSH和细菌ClpB之间的氨基酸序列同源性，在使用Needleman-Wunsch算法(http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)的Emboss Stretcher程序中比对两条序列。该比对揭示了与α-MSH显示不连续的5个氨基酸的序列同源性的ClpB蛋白位点(图1d)。该推定α-MSH样表位位于ClpB蛋白结构的螺旋间环上，暗示其暴露于蛋白质表面，即，对于自身抗体的结合是可及的。使用抗α-MSH IgG测定的重组ClpB蛋白的western印迹显示了96kDa的条带(图1e)，证实了ClpB蛋白含有α-MSH样表位。这些结果证明了根据分子模拟的概念存在至少连续5个氨基酸的序列同源性不是细菌蛋白被与神经肽交叉反应的IgG识别的必需条件。

用ClpB免疫小鼠

为了研究E.coli ClpB是否可以诱导与α-MSH交叉反应的自身抗体从而影响喂食和焦虑，用重组细菌ClpB蛋白免疫小鼠。接受ClpB与佐剂或单独的佐剂的小鼠在注射后几天显示较低体重(图2a)。但是，4周之后，ClpB免疫的小鼠相对于对照具有更高的体重(+5％)(图2a)。在ClpB免疫的小鼠中，相较于其他组在试验的最后10天期间测量的平均日食物摄入也更高(+13％)(图2b)。食物摄入的该增加是由于餐食量的增加(图2c)，因为用餐数没有改变(图2d)，这表明ClpB免疫干扰饱腹感而非饥饿机制。这与α-MSH诱导饱腹感的已知作用相符合。为了进一步确认ClpB免疫与α-MSH厌食作用的相关性，使小鼠接受i.p.注射的α-MSH。在接下来的24小时中，ClpB免疫小鼠的食物摄入和体重没有被影响(图2e)，表明它们对于施用的在未免疫小鼠中存在的α-MSH的厌食作用不敏感。在喂食试验后，在开放场和O-迷宫测试中研究了小鼠的主动运动和焦虑。在试验组之间在开放区域相比于边缘区域的总主动运动和花费的时间没有显著区别(数据未显示)。然而，在O-迷宫的封闭臂中，ClpB免疫小鼠相比于对象移动了更短距离(数据未显示)，与所有其他组相比花了更短的时间(数据未显示)，这表明焦虑的降低。为了证实免疫效果，测定了抗ClpB的血浆水平，测量了其亲和力。在ClpB免疫的小鼠中，发现抗ClpB IgG水平(图2f)的很大升高且具有较低亲和力(图2g)，这与最近的IgG诱导相符合。还在ClpB免疫小鼠中发现了α-MSH反应性IgG的血浆水平提高(图2h)；这些IgG也被类似地表征为与对照相比对α-MSH亲和力较低(图2i)。用α-MSH吸附小鼠血浆显著地降低了抗ClpB IgG的血浆水平，证实抗ClpB IgG的一部分但非全部与α-MSH有交叉反应性(图2f)。α-MSH IgM自身抗体的血浆水平在组之间没有显著差异(数据未显示)。还分析了ClpB免疫是否可以诱导与肾上腺皮质激素(含有α-MSH序列的39个氨基酸的肽)交叉反应的自身抗体。没有发现血浆肾上腺皮质激素反应性IgG的显著差别(数据未显示)，证明ClpB和α-MSH之间的构象模拟的选择性。

小鼠IgG对MC4R信号转导的作用

为了确定ClpB免疫诱导的α-MSH交叉反应性IgG对MC4R信号转导的影响，研究了其在表达MC4R的细胞中对α-MSH诱导的cAMP产生的作用。与单独α-MSH或用来自佐剂注射小鼠的IgG预孵育的α-MSH相比，用来自ClpB免疫小鼠的IgG预孵育α-MSH时发现cAMP浓度更低。在两个最高的α-MSH浓度有8-10％的降低(图2j)。在从合并的IgG中耗尽α-MSH反应性IgG后，来自ClpB免疫小鼠的剩余IgG没有对α-MSH诱导的cAMP释放显示任何作用(图2k)，表明ClpB免疫小鼠中的抗α-MSH交叉反应性IgG负责降低响应于α-MSH的cAMP产生。从而，MC4R激活和信号转导的降低可导致在ClpB免疫小鼠中观察到的增加的食物摄入和降低的焦虑。

在小鼠中经胃递送E.coli

为了测试E.coli是否可以诱导针对ClpB蛋白的免疫原性应答并导致产生与α-MSH交叉反应的抗ClpB自身抗体，在3周期间通过经胃管饲每日给予小鼠WT和ΔClpB E.coliK12菌株。另一组小鼠仅用细菌培养基管饲，对照组没有接受任何处理。在管饲的第一天，接受WT E.coli的小鼠中体重和食物摄入降低，然后逐渐回升至对照水平(图3a和b)。同样，在管饲的最后一周，在接受E.coli WT的小鼠中喂食模式受到影响，显示餐食量的降低和进餐数的增加(图3c和d)。显著地，接受ΔClpB E.coli的小鼠在体重增加、食物摄入或喂食模式方面在任何时间点均未与对照有显著差异。这些数据证实了细菌ClpB特异性参与了E.coli感染后宿主食物摄入的急性降低以及喂食模式的长期调节。意料到的是，在接受E.coli WT的小鼠粪便中ClpB DNA更多，尽管在一些对照小鼠中也检测到了低水平的ClpB DNA(图3e)。在3周的管饲后，抗ClpB IgM和IgG的血浆水平在接受E.coli WT的小鼠中相比于对照和ΔClpB E.coli组升高(图3f和g)。用α-MSH吸收血浆降低了E.coli WT管饲小鼠中的抗ClpB IgG水平(图3g)，表明存在与α-MSH交叉反应的抗ClpB IgG。有趣的是，IgM类的抗ClpB自身抗体的血浆水平在用α-MSH吸收后升高，表明α-MSH引起与在E.coli WT管饲小鼠中升高的ClpB交叉反应的α-MSH IgM免疫复合体的解聚(图3f)。与所有其他组相比，抗α-MSHIgM的血浆水平也被E.coli WT递送提高(图3h)，而抗α-MSH反应性IgG仅稍有提高而没有达到显著(图3i)。但是，E.coli管饲小鼠中α-MSH IgG的亲和动力学分析显示了较低的解离平衡常数值(图3j)，结合或解离率没有显著改变(数据未显示)。包括IgM类别α-MSH反应性自身抗体的水平升高在内的这些改变可能反映针对ClpB的如同新抗原的免疫应答。实际上，没有接受E.coli WT的小鼠粪便中ClpB DNA的水平低或不能检测暗示表达ClpB的微生物在所研究小鼠中不是主要的肠共生物。因此，ClpB免疫小鼠显示水平增加的低亲和力抗α-MSHIgG与餐食量增加和体重增加，与其不同，E.coli管饲小鼠显示亲和力增加的抗α-MSH反应性IgM和IgG二者的产生增加以及餐食量和体重降低。

ED患者中的抗ClpB抗体

由于确认了E.coli ClpB蛋白刺激α-MSH交叉反应性自身抗体产生的能力，然后通过研究患有AN、BN或BED的患者中的抗ClpB抗体来确定细菌ClpB与ED的相关性。发现抗ClpBIgG和IgM二者在ED患者以及健康对象的血浆中容易检测到，其平均水平没有显著差异(图4a和b)。然而，在所有研究组中差异很大，这表明遭遇ClpB样抗原的个人史不同。为了确认人抗ClpB抗体是否类似地与α-MSH交叉反应，用10^-6Mα-MSH吸附血浆样品，导致在所有研究组中抗ClpB IgG和IgM的可检测水平显著下降(图4c和d)。此外，相对于健康对照，α-MSH交叉反应性抗ClpB IgG的相对水平在所有三组ED患者中增加，特别是BN和BED(图4e)。相比于BN，在AN中发现了升高水平的α-MSH交叉反应性抗ClpB IgM(图4f)。为了进一步确定抗ClpBIgG和IgM与ED的相关性，研究了其血浆水平是否可与ED患者和对照中通过EDI-2测量的行为特性相关。发现在对照中，ClpB IgG与几种心理特性的正常范围反相关，但在AN患者中，ClpB IgG水平与核心精神病理学特性正相关，例如对身体不满意和追求清瘦(表1)。此外，在AN和BED患者中，EDI-2亚标度评分与ClpB IgM以相反的方式相关，在AN中反在BED中正(表1)。然而，在BED患者中，ClpB IgM水平与年龄反相关，提示最高抗ClpB IgM水平与疾病的急性形式相关。值得注意的是，在AN患者中发现的ClpB IgG或IgM与追求清瘦或不信任他人之间的联系非常类似在之前的研究中在不同的AN患者组中发现的相同心理特性与α-MSH反应性IgG或IgM之间的联系。

表1.通过饮食障碍量表-2测定的饮食障碍患者和对照(Contr.)的心理特性和抗ClpB IgG和IgM血浆水平之间的显著关联。所有Spearman's r*p<0.05,**p<0.01，除了对于完美主义Pearson's r*p<0.05(n＝65Contr.,n＝27AN,和n＝14BED)。

细菌ClpB蛋白的血浆浓度

在所有研究对象的血浆样品中检测的ClpB蛋白为10pM至180pM，在健康对照中平均水平约30pM。在患有饮食障碍的患者的所有组中ClpB的平均血浆水平显著升高，包括AN、BN和BED(参见图5)。通过采用等于或超过2标准偏差的诊断相关浓度改变的通常标准，21.7％的AN、32％的BN和25％的BED患者显示升高的血浆ClpB水平。

结论

这些结果揭示了表达ClpB的肠细菌通过产生ClpB蛋白和与α-MSH交叉反应的抗ClpB抗体与有动机行为和情绪的调节之间有分子联系。其证明肠微生物群的特定改变可导致如在ED患者中观察到的行为和情绪异常。ED患者中ClpB蛋白和与α-MSH交叉反应的抗ClpB IgG的水平升高和抗ClpB抗体与患者精神病理学特性的相关性的发现证明了表达ClpB的微生物参与提高ClpB抗体产生和建立异常喂食行为和情绪。

总之，所述结果将ClpB鉴定为导致与ED患者的精神病理学特性相关的与α-MSH交叉反应的自身抗体的起源的蛋白，从而将表达ClpB的微生物鉴定为诊断和治疗ED的新特异性靶标。

Claims

1.一种用于治疗或预防饮食障碍的组合物，其包含针对至少一种表达ClpB蛋白的细菌的至少一种抗生素。

2.一种调节对象的食欲的非治疗方法，其包括，向所述对象施用有效量的组合物，所述组合物包含针对至少一种表达ClpB蛋白的细菌的至少一种抗生素。

3.一种治疗对象的饮食障碍或者降低其发生的可能性的方法，所述方法包括，对有此需要的对象施用组合物，所述组合物包含针对至少一种表达ClpB的细菌的至少一种抗生素。

4.一种用于治疗或预防饮食障碍的组合物，其包含不表达ClpB蛋白的益生菌。

5.一种调节对象的食欲的非治疗方法，其包括，向所述对象施用有效量的组合物，所述组合物包含不表达ClpB蛋白的益生菌。

6.一种作为疫苗或免疫原性组合物使用的组合物，其包含ClpB蛋白。

7.根据权利要求5使用的组合物，其用于针对饮食障碍进行免疫。

8.根据权利要求5或6使用的组合物，其用于预防饮食障碍。

9.一种用于诊断对象的饮食障碍的体外方法，所述方法包括：

c)推断所述对象是否患有饮食障碍。

10.一种将患有饮食障碍的对象选择为对降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗体水平的治疗有应答可能性的体外方法，其包括：

11.根据权利要求9至10中任一项的体外方法，其中步骤a)中ClpB蛋白的水平通过定量所述对象的粪便中的ClpB DNA来测量。

12.根据权利要求1、4或6至8中任一项使用的组合物，根据权利要求2或5的非治疗方法或者根据权利要求9至10中任一项的体外方法，其中所述饮食障碍选自由以下组成的组：神经性厌食症(AN)、神经性贪食症(BN)、暴食症(BED)、过度饮食、食欲过剩、消耗性疾病例如恶病质。

13.一种用于治疗或预防肥胖症的组合物，其包含过表达ClpB蛋白的益生菌。