CN106011217A

CN106011217A - 基于罗丹明b和氨乙基硫醚的化合物在活细胞成像中的应用

Info

Publication number: CN106011217A
Application number: CN201610335655.3A
Authority: CN
Inventors: 徐冬梅; 洪苗苗
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2016-05-19
Filing date: 2016-05-19
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-05-19
Also published as: CN106011217B

Abstract

本发明公开了基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物在活细胞成像中的应用，该化合物原料易得，合成方法简单，分子结构简单；对Hg²⁺选择性好、灵敏度高；可以检测接近中性的几乎纯水缓冲溶液中的Hg²⁺；可以检测HgCl₂中的Hg²⁺；特别是对活细胞毒性低，可以用于活细胞成像，检测活细胞中的Hg²⁺浓度。

Description

基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物在活细胞成像中的应用

技术领域

本发明属于活细胞成像技术领域，具体涉及一种基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物在活细胞成像中的应用。

背景技术

Hg²⁺是一种极具生理毒性的化学物质，它对人体的危害主要集中在中枢神经系统、消化系统和内脏器官，对呼吸系统、皮肤、血液及眼睛也有一定的影响。Hg²⁺中毒的机理尚未完全清楚，目前被广泛接受的Hg²⁺产生毒性的基础是Hg-S反应。Hg²⁺对生物体内蛋白质和酶中的巯基有高亲和力，一旦与蛋白质中的巯基结合，就会使细胞内许多代谢（如能量的生成、蛋白质和核酸的合成等）受到影响，从而影响细胞的功能和生长。而且Hg²⁺具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性，这使其成为目前全球最引人关注的环境污染物之一。汞离子所带来的健康问题已经促使科学家探索更有效的方法来检测生物体内和细胞样品中的汞。

荧光探针由于操作简单、选择性好、灵敏度高、可以进行原位实时无损检测等优点而在重金属离子检测领域备受关注。罗丹明类荧光探针由于摩尔吸收系数大、荧光量子产率高、吸收和发射波长长等优点而成为荧光探针中最重要的品种。但是目前已报道的罗丹明类荧光探针有些原料难得、结构复杂、合成困难，有些只能在纯有机溶剂（比如无水乙醇）下检测Hg²⁺，尤其是能用于活性胞成像的很少（参见：Xu L, Wang S, Lv YN, Son YA, CaoDR. A highly selective and sensitive photo switchable fluorescent probe forHg²⁺ based on bisthienylethene-rhodamine 6G dyad and for live cells imaging.Spectrochim. Acta Part A 2014; 128: 567-574；Bhalla V, Tejpal R, Kumar M.Rhodamine appended terphenyl: A reversible “off-on” fluorescent chemosensorfor mercury ions. Sens. Actuators B 2010; 151: 180-185；Zhang X, Zhu YY. A newfluorescent chemodosimeter for Hg²⁺-selective detection in aqueous solutionbased on Hg²⁺-promoted hydrolysis of rhodamine-glyoxylic acid conjugate. Sens.Actuators B 2014; 202: 609-614）。因此，研究开发结构简单、合成容易、能应用于生理介质体系（类似缓冲液）的、不对细胞造成损伤的新型罗丹明类Hg²⁺荧光探针非常必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物在活细胞成像中的应用。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物在活细胞成像中的应用。基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物的制备方法为，氮气环境下，有机溶剂中，以罗丹明B和氨乙基硫醚为原料，以乙胺化合物为添加剂，搅拌反应得到基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物；简称为RMTE。

上述技术方案中，有机溶剂为乙腈、乙醇、二氯甲烷中的一种或者几种，本发明公开的溶剂体系有利于原料的分散，增加罗丹明B和氨乙基硫醚的反应性，提高产物收率。

上述技术方案中，添加剂为N,N-二异丙基乙胺；与反应体系具有良好的相容性，有利于提高罗丹明B和氨乙基硫醚的反应性，提高产物收率。

上述技术方案中，反应温度为20～60℃，反应时间为18～36 h；罗丹明B和氨乙基硫醚的摩尔比为1∶(1～7)。优选的，所述添加剂与罗丹明B的摩尔比为7∶1；反应温度为30～50℃，反应时间为20～30 h；罗丹明B和氨乙基硫醚的摩尔比为1∶(3～5)。本发明首次利用氨乙基硫醚改性罗丹明B，在公开的条件下，仅需要一步反应，即可以较高收率得到产物RMTE，取得了意想不到的技术效果。

优选的，在反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，进行柱层析分离，真空干燥后得到基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物。柱层析分离时淋洗液为甲醇/三氯甲烷/石油醚混合液，优选的体积比为甲醇∶三氯甲烷∶石油醚为1∶12∶2。得到的产物RMTE为黄色固体粉末，产率为35.1～54.4%，熔点为167.4℃。

具体合成方法比如，以乙腈，或乙醇，或二氯甲烷为溶剂，N,N-二异丙基乙胺为添加剂，与罗丹明B的摩尔比为7∶1，摩尔比为1∶(1～7)的罗丹明B和氨乙基硫醚，在N₂保护下，在温度为20～60℃，搅拌反应18～36 h，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，进行柱层析分离，淋洗液为甲醇/三氯甲烷/石油醚，1/12/2 (v/v/v)，真空干燥，得到黄色固体粉末目标产物RMTE，熔点为167.4℃，提纯前收率最高到约80%，提纯后产率最高到约55%，达到本领域罗丹明B类化合物的较高收率。

上述基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物，其化学结构式如下：

。

反应方程式可表示为：

通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱分析证实，本发明的基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物对于Hg²⁺具有非常高的灵敏度以及优异的选择性。不但可以从比色和荧光双通道检测Hg²⁺，而且可以有效检测来自于HgCl₂中的Hg²⁺；解决了现有Hg²⁺探针对HgCl₂中的Hg²⁺检测效果差甚至不能检测的缺陷，有效检测来自于HgCl₂中的Hg²⁺更加具有工业实用性。

根据本发明的实施例，发现多种金属离子中只有Hg²⁺可使RMTE在561 nm处的吸光度和在578 nm处的荧光大大增强，其荧光增强达到170倍，众多其他离子对RMTE的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱基本没影响，表明在CH₃CN/HEPES缓冲溶液 (1/99, v/v, pH=7.05)中RMTE对Hg²⁺有很好的选择性和灵敏度；同时表明本发明的基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物适用于接近人体体液体系，克服了现有探针需要在纯有机溶剂中才能检测而无法应用于活体检测的缺陷。

特别的，本发明的基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物对细胞毒性很低，经过含有20、30和40 μM RMTE的培养液培养24 h后细胞存活率分别为98.72 %、94.54 %和96.92 %；这说明RMTE没有对sf-9细胞的存活率产生很大影响。因此RMTE是一个毒性很低的物质，可以在活体细胞中应用，用于活细胞成像。

通过活细胞成像结果可以检测出活细胞中汞离子的含量，比如制备标准Hg²⁺浓度梯度对应的活细胞成像图，作为标准对照，对比待检测活细胞的成像图，可以简易地得出待检测活细胞中Hg²⁺浓度。特别是本发明不仅在接近人体体液的体系中（CH₃CN/HEPES缓冲溶液 (1/99, v/v, pH=7.05)）验证了基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物的高灵敏度与精确性，还验证了基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物的低毒性，这是探针能否应用活细胞检测的关键与基础；很多现有探针虽然在缓冲液体系中可以检测汞离子，但一旦接触细胞则会导致细胞凋亡或者异变，导致无法真正应用到生理活性细胞检测中。因此本发明还公开了基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物在检测活细胞中Hg²⁺中的应用。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有如下优点：

1. 本发明采用一步法，从罗丹明B和氨乙基硫醚出发，简单地合成了一种结构简单的新型罗丹明衍生物RMTE，克服了现有罗丹明B化合物制备需要多步反应（至少两步）、需要毒性很大的原料（氯化亚砜、三氯氧磷等）等一系列缺陷；而且得到的产物提纯简单、收率较高，取得了意想不到的技术效果。

2. 本发明公开的基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物具有很低的细胞毒性，能够用于活细胞成像，根据本发明实施例，经过含有20、30和40 μM RMTE的培养液培养24 h后细胞存活率分别为98.72 %、94.54 %和96.92 %；这说明RMTE没有对sf-9细胞的存活率产生很大影响，因此RMTE是一个毒性很低的物质，可以在活体细胞中应用。

3. 本发明公开的基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物可以从比色和荧光双通道检测Hg²⁺，特别是可以检测HgCl₂中的Hg²⁺，比检测来自Hg(ClO₄)₂的Hg²⁺具有更好的实用性；成功解决了现有罗丹明B类汞离子探针无法检出或者无法准确检出来自HgCl₂中的Hg²⁺的问题，为推进罗丹明B类汞离子探针实用化作出重大贡献。

4. 本发明公开的基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物克服了现有技术需要在大量有机溶剂中甚至在无水乙醇中才能检测汞离子的缺陷，根据本发明实施例，在CH₃CN/HEPES缓冲溶液 (1/99, v/v, pH=7.05，接近人体体液) 中RMTE对Hg²⁺有很好的选择性和灵敏度；取得了意想不到的技术效果。

附图说明

图1为在RMTE的CH₃CN/HEPES缓冲溶液 (1/99, v/v, pH=7.05) 中，加入金属离子前后的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱图；

图2为RMTE检测Hg²⁺的可逆性的荧光光谱图；

图3为RMTE对sf-9细胞的毒性图；

图4为RMTE活细胞成像图；

图5为不同Hg²⁺以及RMTE浓度下活细胞成像图。

具体实施方式

实施例一：Hg²⁺探针RMTE的制备

罗丹明B和氨乙基硫醚的摩尔比为1:3，以二氯甲烷为溶剂，N,N-二异丙基乙胺为添加剂，与罗丹明B摩尔比为7:1，在N₂保护下，在30 ℃条件下搅拌反应20 h，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，得到黄色固体粉末粗产物，产率为49.8%。进行柱层析分离，淋洗液为甲醇/三氯甲烷/石油醚，1/12/2 (v/v/v)，干燥，得到黄色固体粉末目标产物RMTE，产率为35.1%。

核磁，¹H NMR (400 MHz, CDCl₃), δ /ppm: 1.16 (t, 12H, J=6.8 Hz), 2.23(t, 2H, J=8 Hz), 2.50 (t, 2H, J=6.4 Hz), 2.77 (t, 2H, J=6.4 Hz), 3.27–2.37 (m, 10H), 3.66 (s, 2H), 6.27 (d, 2H, J=6.4 Hz), 6.37 (d, 2H, J=2.4Hz), 6.44 (s, 2H), 7.08–7.10 (m, 1H), 7.43–7.46 (m, 2H), 7.89–7.91(m, 1H)，¹³C NMR (300 MHz, CDCl₃), δ /ppm: 12.35, 29.37, 34.71, 40.24, 40.83,44.31, 64.69, 97.34, 105.62, 107.96, 122.63, 123.74, 128.02, 128.89, 131.11,132.33, 148.82, 153.13, 167.90；质谱，LC-MS: [M+H]⁺= 545.2944, [M+Na]⁺=567.2755；红外光谱，FTIR (cm^-1): v(NH) 3431; v(CH₃, CH₂) 2972, 2925, 2854;v(C=O) 1695; v(ArH) 1548, 1519, 1463; v(C-O-C) 1118；元素分析，C₃₂H₄₀N₄O₂S₃(%): 计算值C, 70.55; N, 10.28; H, 7.40，实验值 C, 70.34; N, 10.04;H, 7.42。

实施例二：Hg²⁺探针RMTE的制备

罗丹明B和氨乙基硫醚的摩尔比为1:7，以乙醇为溶剂，N,N-二异丙基乙胺为添加剂，与罗丹明B摩尔比为7:1，在N₂保护下，在40 ℃条件下搅拌反应24 h，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，得到黄色固体粉末粗产物，产率为63.2%。进行柱层析分离，淋洗液为甲醇/三氯甲烷/石油醚，1/12/2 (v/v/v)，干燥，得到黄色固体粉末目标产物RMTE，产率为42.8%。

实施例三：Hg²⁺探针RMTE的制备

罗丹明B和氨乙基硫醚的摩尔比为1:5，以乙腈为溶剂，N,N-二异丙基乙胺为添加剂，与罗丹明B摩尔比为7:1，在N₂保护下，在20 ℃条件下搅拌反应18 h，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，得到黄色固体粉末粗产物，产率为49.8%。进行柱层析分离，淋洗液为甲醇/三氯甲烷/石油醚，1/12/2 (v/v/v)，干燥，得到黄色固体粉末目标产物RMTE，产率为36.3%。

实施例四：Hg²⁺探针RMTE的制备

罗丹明B和氨乙基硫醚的摩尔比为1:5，以乙腈为溶剂，N,N-二异丙基乙胺为添加剂，与罗丹明B摩尔比为7:1，在N₂保护下，在30 ℃条件下搅拌反应36 h，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，得到黄色固体粉末粗产物，产率为79.6%。进行柱层析分离，淋洗液为甲醇/三氯甲烷/石油醚，1/12/2 (v/v/v)，干燥，得到黄色固体粉末目标产物RMTE，产率为51.9%。

实施例五：Hg²⁺探针RMTE的制备

罗丹明B和氨乙基硫醚的摩尔比为1:3，以乙醇为溶剂，N,N-二异丙基乙胺为添加剂，与罗丹明B摩尔比为7:1，在N₂保护下，在60 ℃条件下搅拌反应24 h，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，得到黄色固体粉末粗产物，产率为64.2%。进行柱层析分离，淋洗液为甲醇/三氯甲烷/石油醚，1/12/2 (v/v/v)，干燥，得到黄色固体粉末目标产物RMTE，产率为41.0%。

实施例六：Hg²⁺探针RMTE的制备

罗丹明B和氨乙基硫醚的摩尔比为1:5，以乙腈为溶剂，N,N-二异丙基乙胺为添加剂，与罗丹明B摩尔比为7:1，在N₂保护下，在40 ℃条件下搅拌反应24 h，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，得到黄色固体粉末粗产物，产率为80.2%。进行柱层析分离，淋洗液为甲醇/三氯甲烷/石油醚，1/12/2 (v/v/v)，干燥，得到黄色固体粉末目标产物RMTE，产率为54.4%。

实施例七：水溶液中RMTE对Hg²⁺的响应

在RMTE的CH₃CN/HEPES缓冲溶液 (1/99, v/v, pH=7.05) 中，加入Na⁺、K⁺、Ag⁺、Ca²⁺、Mg² ⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cd²⁺ 和Hg²⁺，测定加入离子前后的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱，结果如图1，紫外-可见吸收光谱 (左) 和荧光光谱 (右)，溶剂：CH₃CN/HEPES缓冲溶液 (1/99, v/v, pH=7.05)，浓度：20 μM (RMTE)，200 μM (金属离子)，激发波长：520 nm，狭缝宽度：5 nm。发现只有Hg²⁺可使RMTE在561 nm处的吸光度（图1左）和在578 nm处的荧光（图1右）大大增强，其荧光增强达到170倍，众多其他离子对RMTE的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱基本没影响。表明在CH₃CN/HEPES缓冲溶液 (1/99, v/v, pH=7.05) 中RMTE对Hg²⁺有很好的选择性和灵敏度。

实施例八：RMTE检测Hg²⁺的可逆性

用Na₂S研究RMTE检测Hg²⁺的可逆性。图2为RMTE检测Hg²⁺的可逆性的荧光光谱，溶剂：CH₃CN/HEPES缓冲溶液(1/99, v/v, pH=7.05)，浓度：20 μM (RMTE)，200 μM (金属离子)，激发波长：520 nm，狭缝宽度：5 nm；由图2可见，不加Hg²⁺时的RMTE的CH₃CN/HEPES缓冲溶液（1/99, v/v, pH=7.05）呈现无荧光状态，加入Hg²⁺后，溶液的荧光明显增强，但是，继续加入过量的Na₂S，溶液几乎恢复到无荧光状态，说明RMTE检测Hg²⁺是一个可逆过程。

实施例九：RMTE的细胞毒性

在27℃条件下，以含有10 %胎牛血清的TC-100作为培养液，将sf-9细胞置于24孔板中培养24 h，保证每一个孔中细胞的密度为1×10⁴。然后将12个孔平均分为4组，每组3个平行样品。第1组作为参照组；第2、3、4组分别加入20、30、40 µM RMTE，培养24 h后，用Muse智能触控细胞分析仪自动分析RMTE对sf-9细胞的毒性，结果如图3所示，把不加RMTE处理的细胞的存活率视作100%，经过含有20、30和40 μM RMTE的培养液培养24 h后细胞存活率分别为98.72 %、94.54 %和96.92 %。这说明RMTE没有对sf-9细胞的存活率产生很大影响。因此RMTE是一个毒性很低的物质，可以在活体细胞中应用。

实施例十：RMTE用于活细胞成像

在27℃条件下，以含有10 %胎牛血清的TC-100作为培养液，将sf-9细胞置于24孔板中培养24 h，保证每一个孔中细胞的密度为1×10⁴。然后将8个孔平均分为4组，每组2个平行样品。第1组作为参照组（a，a′）；第2组加入8 µM Hg²⁺（b，b′）；第3组加入40 µM RMTE（c，c′）；第4组同时加入4 µM Hg²⁺，染毒40 min，再加入20 µM RMTE，培养1 h后，将细胞置于尼康EOS700D倒置荧光显微镜上用绿光激发观察并且照相，见图4。

由图4可以看出，不经处理的参照组细胞（a和a′）和只含有Hg²⁺（b和b′）或是RMTE（c和c′）的细胞不发荧光。但是当在细胞中同时存在RMTE和Hg²⁺时，细胞发出明显的红色荧光（d和d′）。从自然光下细胞照片可以看出整个实验过程中细胞都处于正常状态，说明RMTE可以用于活细胞成像。

将第4组样品中的Hg²⁺以及RMTE浓度更换为20 µM的RMTE和6 µM的Hg²⁺、20 µM的RMTE和8 µM的Hg²⁺、30 µM的RMTE和4 µM的Hg²⁺、30 µM的RMTE和6 µM的Hg²⁺、30 µM的RMTE和8µM的Hg²⁺、40 µM的RMTE和4 µM的Hg²⁺、40 µM的RMTE和6 µM的Hg²⁺、40 µM的RMTE和8 µM的Hg²⁺时，得到图5：分别为红色荧光（e′）、自然光下细胞照片（e）；红色荧光（f′）、自然光下细胞照片（f）；红色荧光（g′）、自然光下细胞照片（g）；红色荧光（h′）、自然光下细胞照片（h）；红色荧光（i′）、自然光下细胞照片（i）；红色荧光（j′）、自然光下细胞照片（j）；红色荧光（k′）、自然光下细胞照片（k）；红色荧光（l′）、自然光下细胞照片（l）。细胞发出的红色荧光可以看出RMTE可以通过荧光显微镜观察或成像用于检测活细胞内的Hg²⁺，在RMTE浓度为20~40 µM 范围内，细胞荧光随着RMTE浓度增大而增强；在Hg²⁺浓度为4~8 µM 范围内，细胞荧光随着Hg²⁺浓度增大而明显增强。因此，RMTE不但可以检测较低浓度的Hg²⁺，而且Hg²⁺浓度的很小变化就能引起细胞荧光强度的灵敏变化；从自然光下细胞照片可以看出整个实验过程中细胞都处于正常状态，说明RMTE可以用于活细胞成像。

综上所述，本申请公开的基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物，原料易得，合成方法简单，分子结构简单；对Hg²⁺选择性好、灵敏度高；可以检测接近中性的几乎纯水缓冲溶液中的Hg²⁺；可以检测HgCl₂中的Hg²⁺；特别是对活细胞毒性低，可以用于活细胞成像，检测活细胞中的Hg²⁺浓度。

Claims

1.基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物在活细胞成像中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物的制备方法，包括以下步骤，氮气环境下，有机溶剂中，以罗丹明B和氨乙基硫醚为原料，以乙胺化合物为添加剂，搅拌反应得到基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述有机溶剂为乙腈、乙醇、二氯甲烷中的一种或者几种；所述添加剂为N,N-二异丙基乙胺；反应温度为20～60℃，反应时间为18～36h；罗丹明B和氨乙基硫醚的摩尔比为1∶(1～7)。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述添加剂用量为罗丹明B摩尔量的7倍；反应温度为30～50℃，反应时间为20～30 h；罗丹明B和氨乙基硫醚的摩尔比为1∶(3～5)。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：在反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，进行柱层析分离，真空干燥后得到基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物的化学结构式如下：

。

7.权利要求1所述的应用，其特征在于：基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物的浓度为10～50 µM。

8.基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物在检测活细胞中Hg²⁺中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物的制备方法，包括以下步骤，氮气环境下，有机溶剂中，以罗丹明B和氨乙基硫醚为原料，以乙胺化合物为添加剂，搅拌反应得到基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物。

10.权利要求8所述的应用，其特征在于：基于罗丹明B和氨乙基硫醚的化合物的浓度为10～50 µM。