CN106047904B - 博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因及其应用。首次在博落回基因组中发现3个参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因，包括Mc20113、Mc6407、Mc6408基因。利用酿酒酵母体系验证通过上游前体饲喂分别验证了这几步反应，可实现血根碱与白屈菜红碱以及中间体的合成。本发明还通过酿酒酵母异源表达体系比较了博落回与罂粟同功能基因的转化效率，发现博落回基因的转化效率显著高于罂粟。本发明进一步揭示了血根碱在博落回中合成的分子机制，为高血根碱与白屈菜红碱含量博落回育种提供了理论依据和分子辅助育种目标；同时为血根碱与白屈菜红碱的体外人工合成提供了宝贵经验。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及参与博落回中血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因及其应用。
背景技术
血根碱和白屈菜红碱主要分布在血根(Sanguinaria canadensis L.)、鸦片罂粟(Papaver somniferum L.)、花菱草(Eschscholzia californica Cham.)、白屈菜(Chelidonium majus)、紫堇(Corydalis edulis Maxim)和博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br.)当中。最近二十年以来，血根碱已经在欧洲作为替代抗生素的添加剂来促进动物生长。目前博落回是全世界最主要的血根碱的来源植物，并且被欧洲食品安全局列为动物饲用添加剂。血根碱和白屈菜红碱的合成路径在前期研究中已经得到阐明。相关合成基因已经从鸦片罂粟(Papaver somniferum L.)、花菱草(Eschscholzia californicaCham.)等植物中克隆，但是尚未有任何基因从博落回中克隆。
发明内容
本发明的目的是提供博落回中参与血根碱和白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因及其应用。
为了实现本发明目的，本发明提供博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因，包括基因Mc20113、Mc6407、Mc6408，它们的基因序列分别如SEQ ID No.1-3所示。
所述的博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因编码的蛋白，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID No.4-6所示。
本发明还提供含有上述基因的载体，含有上述基因的工程菌。还有上述基因在血根碱与白屈菜红碱合成中的应用，以及上述基因在血根碱与白屈菜红碱体外合成中的应用。具体应用如下：
基因Mc20113编码博落回中催化网状番荔枝碱生成金黄紫堇碱的小檗碱桥接酶；
基因Mc6407和Mc6408编码博落回中催化二氢血根碱生成血根碱以及催化二氢白屈菜红碱生成白屈菜红碱的二氢苯并菲啶氧化酶。
在之前的研究中，从去甲乌药碱开始的血根碱与白屈菜红碱的合成途径在罂粟等其它物种中已经清晰，2个化合物共24步反应，其中血根碱与白屈菜红碱从去甲乌药碱开始均经过12步反应合成(包括1步不需要酶参与的自发反应)。其中第1步到第5步反应两者的合成酶相同以及第8到第12步反应两者的合成酶相同。为了找到博落回中合成血根碱与白屈菜红碱的合成基因，我们对博落回植株进行De Novo全基因组测序分析，同时对博落回根茎叶花果实进行了转录组测序。首先以其他物种(罂粟，花菱草)中合成血根碱和白屈菜红碱的黄素蛋白氧化酶相关基因为参照基因，在博落回基因组中进行BLAST同源比对，找到了14个合成血根碱与白屈菜红碱的候选基因。由于博落回中的血根碱和白屈菜红碱具有组织特异性，2种生物碱均在果荚中含量最高，而两种生物碱的重要前体化合物原阿片碱和别隐品碱在根部中含量最高，而在茎部组织中生物碱含量极低。因此我们推测参与合成血根碱与白屈菜红碱的功能基因在博落回中的表达规律也应该是根和果荚中高表达，茎中不表达或者表达量极低。根据这种组织表达特异性，我们从14个候选基因中共筛选出4个符合这种表达规律的基因。然后，我们利用酵母表达体系，在酵母中表达这些候选基因，通过分别饲喂每步的上游化合物，再用UPLC-Q-TOF仪来检测酵母提取物。
我们用酵母验证方法验证博落回中参与血根碱和白屈菜红碱的黄素蛋白氧化酶，在通路中共有3步反应属于黄素蛋白氧化酶参与的步骤筛选出的4个基因,分别是Mc20113、Mc6407、Mc6408、Mc6426。我们分别构建好表达这4个基因的酵母后，分别前体饲喂这2步反应的前体化合物网状番荔枝碱、二氢血根碱、二氢白屈菜红碱。之后我们通过UPLC-Q-TOF检测酵母提取物发现在饲喂网状番荔枝碱的表达Mc20113的酵母提取物中检测到了下游产物金黄紫堇碱以及在饲喂二氢血根碱的表达Mc6407、Mc6408的酵母提取物中检测到了下游产物血根碱与白屈菜红碱，而在空白对照酵母组中没有检测到下游产物。因此我们认为Mc20113是博落回中催化网状番荔枝碱生成金黄紫堇碱的小檗碱桥接酶(McBBE)，而Mc6407和Mc6408是博落回中催化二氢血根碱生成血根碱以及催化二氢白屈菜红碱生成白屈菜红碱的二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)。同时，我们还将博落回中催化二氢血根碱和二氢白屈菜红碱生成血根碱和白屈菜红碱的二氢苯并菲啶氧化酶(McDBOX)与罂粟中催化这2步的二氢苯并菲啶氧化酶(PsDBOX)进行效率比较，发现表达Mc6408的酵母中产生的血根碱和白屈菜红碱的量要大于表达Mc6407和PsDBOX的酵母。证明博落回中二氢苯并菲啶氧化酶(McDBOX)具有更高的催化效率。由于Mc6426表达酵母中不产生这3种底物，因此不参与合成血根碱与白屈菜红碱。
本发明首次在博落回基因组中发现参与血根碱与白屈菜红碱合成的3个黄素蛋白氧化酶基因，包括Mc20113、Mc6407、Mc6408。利用酵母体系验证了血根碱和白屈菜红碱合成中黄素蛋白氧化酶参与的3步反应，可实现血根碱和白屈菜红碱的合成。本发明进一步揭示了博落回中血根碱合成的分子机制，为高含量血根碱和白屈菜红碱博落回育种提供了理论依据和分子辅助育种目标，可用于大规模筛选育种材料；同时还为血根碱和白屈菜红碱的体外人工合成提供了宝贵经验，本发明可替代传统的从植物材料中提取血根碱的方法，实现体外合成血根碱。
附图说明
图1为血根碱与白屈菜红碱合成通路图，两个化合物有部分合成通路相同，而本发明是从中间产物乌药碱开始研究，箭头上分别标出黄素蛋白氧化酶参与的步骤共3步反应；图2为本发明通过分析RNA-Seq数据，从博落回基因组中发现与血根碱与白屈菜红碱合成相关的黄素蛋白氧化酶基因的候选基因；
图3为本发明利用UPLC-Q-TOF检测表达Mc20113酵母与空白酵母提取物中参与血根碱与白屈菜红碱合成第5步反应，即网状番荔枝碱至金黄紫堇碱的结果；
图4为本发明利用UPLC-Q-TOF检测表达Mc6407、Mc6408酵母与空白酵母提取物中参与血根碱合成第12步反应即二氢血根碱至血根碱的结果，以及白屈菜红碱合成第19步反应即二氢白屈菜红碱至白屈菜红碱的结果。同时，结果显示表达Mc6408的酵母中产生的血根碱和白屈菜红碱的量要大于表达Mc6407和PsDBOX的酵母。证明博落回中二氢苯并菲啶氧化酶(McDBOX)具有更高的催化效率。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 参与血根碱与白屈菜红碱合成基因的挖掘与获得
1基因的挖掘
由于血根碱与白屈菜红碱在罂粟和花菱草等植物中的合成路径已知(图1)，相关的功能基因也已经得到克隆。我们以其他物种(罂粟、花菱草)已公开在NCBI的合成血根碱与白屈菜红碱的黄素蛋白氧化酶相关基因序列为参照基因，在博落回De Novo全基因组序列中进行BLAST比对，共得到候选基因14条。又由于血根碱与白屈菜红碱在果荚中含量极高，茎中含量极低。前体化合物原阿片碱与别隐品碱在根部含量极高，茎中含量极低。以此为线索，分析博落回根茎叶花果转录组数据(RNA-Seq)从14条候选基因中筛选符合根部和果荚高表达，茎部不表达这一表达模式的基因，共得到4条(图2)。4个黄素蛋白氧化酶基因,分别是Mc20113、Mc6407、Mc6408、Mc6426。
2博落回Mc20113、Mc6407、Mc6408、Mc6426以及用于效率比较的罂粟中PsDBOX(JX390714)基因的获得。
首先制备博落回根部和果荚cDNA文库，罂粟基因来自于人工合成(金唯智公司)，然后利用正向引物和反向引物进行PCR扩增(引物序列见表1)。
表1引物序列(5′-3′)
PCR反应体系以20μl计为：10-20ng/μl模板1μl，10pmol/μl正向、反向引物各1μl，10mmol/L dNTP mix 0.4μl，0.5U/μL高保真Taq DNA聚合酶1μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为水。
PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃2分30秒，35个循环；72℃10分钟。
将扩增得到的片段与pYES2载体(Invitrogen)连接，测序确认没有突变。
实施例2 利用酵母表达系统验证血根碱与白屈菜红碱合成候选基因的功能，比较博落回与罂粟中相关基因的转化效率
将Mc20113、Mc6407、Mc6408、Mc6426、PsDBOX基因分别构建到表达载体pYES2(Invitrogen)上，并转化酵母菌。诱导酵母表达蛋白，然后进行前体饲喂收集酵母,裂解后用甲醇抽提化合物,样品制备好后用UPLC-Q-TOF进行检测。结果分别如图3-图4所示。利用酵母表达系统比较博落回中Mc6407、Mc6408与罂粟中PsDBOX的转化效率(图4)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列说明：
SEQ ID No.1-3分别为Mc20113、Mc6407、Mc6408基因序列。
SEQ ID No.4-6分别为基因Mc20113、Mc6407、Mc6408编码的氨基酸序列。
Claims (10)
1.博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因，基因序列如SEQ IDNo.1所示。
2.博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因，基因序列如SEQ IDNo.2所示。
3.博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因，基因序列如SEQ IDNo. 3所示。
4.博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
5.博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
6.博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示。
7.含有权利要求1-3中任一项所述的黄素蛋白氧化酶基因的载体。
8.含有权利要求1-3中任一项所述的黄素蛋白氧化酶基因的工程菌。
9.权利要求1-3中任一项所述的黄素蛋白氧化酶基因在血根碱与白屈菜红碱合成中的应用。
10.权利要求1-3任一项所述的黄素蛋白氧化酶基因在血根碱与白屈菜红碱体外合成中的应用。
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