CN106011026A - 一株产壳聚糖酶和抑真菌的伯克霍尔德氏菌及其应用 - Google Patents

一株产壳聚糖酶和抑真菌的伯克霍尔德氏菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株伯克霍尔德氏菌及其应用，属于微生物领域。本发明的伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp. MEL01已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO. M2015778,保藏日期：2015年12月25日。本菌株具有较高的壳聚糖酶活性，且对草莓灰霉等六种植物致病真菌有明显的拮抗作用；利用菌株MEL01能够降解壳聚糖的特性，将MEL01与胶体壳聚糖混合制成复合菌肥能够显著提高农作物土壤肥力，可应用于植物病原菌的生物防治及新型生物肥料的生产，在生态农业方面应用前景广阔。

Description

一株产壳聚糖酶和抑真菌的伯克霍尔德氏菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产壳聚糖酶和抑真菌的伯克霍尔德氏菌及其应用。
背景技术
几丁质在自然界的菌类、藻类的细胞壁，节肢动物外壳以及软体动物的内壳和软骨中广泛存在。壳聚糖是几丁质脱乙酰化的产物，通常把脱乙酰化程度超过70％的几丁质叫做壳聚糖。壳聚糖分子式为(C6H11NO4)n，具有可降解性，吸附性，保湿性，生物相容性等特点，可广泛应用于工业、农业、医药、环保及健康等领域。然而，壳聚糖本身难溶于水且降解缓慢，难以被生物体吸收利用。因此，如何将壳聚糖降解成水溶性更好的壳寡糖一直是国内外研究的热点，而生物酶法降解因其经济、温和、无污染等优势而备受瞩目。
伯克霍尔德氏菌属是一种广泛分步于土壤及植物根际的革兰氏阴性菌，其中一些具有促进植物生长和抗菌功能，对发展生态农业，维持农林业环境平衡有重要意义。目前有关伯克霍尔德氏菌的报道主要集中在生物防治，分解有毒物质和植物促生等方面。如专利201510331725.3(中国，曲媛媛等)报道了一株好氧降解吲哚的伯克霍尔德菌，在处理高浓度吲哚废水上有广阔的应用前景；专利200980119841.1(日本，古贺一治、增田绅吾)提到了一种抗重金属的伯克霍尔德菌，其菌剂对植物有促生作用；201210026711.7(中国，吴小芹等)，210310294837.7(中国，屈建航等)两个专利均报道了伯克霍尔德氏菌的溶磷功能，可以提高植物对磷素的利用率；而后专利201510171613.6(中国，谭志远等)又公开了一株同时具有固氮、溶磷解钾功能的伯克霍尔德氏菌，对水稻、烟草等农作物有显著促生作用；关于伯克霍尔德氏菌的生物防治作用的报道较多，201310265979.0(中国，黄道跟等)、201310326671.2(中国，杨忠绪、张小荣)，201510315978.1(中国，张志斌等)、201310739463.5(中国，赵青云等)等专利涉及到的植物病原真菌有：水稻纹枯病菌，立枯丝核病菌，小麦赤霉病菌，甘蔗黑腐菌，尖孢镰刀菌，香蕉枯萎病菌等。
本发明菌株Burkholderia sp.MEL01是一株伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)，能够高效降解壳聚糖且对草莓灰霉病菌等多种植物病原真菌具有明显的抑制作用。此外，由于壳聚糖本身具有改良土壤的作用，利用菌株Burkholderia sp.MEL01分泌壳聚糖酶的特性，创新性地将壳聚糖与MEL01混合制备成复合菌肥，通过调控土壤肥力实现对作物的促生作用。
目前，关于兼具抑制植物病原真菌和提高土壤肥效功能的伯克霍尔德氏菌鲜见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高效降解壳聚糖、抑制多种植物病原真菌功能的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)MEL01，并研制出一种能够调控土壤肥效，实现增产的复合菌肥,该菌肥对小白菜有明显的促生作用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一株产壳聚糖酶和抑真菌的伯克霍尔德菌，分类命名为：伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)MEL01，已保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学)，保藏编号：CCTCCNo.M2015778,保藏日期：2015年12月25日，菌株MEL01的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
如上所述的一株产壳聚糖酶和抑真菌的伯克霍尔德菌的培养方法：牛肉膏蛋白胨培养基(蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，pH7.0～7.2)，装液量100mL(250mL锥形瓶)，种子液接种量1％，以150r/min在28℃培养10h。
如上所述的一株产壳聚糖酶和抑真菌的伯克霍尔德菌在降解壳聚糖中的应用，壳聚糖酶发酵方法：发酵培养基(蛋白胨0.5％，酵母提取物0.5％，K2HP04·3H2O0.07％,KH2PO4 0.03％,NaCl 0.05％,MgS04·7H2O 0.05％,粉末壳聚糖1％，pH6.5)，装液量100mL(250mL锥形瓶)，种子液接种量1％，150r/min、28℃下发酵3d。
如上所述的一株产壳聚糖酶和抑真菌的伯克霍尔德菌在草莓灰霉菌、苹果轮纹菌、花生叶霉菌和拟盘多毛孢菌生物防治中的应用。
本发明还提供了一种壳聚糖复合菌肥，该菌肥含上述伯克霍尔德氏菌MEL01和1％胶体壳聚糖溶液，菌肥中菌株Burkholderia sp.MEL01的浓度约3×108cfu/mL。将上述复合菌肥施加至小白菜幼苗根部，施加量为20mL，施加频率 为每5d一次，培养时间总计25d。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)MEL01具有较高的壳聚糖酶活性，其发酵上清液(未优化)酶活即高达1690U/L(酶活力单位U：每分钟催化生成相当于释放1μmol氨基葡萄糖的还原糖所需酶量)，在工业化生产壳聚糖酶上有广泛的应用前景。
(2)伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)MEL01对草莓灰霉菌、苹果轮纹菌、花生叶霉菌和拟盘多毛孢菌均有明显的拮抗作用。
(3)本发明提供的壳聚糖复合菌肥对小白菜有显著的促生作用，接种小白菜幼苗25d后，植株鲜重与未施加菌肥相比增加311.43％，株高增加84.62％，茎粗增加107.32％，根长增加56.78％。对提高作物产量，发展可持续高效高产的生态农业具有长远的意义。
附图说明
图1是Burkholderia sp.MEL01在牛肉膏蛋白胨液体培养基中的生长曲线。
图2是Burkholderia sp.MEL01菌株在牛肉膏蛋白胨平板上的培养形态。
图3是Burkholderia sp.MEL01菌株的16S rDNA基因序列系统发育树。
图4是Burkholderia sp.MEL01菌株降解壳聚糖的透明圈。
图5是Burkholderia sp.MEL01菌株壳聚糖酶酶活测定结果图。
图6是Burkholderia sp.MEL01菌株对草莓灰霉病菌等多种植物致病真菌的拮抗作用：其中(a)为草莓灰霉(左)、尖孢镰刀菌(右)；(b)为苹果轮纹菌(左)、花生叶霉菌(右)；(c)为水稻纹枯菌(左)、拟盘多毛孢菌(右)。注：Burkholderia sp.MEL01为滴加等量MEL01菌液的滤纸片；CK为滴加无菌水的滤纸片。
图7是Burkholderia sp.MEL01复合菌肥接种小白菜幼苗25d后的生长情况：(a)为小白菜对照组(阴性/阳性)与实验组的盆栽生长状态；(b)为小白菜对照组(阴性/阳性)与实验组的移出待测状态；注：实验组施加适当量的MEL01复合菌肥；对照组(阴性)施加等量清水，对照组(阳性)施加等量的胶体壳聚糖溶液。
图8是Burkholderia sp.MEL01平板对峙法中滤纸片的放置方法。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述的范围，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施案例中涉及到的培养基组分如下：
壳聚糖筛选培养基：
A液：1％胶体壳聚糖；取1g壳聚糖(壳聚糖脱乙酰度≥90％)，加入30ml的0.4mol/L HCl，搅拌至壳聚糖完全溶解，用2mol/LNaOH调pH调至5.0，加水定容至100mL，配成1％的胶体壳聚糖。B液：K2HPO4·3H2O 0.4％，KH2PO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.14％，NaCl 0.1％，KCl 0.1％，CaCl2 0.02％，酵母粉0.1％，琼脂2％，pH7.0。A、B液分别于121℃灭菌20min后等体积混合，倒平板。
PDA培养基：马铃薯200g/L葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，自然PH，115℃灭菌20min。
实施例1本发明菌株的筛选
将武汉市常青花园公园附近采集到水样和土壤，分别加入灭菌水中激烈震荡。样品:无菌水＝1:9(水样为体积比，土样为质量与体积比)，所得悬浮液浓度为10-1，再将上述浓度为10-1的悬浮液稀释成10-2～10-6的系列浓度。分别取上述不同浓度稀释液200μL均匀涂布于壳聚糖筛选平板上，倒置28℃，恒温培养3～5d。挑取生长良好且能产生透明圈的菌落进行划线纯化，用甘油保藏法保菌处理。
通过上述筛选，获得1株能以壳聚糖作为唯一碳源，在筛选平板上产生明显的水解透明圈的菌株，编号为MEL01，即本专利菌株。菌株MEL01在牛肉膏蛋白胨液体培养基的生长曲线见图1，由图可知10h时MEL01开始进入对数期，后面的实施例均选取10h作为活化时间点。
实施例2菌株的形态学观察和分子生物学鉴定
(1)形态特征和生理生化特征
菌株MEL01的形态和生理生化特征：在牛肉膏蛋白胨平板上28℃恒温培养48h，菌落呈圆形，边缘整齐，淡黄色不透明，表面湿润呈粘稠状，菌落初期扁平，随着培养时间的增长菌落变厚，具体形态见图2。根据《伯杰氏细菌手册》， MEL01还有以下生理生化性状：革兰氏染色阴性，菌体短杆状，无芽孢，反硝化阴性，柠檬酸盐利用阳性，亮氨酸利用阳性，接触酶阳性，明胶液化阳性。
(2)16S rDNA分子鉴定
PCR扩增模板的制备：用灭菌牙签挑取MEL01单菌落溶于10μL无菌水中，100℃变性5min后离心，取上清液作为PCR模板。
采用细菌16S rDNA基因通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)进行扩增。
PCR反应参数为：98℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，30个循环后，再72℃延伸10min。取5μLPCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小约1.5kb。将PCR产物回收后送至武汉擎科创新生物科技有限公司进行测序。
测序结果与GenBank数据库中的已知16S rDNA序列进行Blast分析，比对结果显示与MEL01序列相似性达99％的均为伯克霍尔德菌，因此判断MEL01是伯克霍尔德氏菌属。调出与该序列相关性较高的核酸序列，用MEGA 6.0.6软件构建MEL01的系统发育树，见图3。
实施例3菌株降解壳聚糖性能测定
(1)降解壳聚糖透明圈法定性实验
吸取10μL牛肉膏蛋白胨液体培养基活化10h的MEL01菌悬液点植于壳聚糖平板上，平板上四角对称点植4株菌，37℃恒温箱倒置培养3d后，MEL01能形成非常明显的水解圈，结果见图4。用精度为0.02mm的游标卡尺测量各菌落水解圈直径(D)与菌落的直径(d)比，D/d均超过3.5(D/d值越大表示降解能力越强)，可以认为MEL01具有显著的降解效果，具体测量结果见表1。
表1菌株MEL01降解壳聚糖的(D/d)比值
(2)菌株MEL01分泌壳聚糖酶能力测定
根据上述透明圈法定性实验可知，MEL01有较强的壳聚糖酶活性，对MEL01分泌壳聚糖酶能力进行定量测定。
制作氨基葡萄糖标准曲线：分别取12μmol/mL的氨基葡萄糖(GlcN)标准液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml于试管中，用去离子水补足至2ml，混匀；然后分别加入1.5ml的DNS试剂混合，并且在沸水浴中加热5min，并迅速用冷水冷却，然后向每管中再加入21.5ml水，此时总体系为25ml；分别取1ml离心(12000rpm，5min)，取0.5ml上清，再加入4.5ml的蒸馏水，混匀测OD540。最后以氨基葡萄糖(μmol/ml)为横坐标(x)，以不同浓度氨基葡萄糖溶液的OD540与空白OD540的差值为纵坐标(y)作标准曲线：y＝3.83x+0.0036，R2＝0.99609。
测定MEL01壳聚糖酶活力：
①将MEL01活化后按2％接种于壳聚糖酶发酵培养基，定时取6ml发酵液于5000rpm离心7min，以上清液作为酶液。
②做两组实验，一组经沸水浴10min灭活处理，另一组不做处理，各做一个对照。
③加1％胶体壳聚糖500μl，PBS500μl,总体积2ml，做一个空白对照PBS。
④30℃水浴1小时。
⑤沸水浴10min，冷却。
⑥分别加入2ml DNS，沸水浴10min，冷却。
⑦分别取1ml于EP管中12000r/min离心5min。
⑧取上清液0.5ml，加4.5ml水(稀释10倍)，测OD540nm。
参照上述方法测定MEL01酶活随培养时间的变化，结果见图5。结果显示MEL01在第三天产酶能力最强，粗酶液酶活达到1690U/L(酶活力单位U：每分钟催化生成相当于释放1μmol氨基葡萄糖的还原糖所需酶量)，属于高效产壳聚糖酶菌株。
实施例4菌株MEL01对多种植物病原真菌的拮抗作用
将培养在PDA平板上的草莓灰霉菌等六种植物病原真菌用5mL无菌的PBS反复吹打洗下，制成真菌液留用。将灭菌滤纸片(直径0.7c m)用镊子放在PDA平板中央。分别取10uL上述真菌液滴在中央的滤纸片，正置至少20min。30℃倒置培养至六种真菌长出，菌落直径约2.5～3cm。
采用平板对峙法，取牛肉膏蛋白胨液体培养基活化10h的MEL01，无菌操作条件下收集菌体，用无菌PBS清洗2次，最后用PBS调OD600nm＝1.0。取两 片灭菌滤纸片(直径0.7cm)浸入上述菌悬液并沥干，对称贴于上述PDA平板菌丝边缘1.0cm处，并在交叉对称的位置贴上浸没过无菌PBS的滤纸片作为对照(CK)，效果见图8所示。将处理后的PDA平板30℃下倒置培养并观察抑菌状况，待对照组(CK)方向菌落长至平板边缘后，拍照记录。图6显示菌株MEL01对草莓灰霉等六种植物病原真菌均有明显的拮抗作用。
实施例5菌株MEL01复合菌肥盆栽实验
将MEL01在牛肉膏蛋白胨液体培养中活化10h后，收集菌体并用无菌水清洗2次，最后用无菌水调OD600＝1.0。将菌悬液与胶体壳聚糖等体积混合制成复合菌肥。用作盆栽实验的小白菜撒播育苗后，在幼苗开始“拉十字”时进行分苗，挑选18株长势几乎一样的小白菜幼苗移栽于18个花盆中，对照组(阴性/阳性)和实验组均设置6个重复。
将对照组(阴性/阳性)和实验组幼苗放于阳光充足的自然环境培养25天，实验组每5天施加一次复合菌肥至根部，施加量为每株20ml，对照组(阴性)施加等量清水，对照组(阳性)施加等量的胶体壳聚糖溶液，以分别确定胶体壳聚糖和MEL01对小白菜生长的影响。
25天后对小白菜的生长情况进行拍照记录(图7a)；用铲子将对照组(阴性/阳性)和实验组小白菜连根挖出，洗净泥土并晾干(图7b)，用精度为0.05mm的游标卡尺测量各株的鲜重、株高、茎粗及根长等生理指标(表2)，确定MEL01复合菌肥的增产效果。
盆栽实验结果表明，胶体壳聚糖能够对小白菜有一定的促生作用，但效果不显著；而施用MEL01与胶体壳聚糖复合菌肥后，小白菜的鲜重、株高、茎粗及根长与未施肥的对照组均有明显差异，说明MEL01复合菌肥对小白菜有显著的增产作用。具体增产效果：
(1)阳性对照较阴性对照：鲜重增加了31.83％，株高增加了36.88％，茎粗增加了36.59％，根长增加了47.46％。
(2)实验组较阴性对照：鲜重增加了311.43％，株高增加了84.62％，茎粗增加了107.32％，根长增加了56.78％。
表2MEL01复合菌肥对小白菜的促生作用

Claims (3)

1.一株产壳聚糖酶和抑真菌的伯克霍尔德氏菌，其特征在于：该菌Burkholderia sp.MEL01保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO. M2015778，保藏日期为2015年12月25日。
2.如权利要求1所述的一株产壳聚糖酶和抑真菌的伯克霍尔德氏菌的应用，其特征在于：菌株Burkholderia sp.MEL01可抑制草莓灰霉菌、苹果轮纹菌、花生叶霉菌和拟盘多毛孢菌。
3.如权利要求1所述的一株产壳聚糖酶和抑真菌的伯克霍尔德氏菌的应用，其特征在于：菌株Burkholderia sp.MEL01与胶体壳聚糖混合制备复合微生物菌肥。
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