CN105985990B

CN105985990B - 一种去氧肾上腺素中间体的生产方法

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Publication number: CN105985990B
Application number: CN201510055808.4A
Authority: CN
Inventors: 陶军华; 蒋项军
Original assignee: SUZHOU ENZYMEWORKS Inc
Current assignee: SUZHOU ENZYMEWORKS Inc
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2015-02-03
Publication date: 2020-01-10
Anticipated expiration: 2035-02-03
Also published as: CN105985990A

Abstract

本发明涉及一种去氧肾上腺素中间体的生产方法。本发明基于KRED酶的辅酶循环体系进行自行循环来进行反应设计，从而减少了反应原料、简化了反应程序；并且本发明还通过在反应体系中加入抗氧化剂，提高了反应的效率。

Description

一种去氧肾上腺素中间体的生产方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明涉及一种去氧肾上腺素中间体的生产方法。

背景技术

去氧肾上腺素(Phenylephrine，式(I))在体内可以与α-或β-肾上腺素受体结合，在临床上常作为药物应用于阵发性室上性心动过速等疾病。同时去氧肾上腺素也是一种应用范围很广泛的医药原料中间体。

去氧肾上腺素含有手性羟基中心，其制备方法主要有化学法和酶法，理论上氨基不保护直接还原是最经济的方法，但是由于苄基保护的工艺路线是国内外的主流工艺，因此生产去氧肾上腺素过程中重要的是获得苄基保护的去氧肾上腺素(式(II)，3-((R)-2-(N-苄基-N-甲基氨基)-1-羟基)苯酚)。

目前，式(II)化合物的制备主要由化学法和生物法通过还原反应获得，如上述反应式所示。化学法中通常利用手性催化剂对式(III)化合物(1-(3-羟基苯基)-2-[甲基(苯基甲基)氨基]乙酮)进行加氢还原获得手性羟基中心，如申请号为CN 201010259068.3的中国专利和WO 2008/095678 A1的世界专利，由于过程中使用高压高温的反应条件和重金属催化剂(钯，有毒物质，环境中难以降解，钯的手性配体难以购买获得)，其环境友好性不佳。

与化学法相比，生物转化方法在常温常压下进行反应，催化剂无毒可由环境降解，是具有极高工业化应用价值的技术。中国专利CN102776251A采用葡萄糖脱氢酶(同一反应体系中的第二种氧化还原酶)进行辅酶循环，但是其生产过程中需要加入等当量的碱中和产生的葡萄糖酸以控制pH，并且使该过程的整体用酶量达到了底物质量的30％。

因此，本领域还需要进一步研究制备去氧肾上腺素或其中间体的改进的路线方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种去氧肾上腺素中间体的生产方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备式(II)化合物(即：苄基保护的去氧肾上腺素)的方法，所述方法包括：以式(III)化合物为底物，在酮基还原酶KRED及其辅酶催化下发生反应生成式(II)化合物；并且，在反应体系中加入抗氧化剂；

在一个优选例中，酮基还原酶KRED的辅酶选自：NAD，NADP，NADPH或NADH。

在另一优选例中，所述的酮基还原酶KRED的辅酶是NADP。

在另一优选例中，所述的方法包括：在pH7.0±0.5(较佳地pH7.0±0.2)的缓冲液中，将式(III)化合物与异丙醇(作为氢供体)充分混合，加入抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶，充分混合，生成式(II)化合物。

在另一优选例中，式(III)化合物与异丙醇在pH6.5～7.5的缓冲液中充分混合，之后，调节pH至5.0～6.0；较佳地，以缓冲液调节pH值；更佳地所述缓冲液选自：磷酸盐缓冲液，三乙醇胺-盐酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

在另一优选例中，反应体系中，以磷酸盐缓冲液调节pH值；较佳地，磷酸盐缓冲液浓度在6～140mM；更佳地为10～100mM。

在另一优选例中，所述的式(III)化合物、抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶的质量比为：100:(1.5-2.0):(3.0-7.0):(0.1-0.2)。

在另一优选例中，所述的抗氧化剂包括：巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)或维生素C；较佳地为巯基乙醇或二硫苏糖醇。

在另一优选例中，在反应结束后，还包括纯化的步骤。较佳地，反应结束后，过滤(较佳地应用，0.4-0.5微米、如0.45微米醋酸纤维素滤膜)获取滤液，调节反应体系pH至9～10，降低温度，获得结晶产物；较佳地，对母液用乙酸乙酯萃取、旋蒸，收获固体产物。

在本发明的另一方面，提供一种制备式(I)化合物(即：去氧肾上腺素)的方法，所述方法包括：

(a)以前面所述的方法制备式(II)化合物；

(b)将式(II)化合物经过还原反应脱去苄基，生成式(I)化合物；

在本发明的另一方面，提供一种抗氧化剂的用途，用于在以式(III)化合物为底物，在酮基还原酶KRED催化下发生反应生成式(II)化合物的反应过程中，提高反应的效率；

在本发明的另一方面，提供一种用于制备式(II)化合物或式(I)化合物的试剂盒，所述的试剂盒中包括：抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶；

较佳地，所述的酮基还原酶KRED的辅酶选自：NAD，NADP，NADPH和/或NADH；

较佳地，所述的抗氧化剂包括：巯基乙醇、二硫苏糖醇或维生素C；更佳地为巯基乙醇或二硫苏糖醇；

较佳地，所述试剂盒中，抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶的含量按照质量比为：(1.5-2.0):(3.0-7.0):(0.1-0.2)；

较佳地，所述的试剂盒中还包括式(III)化合物，其与抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶的含量按照质量比为：100:(1.5-2.0):(3.0-7.0):(0.1-0.2)。

较佳地，所述试剂盒中，还包括缓冲液，更佳地所述缓冲液选自：磷酸盐缓冲液，三乙醇胺-盐酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括使用说明书，其中标示了各主要成分的用法用量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

本发明人致力于利用生物转化方法生产去氧肾上腺素，在研究中意外地发现，当利用酮基还原酶(KRED酶)制备苄基保护的去氧肾上腺素(即去氧肾上腺素中间体)时，可以由单一的KRED酶催化异丙醇脱氢实现辅酶的循环，基于此进行反应设计，从而减少了反应原料、简化了反应程序；并且，本发明人还通过在反应体系中加入抗氧化剂，提高了反应的效率。在此基础上完成了本发明。

本发明公开的生物转化方法采用异丙醇进行辅酶循环，与现有的生物转化方法相比，不需要额外加入帮助辅酶循环的酶，整体用酶量为底物质量的5％。发明人在实验中发现，底物在反应中的氧化会导致酶反应的停滞，通过添加微量抗氧化剂的方法解决了这一问题。

方法工艺

本发明提供了一种制备式(II)化合物(即苄基保护的去氧肾上腺素)的方法，所述方法包括：以式(III)化合物为底物，在酮基还原酶KRED催化下发生反应生成式(II)化合物；并且，在反应体系中加入抗氧化剂。

在上述方法基础上，本发明还提供了一种制备式(I)化合物(即去氧肾上腺素)的方法，所述方法包括：(a)以前面所述的方法制备式(II)化合物；(b)将式(II)化合物经过还原反应脱去苄基，生成式(I)化合物。

所述的酮基还原酶KRED需要辅酶来实现还原反应。氧化型辅酶和还原性辅酶均可用作辅酶，较佳地，所述的辅酶可以是NADP(氧化型辅酶II)，NADPH(还原性辅酶II)，NADH(还原性辅酶I)或NAD(氧化型辅酶I)，它们可以作为电子供体用于所述反应中；作为优选的实施方式，所述的辅酶是NADP。

本发明人出乎意料地发现，KRED酶的辅酶循环体系可以实现自行循环。因此，与现有的方法相比，本发明的方法通过对辅酶循环体系的改进和反应体系的优化，实现了高反应效率和更加绿色、温和的生物转化过程，具有重要的应用价值。

本发明人经过大量研究筛选后发现，在生物法制备(II)化合物的反应体系中，加入抗氧化剂能够减少不完全反应的发生，避免反应底物与反应体系中其它成分发生副反应(如底物与水中的氧离子发生反应生成醌类)，显著地提高反应效率。因此，所述的反应体系中包括抗氧化剂。

多种抗氧化剂可以被应用于本发明中。作为本发明的优选方式，所述的抗氧化剂包括巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)或维生素C。更为优选地为巯基乙醇或二硫苏糖醇。在本发明的具体实施例中，已经证明，在添加所述抗氧化剂后，可以使得底物转化为式(III)化合物的转化率发生极大的提高(表1)。

作为本发明的优选方式，首先将式(III)化合物与磷酸盐缓冲液及异丙醇(作为氢供体)充分混合，较佳地，在30±2℃下搅拌20±10分钟；之后，加入抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶，充分混合，生成式(II)化合物。作为本发明的优选方式，所述的式(III)化合物、抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶的质量比为：100:(1.5-2):(3-7):(0.1-0.2)；较佳地例如100:(1.5-1.7):(4.5-5.5):(0.13-0.17)；在本发明的一个具体实施例中，采用质量比100:1.5:5:0.15。

本发明人在研究中还发现，磷酸盐缓冲液的浓度对于底物的转化率有影响，过高的缓冲液浓度导致底物的转化率下降。因此，作为本发明的优选方式，所述的磷酸盐缓冲液的浓度在6～140mM；更佳地为10～100mM，从而底物转化率呈现较高水平。

本发明的方法适用于多种规模的生产，可以是试管水平的或是工业生产水平的。在本领域技术人员阅读了本发明后，在生产规模方面的调整是易于作出的，因此各种生产规模下按照本发明提供的思路进行反应的方法均包含在本发明中。

本发明的方法中，所应用的原料均是本领域已经商业化的材料，对于去氧肾上腺素或其中间体的制备没有特殊的限制。可采用本领域已有的原料、设备，只要是按照本发明提供的思路和方法进行操作，均应理解为包含在本发明的保护范围之内。

试剂盒

基于本发明的方法改进，还提供了一种用于制备式(II)化合物或式(I)化合物的试剂盒，所述的试剂盒中包括：式(III)化合物、抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶。通常，这些原料以合适的配方被置于各自独立的容器。

在更优选的实施方式中，所述试剂盒中，还包括磷酸盐缓冲液、异丙醇和/或pH调节剂。此外，还可包括使用说明书，以说明各原料的使用方法、顺序。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、抗氧化剂的运用及筛选

反应器(5ML塑料管)中加入0.2g式(III)化合物作为底物，1.04mL磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)，0.96mL异丙醇(无水)，30℃下搅拌20分钟，加入不同种类抗氧化剂(选自维生素C、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))30mM，NADP0.4mg，酮基还原酶KRED(牌号EW0773，由汉酶生物技术有限公司生产销售)的酶粉5mg，搅拌均匀。以不加入抗氧化剂的反应体系为对照(空白)。HPLC检测底物转化为式(III)化合物的转化率。

转化率结果如表1所示。可见，添加巯基乙醇或二硫苏糖醇可以获得显著提高的转化率。

表1

反应结束后，观测反应液的色泽，发现加入抗氧化剂巯基乙醇或二硫苏糖醇参与反应的反应体系中，反应液呈现淡黄色，说明反应完全，反应效率高；而未加入抗氧化剂的反应液则呈现黑色，说明反应过程中底物还存在其它副反应(如底物与水中的氧离子发生反应生成醌类)，不完全反应产物很多，反应效率很低。

实施例2、缓冲液浓度优化

反应器(5ML塑料管)中加入0.2g式(III)化合物作为底物，不同浓度的1.04mL磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)，0.96mL异丙醇(无水)，30℃下搅拌20分钟，加入DTT 10mM，NADP0.4mg，KRED酶粉(牌号EW0773，，由汉酶生物技术有限公司生产销售)5mg，搅拌均匀，HPLC检测底物转化为式(III)化合物的转化率。

结果如表2所示。可见，磷酸盐缓冲液浓度在10mM和100mM时转化率较高，而当在200mM时则底物转化率又呈现下降。

表2

实施例3、放大反应

在2L的反应器中加入100g式(III)化合物作为底物，520mL 100mM pH7.0的磷酸盐缓冲溶液，480mL异丙醇，30℃下搅拌20分钟，调节pH至5.5，加入DTT 1.5g，NADP 0.15g，KRED酶粉(牌号EW0773，由汉酶生物技术有限公司生产销售)5g，搅拌均匀，7小时候HPLC检测底物转化为式(III)化合物的转化率超过99％，产物光学纯度100％。

反应结束后，过滤(0.45微米醋酸纤维素滤膜)获取滤液，调节反应体系pH至9.5左右，降低温度至10℃，析出产物晶体60g，母液用乙酸乙酯萃取3次，旋蒸得到固体31g，总收率91％。

实施例4、脱苄基反应

取实施例3的产物10g，溶于100mL甲醇中，加入10g 10％钯炭催化剂，10g冰醋酸，氮气保护下甲醇回流2小时，硅藻土过滤，甲醇洗涤滤渣后旋蒸得到脱苄基产品(即去氧肾上腺素)6g。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种制备式(II)化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：以式(III)化合物为底物，在酮基还原酶KRED及其辅酶催化下发生反应生成式(II)化合物；并且，在反应体系中加入抗氧化剂，所述的抗氧化剂为巯基乙醇或二硫苏糖醇；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，酮基还原酶KRED的辅酶选自：NAD，NADP，NADPH或NADH。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：

在pH7.0±0.5的缓冲液中，将式(III)化合物与异丙醇充分混合，加入抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶，充分混合，生成式(II)化合物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，式(III)化合物与异丙醇在pH7.0±0.5的缓冲液中充分混合，之后，调节pH至5.0～6.0。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，以缓冲液调节pH值。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述缓冲液选自：磷酸盐缓冲液，三乙醇胺-盐酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，反应体系中，以磷酸盐缓冲液调节pH值。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液浓度在6～140mM。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液浓度为10～100mM。

10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的式(III)化合物、抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶的质量比为：100:(1.5-2.0):(3.0-7.0):(0.1-0.2)。

11.一种制备式(I)化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)以权利要求1-10任一所述的方法制备式(II)化合物；

(b)将式(II)化合物经过还原反应脱去苄基，生成式(I)化合物；

12.一种抗氧化剂的用途，其特征在于，用于在以式(III)化合物为底物，在酮基还原酶KRED催化下发生反应生成式(II)化合物的反应过程中，提高反应的效率；所述的抗氧化剂为巯基乙醇或二硫苏糖醇；

13.一种用于制备式(II)化合物或式(I)化合物的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶；所述的抗氧化剂为巯基乙醇或二硫苏糖醇；

14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的酮基还原酶KRED的辅酶选自：NAD，NADP，NADPH和/或NADH。

15.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中，抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶的含量按照质量比为：(1.5-2.0):(3.0-7.0):(0.1-0.2)。

16.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括式(III)化合物，其与抗氧化剂、酮基还原酶KRED、酮基还原酶KRED的辅酶的含量按照质量比为：100:(1.5-2.0):(3.0-7.0):(0.1-0.2)；

17.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，还包括缓冲液，所述缓冲液选自：磷酸盐缓冲液，三乙醇胺-盐酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

18.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，还包括异丙醇。