CN105982961A

CN105982961A - 一种同时具有抗hiv和hbv感染的中药组合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN105982961A
Application number: CN201510093033.XA
Authority: CN
Inventors: 兰金初; 兰天; 兰一天; 兰宇; 卜绿萍
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-03-02
Filing date: 2015-03-02
Publication date: 2016-10-05

Abstract

本发明公开了一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物及其制备方法和用途。本发明的一种中药组合物，由以下重量份的各原料药组成：金银花15-45份、五倍子5-30份、牛蒡子15-45份、苦参10-30份、木贼30-60份、肿节风15-45份、黄芩15-45份、土贝母10-30份、余甘子15-45份以及商陆5-30份。此外，研究发现在本处方配伍中再加上胆汁盐和磷酸三丁酯，对清除或阻断各类病种的DNA指标有所增效。本发明的中药组合物在治疗传染性乙型肝炎和/或艾滋病领域将具有广泛的应用前景。

Description

一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种中药组合物及其制备方法和用途，特别涉及一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物及其制备方法和用途。属于中药研究技术领域。

背景技术

乙肝(viral hepatitis type B，又称乙型病毒性肝炎)是由乙肝病毒(HBV)引起，临床表现为：乏力、食欲减退、恶心、呕吐、厌油、肝大及肝功能异常。发展中国家发病率高，多数无症状，其中1/3出现肝损害的临床表现。据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者(HBsAg携带者)超过2.8亿，我国约占9300万。乙肝包括以下类型：急性乙肝(急性黄疸型肝炎、急性无黄疸型肝炎)、慢性乙肝、重型乙肝、淤胆型肝炎、肝炎后肝硬化、小儿乙型肝炎病毒相关肾炎、新生儿乙型肝炎、乙型肝炎病毒性关节炎等。

目前抗HBV药物主要分为两大类：一是干扰素类(IFNα)，主要通过免疫调节作用抑制患者体内病毒复制，但疗效有限，其HBeAg血清学转换率仅为30％，且副作用较大，耐受性差，价格昂贵；二是核苷(酸)类似物(NAs)，可有效抑制病毒的逆转录酶活性，虽可抑制95％的初治患者体内病毒的复制，但HBeAg血清学转换率也仅为20％，且长期用药会导致耐药株的出现而影响疗效；两类药物的5年HBsAg血清学转阴率更是仅为10％，联合应用二者也未取得理想疗效更不能彻底清除病毒[Zoulim F.(2012)Are novel combination therapies needed for chronic hepatitis B？Antiviral Res 96:256–259.]。因此研发有效的预防性疫苗和疗效较好的新抗病毒药物，尤其是适合我国国情的抗HBV药物，对慢性HBV感染患者具有重要意义。

艾滋病(acquired immuno deficiency syndrome，AIDS)，即获得性免疫缺陷综合征，是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的一种严重传染病。艾滋病病毒作为一种能攻击人体免疫系统的病毒，把人体免疫系统中最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏T4淋巴细胞，从而破坏人的免疫系统，最终使免疫系统崩溃，使人体因丧失对各种疾病的抵抗能力而发病并死亡。

高效抗逆转录病毒疗法(HAART)，即“鸡尾酒"疗法，是目前治疗艾滋病(AIDS) 唯一有效的方案，虽不能彻底根治AIDS，但能有效抑制人免疫缺陷病毒(HIV)复制，重建免疫系统，并显著改善病人预后。但是，HAART药物费用昂贵、毒副作用显著，常常导致患者不能坚持治疗；而且HIV已对许多药物已产生了耐药性。因此，寻找更安全有效、费用低廉的药物已成为当务之急。

鉴于HBV和HIV有着类似的病毒学特性，生活周期史和致病特点，且均损害宿主免疫[Frebel H,Richter K,Oxenius A.(2010)How chronic viral infections impact on antigen-specific T-cell responses.Eur J Immunol 40:654–663；Revill P,Yuan Z.(2013)New insights into how HBV manipulates the innate immune response to establish acute and persistent infection.Antivir Ther 18:1–15；Hakim MS,Spaan M,Janssen HL,Boonstra A.(2014)Inhibitory receptor molecules in chronic hepatitis B and C infections:novel targets for immunotherapy.Rev Med Virol 24:125–138.]，故抗HIV药物常同时具有抗HBV活性[Tavis JE,Cheng X,Hu Y,Totten M,Cao F,et al.(2013)The hepatitis B virus ribonuclease H is sensitive to inhibitors of the human immunodeficiency virus ribonuclease H and integrase enzymes.PLoS Pathog 9:e1003125；Matthews GV,Seaberg EC,Avihingsanon A,Bowden S,Dore GJ,et al.(2013)Patterns and causes of suboptimal response to tenofovir-based therapy in individuals coinfected with HIV and hepatitis B virus.Clin Infect Dis 56:e87–e94.]。

因此，本发明的目的在于提供一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物，并对其所具有的抗HIV和HBV的相关抗病毒机制进行研究和揭示。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物及其制备方法和用途。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术手段为：

本发明的一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物，由以下重量份的各原料药组成：金银花15-45份、五倍子5-30份、牛蒡子15-45份、苦参10-30份、木贼30-60份、肿节风15-45份、黄芩15-45份、土贝母10-30份、余甘子15-45份以及商陆5-30份。

在本发明中，优选的，所述的中药组合物，由以下重量份的各原料药组成：金银花30份、五倍子15份、牛蒡子30份、苦参15份、木贼45份、肿节风30份、黄芩30份、土贝母15份、余甘子30份以及商陆10份。

传染性肝病、艾滋病均属难治的传染性疾病，属于中医温病学文献中的“温疫病具有强烈的传染性，无论老少强弱，触之者即病，是自然界里一种特殊的致病物质——‘疠气’”等范畴。这两种不同病名的疾病而同是传染性疾病，属中医学同病异治，异病同治的诊疗原则。

按中医学君臣佐使的组方原则分析处方配伍：

本发明的中药组合物即遵上法，由：金银花、五倍子、牛蒡子、苦参、木贼、肿节风、黄芩、土贝母、余甘子以及商陆10味中草药组成。

本处方以金银花、五倍子为君药。金银花性味甘、寒。归肺、心、胃经。清热解毒，凉散风热。常用于风热感冒，痈肿疔疮、丹毒、温病发热。《本草纲目》：“金银花主治寒热身肿，诸肿毒，痈疽疥癣，杨梅诸恶疮，散热解毒。”《现代药理学》：“金银花主要针对抗菌、抗病毒”。五倍子性味酸、涩、寒，归肺、大肠、肾经。《本草纲目》：“五倍子治疗肺虚久咳、盗汗、久泻、痈肿疮毒、皮肤湿烂、杀精子。”《中药现代研究与应用》：“五倍子抗癌、抗病毒、抗菌、杀虫、杀精、敛汗止血。治疗传染性软疣、扁平疣、尖锐湿疣、带状疱疹、脓疱疮、胃溃疡和上消化道出血、口腔溃烂、脚癣。”这两味药既抗病毒又抗菌、而且治疗久咳久泻、盗汗、皮肤湿烂、清热消疮。故为本方之君药。方中以牛蒡子、苦参、肿节风、木贼、黄芩为臣药。牛蒡子性味辛、苦、寒。归肺、胃经。宣肺透疹、解毒利咽、止咳化痰。《中药现代研究与应用》：“抗病毒、抗菌排脓，抗肿瘤；促进血液循环。”常用于治疗风热感冒、咽喉肿痛、咳嗽痰多、麻疹、痈肿疮毒、痄腮丹毒、传染性软疣、脓疱疮、各种肿瘤。苦参性味苦、寒。归心、肝、肾、大肠、膀胱经。清热燥湿，解毒、杀虫、利尿。《中药现代研究与应用》：“抗病毒、抗病原微生物。治疗传染性肝炎、霉菌性肠炎、淋病、肿瘤、失眠、心律失常、真菌感染、梨形鞭毛虫病、蛲虫病、湿疹、皮炎、扁桃体炎。”肿节风性苦、辛、微温。活血散结，解毒祛湿。常用于治疗扁平疣、疱疹、脓疱疮、肺炎、胆囊炎、败血症。《中药现代研究与应用》：“抗病毒、抗菌、抗恶性肿瘤、镇咳祛痰。”木贼性味甘、苦、平。归肺、肝经。散风热，退目翳。《中药现代研究与应用》：“抗病毒、抗衰老。现代常用于治疗传染性肝炎、尖锐湿疣、扁平疣、结膜炎。肿节风和木贼还有明显兴奋中枢的作用，很明显抑制肝、肾、脾的过氧化脂质的作用，能使人体器官延缓衰老，从而起到延年益寿的作用。”黄芩性味苦、寒。归肺、脾、胆、大肠、小肠经。清热燥湿，泻火解毒，清肺、利胆、止血、安胎。用于治疗湿温、暑温、胸闷呕恶、湿热痞满、泻痢、黄疸、热咳、高烧烦渴、血热吐衄，痈肿疮毒，胎动不安。《中药现代研究与应用》：“抗病原微生物，抗真菌、抗病毒、抗变态反应、抗原虫、抗炎、解痉、抗氧化。”此五味药，清热解毒、护心清肺、疏肝利胆，助君药清热解毒之功效，故共为臣药。本方以土贝母、余甘子为佐药。土贝母性味苦、微寒。归肺、脾经。散结消肿，解毒。常用于颈淋巴结核、慢性淋巴结核、乳痈癗疠、乳腺炎、肥厚性鼻炎。《中药现代研究与应用》：“抑制人免疫缺陷病毒(艾滋病)，对抗单纯疱疹病毒、抗癌、杀精子。有效治疗各种疣类和病毒感染的带状疱疹等皮肤病变。”余甘子性味甘、酸、寒。归心、肝、胆、脾经。清热凉血、疏肝利胆、消食健胃、益气敛汗、生津止渴。用于治疗血热血瘀、肝胆病、咽喉痛、咳嗽、消化不良、腹痛。《中药现代研究与应用》：“抗炎、抗菌、抗细胞毒，抗突变、诱生人白细胞干扰素、抗衰老。”此两味药共同佐君臣之品，清热解毒，又有增强体质、抗衰老之功，故为佐药。方中商陆性味苦、寒、有小毒。归肺、脾、肾、大肠经。利水消肿、解毒散结、祛痰。用于水肿胀满、二便不通、痈肿疮毒。《中药现代研究与应用》：“刺激淋巴细胞转化，诱生干扰素、抗病毒、抗菌、抗恶性肿瘤。现代常用于治疗肝炎、心源性及肝硬化腹水、慢性肾炎、血小板减少性紫癜、消化道出血，而且显著清除人体多项指标异常的DNA(病毒)。”商陆既可解毒散结、化痰利湿，又有引药透达三焦之功，邪毒得以出处，故为佐使之品。处方中的木贼、肿节风、余甘子三味药既抗病毒，又有兴奋中枢、诱生干扰素、清除自由基而达到延缓衰老的功效，全方不失为攻补兼施、扶正祛邪之法的涵盖。然而扶正祛邪、扶正培本乃为中医药的一大法则，本处方并非使用强攻强补，而是无补而补，在此充分得到体现。在治疗此类病毒性传染病方面在抑制病毒的同时又能提高人体免疫功能。这就是祛邪而不伤正。全方配伍，共收清热解毒、散结消肿、排脓敛疮、宣肺止咳、疏肝除胀、健脑安神、护脾止泻之功效。

本发明以上所述的中药组合物，按照药物制剂的常规方法制成各种临床上适宜的制剂。所述的制剂包括注射液、水煎剂、颗粒剂、胶囊剂以及片剂等。

进一步的，本发明还提出了一种制备以上所述的中药组合物的方法，包括以下步骤：

1)按照以上所述的重量份分别称取各原料药，将原料药粉碎后，混合，用75-85℃的70-90w/w％乙醇回流提取一次，1-2小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；所用乙醇的量为原料药混合后重量的10-15倍；

2)药渣再用纯净水回流提取一次，1.5-2.5小时，滤过；所用纯净水的量为原料药混合后重量的10-15倍；

3)将两次回流提取所得的药液混合一起继续浓缩至相对密度为1:1.1，喷雾干燥，粉碎，加入总质量8-12％的淀粉，混匀，制成颗粒，干燥，灭菌，即得颗粒剂，或将颗粒加入硬脂酸镁，混匀压片，制成片剂。或包括以下步骤：

1)按照所述的重量份分别称取各原料药，将原料药粉碎后，混合，用75-85℃的70-90w/w％乙醇回流提取一次，1-2小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；所用乙醇的量为原料药混合后重量的10-15倍；

3)将两次回流提取所得的药液混合一起继续浓缩至相对密度为1:1.35，然后将其重量2倍的90℃的70-90％乙醇徐徐兑入浓缩液中，同时搅拌，静置24小时后，滤过500目，回收乙醇，再将药液过滤20微目，滤液灌装小瓶，高温灭菌，即得注射剂。

另外，在多年的临床实践中，本发明发明人发现本处方配伍中再加上：胆汁盐和磷酸三丁酯，对清除或阻断各类病种的DNA指标有所增效。

因此，在此基础上，本发明还提出了另外一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物，由以下重量份的各原料药组成：金银花15-45份、五倍子5-30份、牛蒡子15-45份、苦参10-30份、木贼30-60份、肿节风15-45份、黄芩15-45份、土贝母10-30份、余甘子15-45份、商陆5-30份、胆汁盐0.2-0.5份以及磷酸三丁酯0.03-0.09份。

在本发明中，优选的，所述的中药组合物，由以下重量份的各原料药组成：金银花30份、五倍子15份、牛蒡子30份、苦参15份、木贼45份、肿节风30份、黄芩30份、土贝母15份、余甘子30份、商陆10份、胆汁盐0.3份以及磷酸三丁酯0.06份。

1)按照以上所述的重量份分别称取以下各原料药：金银花、五倍子、牛蒡子、苦参、木贼、肿节风、黄芩、土贝母、余甘子、商陆，将原料药粉碎后，混合，用75-85℃的70-90w/w％乙醇回流提取一次，1-2小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；所用乙醇的量为原料药混合后重量的10-15倍；

3)将两次回流提取所得的药液混合一起继续浓缩至相对密度为1:1.1，再加入权利要求3或4所述的重量份的胆汁盐以及磷酸三丁酯，充分搅拌均匀，喷雾干燥，粉碎，加入总质量8-12％的淀粉，混匀，制成颗粒，干燥，灭菌，即得颗粒剂，或将颗粒加入硬脂酸镁，混匀压片，制成片剂。或包括以下步骤：

3)将两次回流提取所得的药液混合一起继续浓缩至相对密度为1:1.35，然后将其重量2倍的90℃的70-90％w/w乙醇徐徐兑入浓缩液中，同时搅拌，静置24小时后，滤过500目，回收乙醇，然后加入所述重量份的胆汁盐和磷酸三丁酯搅匀，再将药液过滤20微目，滤液灌装小瓶，高温灭菌，即得注射剂。

体外实验研究结果表明，本发明的中药组合物能有效抑制野生和ETV耐药HBV的复制。与ETV相比较，本发明的中药组合物在抑制HBV DNA复制力方面弱于ETV，但在抑制病毒相关抗原分泌方面明显强于ETV。这一结果提示本发明的中药组合物具有不同于病毒逆转录酶抑制剂的抗病毒作用机制，故而有可能成为一种新型的抗HBV药物，特别适合因核苷(酸)类似物耐药突变而造成治疗失败的慢性HBV感染患者。

体内试验研究结果研究显示，本发明的中药组合物能有效抑制小鼠体内HBV DNA的复制和抗原的分泌，且随着药物剂量的增加而抑制作用增强；ETV只能强效抑制小鼠体内HBV DNA复制，而对病毒抗原的分泌没有抑制作用。免疫组织化学分析试验结果提示接受本发明的中药组合物治疗的小鼠肝脏内HBcAg表达阳性的肝细胞数比接受ETV治疗的小鼠明显减少，同时本发明的中药组合物在45mg kg^-1d^-1和22.5mg kg^-1d^-1剂量下对血清病毒DNA载量的抑制率分别为95.93％和90.89％，且这种抗病毒疗效持续了4周，而ETV组小鼠在停药4周后血清病毒载量则恢复到原来的数值。对比近期一项研究综述报道的9种传统中草药或其活性成分在动物模型上的抗HBV活性，该药用药时间在10–30天内对血清病毒载量的抑制率范围在17.51％–87.50％之间。因此这些实验结果表明本发明的中药组合物是一种理想的强效抗病毒药。

此外，临床试验还表明，本发明的中药组合物注射液是以快速杀灭HIV病毒，帮助机体重建免疫系统为目标的复方纯中药。

本试验结果表明单独使用本发明的中药组合物注射液抗HIV病毒效果显著，4周即可使pVL显著降低(图1)，CD4+T细胞数升高(图2)，临床症状明显改善(图4)，且安全无毒，患者愿意接受并能坚持治疗。本试验中，仅用本发明的中药组合物治疗4周即可使部分患者病毒载量降低到LDL以下(图2A)，CD4+T细胞数升高115个/ul以上(图2B)，并能减少机会性感染，改善临床症状。

因此，在此基础上，本发明还提出了所述的中药组合物在制备治疗传染性乙型肝炎和/或艾滋病药物中的用途。以及所述的中药组合物在制备治疗传染性肝病和/或艾滋病药物中的用途。

附图说明

图1为本发明的中药组合物对HepG2.2.15细胞和HepG2.A64细胞的细胞毒性试验；

细胞增殖抑制率采用MTT比色法计算，本发明的中药组合物浓度<10μg/mL时无明显的细胞毒性。*P<0.05vs.未加药孔；

图2为本发明的中药组合物对HBV复制细胞系中病毒复制和抗原表达的抑制；

本发明的中药组合物对HepG2.2.15细胞(A)和HepG2.A64细胞(C)内病毒复制中间体(HBV DNA)和细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的抑制作用；ETV对HepG2.2.15细胞(B)和HepG2.A64细胞(D)HBV DNA和HBsAg、HBeAg的抑制作用。虚线框表示50％有效抑制浓度；

图3为rAAV8-1.3HBV感染小鼠肝脏免疫组织化学和HE染色病理切片；

本发明的中药组合物组(A)，ETV组(B)，生理盐水组(C)小鼠HBcAg免疫组织化学病理切片图示中HBcAg表达阳性的肝细胞显示为棕红色。D，E，F分别为本发明的中药组合物组，ETV组，生理盐水组小鼠肝脏HE染色切片。图片放大倍数为200×；

图4为经本发明的中药组合物注射液治疗四周后患者血浆病毒载量(pVL)变化情况；

A为每个患者治疗前后pVL的差值；B为治疗前后pVL均值的变化；其中布包扣9、21、23和25号患者，衙门经过治疗后pVL降到了最低检测限(LDL)以下；C为治疗前pVL＞LDL的21名患者经治疗后pVL＜LDL的患者所占的比例情况。

图5为经本发明的中药组合物注射液治疗4周后患者CD⁴⁺T细胞数变化情况；

A为每个患者治疗前后CD⁴⁺细胞数的差值；B为CD⁴⁺细胞数均值在治疗前后的变化情况。

图6为经本发明的中药组合物注射液治疗4周后患者CD4/CD8比值的变化情况；

A为每个患者治疗前后CD4/CD8比值的差值；B为CD4/CD8比值的均值在治疗前后的变化情况。

图7为经本发明的中药组合物注射液治疗4周后有相关自述症状的患者人数的变化情况；

1、头晕；2、头痛；3、头脑不清晰；4、虚弱；5、腹泻；6、咳嗽；7、纳差；8、恶心呕吐；9、四肢酸痛；10、皮疹；11、低热；12、容易感冒；13、不能干体力活。

图8为本发明中药组合物1的HBV DNA的定量检测以及上清液中HBsAg和HBeAg检测结果；

图9为本发明中药组合物2的HBV DNA的定量检测以及上清液中HBsAg和HBeAg检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围下可以对本发明的技术方案和细节形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护的范围内。

实施例1一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物的制备

由以下重量各原料药组成：金银花30g、五倍子15g、牛蒡子30g、苦参15g、木贼45g、肿节风30g、黄芩30g、土贝母15g、余甘子30g以及商陆10g。

实施例2一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物的制备

由以下重量各原料药组成：金银花15g、五倍子30g、牛蒡子45g、苦参10g、木贼30g、肿节风45g、黄芩15g、土贝母30g、余甘子15g以及商陆30g。

实施例3一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物的制备

由以下重量各原料药组成：金银花40g、五倍子10g、牛蒡子40g、苦参15g、木贼35g、肿节风40g、黄芩20g、土贝母10g、余甘子40g以及商陆15g。

实施例4一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物的制备

由以下重量各原料药组成：金银花30g、五倍子15g、牛蒡子30g、苦参15g、木贼45g、肿节风30g、黄芩30g、土贝母15g、余甘子30g、商陆10g、胆汁盐0.3g以及磷酸三丁酯0.06g。

实施例5一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物的制备

由以下重量各原料药组成：金银花15g、五倍子30g、牛蒡子45g、苦参10g、木贼30g、肿节风45g、黄芩15g、土贝母30g、余甘子15g、商陆30g、胆汁盐0.2g以及磷酸三丁酯0.09g。

实施例6一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物的制备

由以下重量各原料药组成：金银花40g、五倍子10g、牛蒡子40g、苦参15g、木贼35g、肿节风40g、黄芩20g、土贝母10g、余甘子40g、商陆15g以及胆汁盐0.5g以及磷酸三丁酯0.04g。

实施例7一种同时具有抗HIV和HBV感染的颗粒剂或片剂的制备

包括以下步骤：

1)分别按照以下重量称取各原料药：金银花30g、五倍子15g、牛蒡子30g、苦参15g、木贼45g、肿节风30g、黄芩30g、土贝母15g、余甘子30g以及商陆10g。将原料药粉碎后，混合，用80℃90％w/w乙醇回流提取一次，1.5小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；所用乙醇的量为原料药混合后重量的12倍；

2)药渣再用纯净水回流提取一次，2小时，滤过；所用纯净水的量为原料药混合后重量的12倍；

3)将两次回流提取所得的药液混合一起继续浓缩至相对密度为1:1.1，喷雾干燥，粉碎，加入总质量10％的淀粉，混匀，制成颗粒，干燥，灭菌，即得颗粒剂；或将颗粒加入硬脂酸镁，混匀压片，制成片剂。

实施例8一种同时具有抗HIV和HBV感染的颗粒剂或片剂的制备

包括以下步骤：

1)分别按照以下重量称取各原料药：金银花30g、五倍子15g、牛蒡子30g、苦参15g、木贼45g、肿节风30g、黄芩30g、土贝母15g、余甘子30g、商陆10g。将原料药粉碎后，混合，用80℃70％w/w乙醇回流提取一次，1.5小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；所用乙醇的量为原料药混合后重量的12倍；

3)将两次回流提取所得的药液混合一起继续浓缩至相对密度为1:1.1，再加入胆汁盐0.3g以及磷酸三丁酯0.06g，充分搅拌均匀，喷雾干燥，粉碎，加入总质量10％的淀粉，混匀，制成颗粒，干燥，灭菌，即得颗粒剂，或将颗粒加入硬脂酸镁，混匀压片，制成片剂。

实施例9一种同时具有抗HIV和HBV感染的注射剂的制备

包括以下步骤：

1)分别按照以下重量称取各原料药：金银花30g、五倍子15g、牛蒡子30g、苦参15g、木贼45g、肿节风30g、黄芩30g、土贝母15g、余甘子30g以及商陆10g。将原料药粉碎后，混合，用80℃80％w/w乙醇回流提取一次，1.5小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；所用乙醇的量为原料药混合后重量的12倍；

3)将两次回流提取所得的药液混合一起继续浓缩至相对密度为1:1.35，然后将其重量2倍的90℃的90％w/w乙醇徐徐兑入浓缩液中，同时搅拌，静置24小时后，滤过500目，回收乙醇，再将药液过滤20微目，滤液灌装小瓶，高温灭菌，即得注射剂。

实施例10一种同时具有抗HIV和HBV感染的注射剂的制备

包括以下步骤：

3)将两次回流提取所得的药液混合一起继续浓缩至相对密度为1:1.35，然后将其重量2倍的90℃的70w/w％乙醇徐徐兑入浓缩液中，同时搅拌，静置24小时后，滤过500目，回收乙醇，然后加入胆汁盐0.3g以及磷酸三丁酯0.06g搅匀，再将药液过滤20微目，滤液灌装小瓶，高温灭菌，即得注射剂。

实施例11本发明的中药组合物在体内外抗乙型肝炎病毒(HBV)中的作用

一、材料与方法

1、实验材料

胎牛血清和DMEM培养基购自美国Gibco公司，荧光定量PCR检测试剂盒购自上海复星公司，酶联免疫吸附试验(ELISA)HBsAg和HBeAg检测试剂盒购自北京万泰公司，细胞培养板购自Corning公司。野生型HBV稳定复制细胞系HepG2.2.15细胞由解放军302医院病毒性肝炎研究室细胞库保藏，而恩替卡韦(ETV)耐药型HBV稳定复制细胞系HepG2.A64细胞则由解放军302医院病毒性肝炎研究室自主构建，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为C201163，该菌株已记载在发明名称为“C基因型恩替卡韦耐药突变HBV稳定复制表达细胞系”，专利号为ZL 201010586554.6的专利申请中。

本发明中药组合物注射液按照实施例9方法制备。拉米夫定(LAM)和恩替卡韦(ETV)由葛兰素公司生产。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，苏木精-伊红(HE)染色剂均购自Sigma公司，转染试剂盒FuGENE HD购自Roche公司。pGEM-Teasy载体购自Promega公司，质粒提取试剂盒购自上海生工公司。6-8周龄的雄性C57BL/6小黑鼠购自北京维通利实验技术有限公司，携带1.3拷贝HBV基因组的重组8型腺相关病毒(rAAV8-1.3HBV DNA)购自北京五加和分子医学研究所有限公司。PerCP标记的抗小鼠CD3ξ抗体、FITC标记的抗小鼠CD8a抗体、PE标记的抗小鼠CD107a抗体、APC标记的抗小鼠NK1.1抗体和PE标记的抗小鼠γ干扰素抗体均购自BD生物医学公司，多克隆抗小鼠核心抗原抗体购自DAKO公司。其他生化试剂购自Sigma公司。

2、方法

2.1细胞毒性试验

通过细胞形态学观察，了解药物对细胞的毒性作用，根据Mosmann等(Mosmann T.(1983)Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods 65:55–63.)建立的MTT比色分析法，判定各孔中存活细胞增殖代谢情况及细胞毒性反应。HepG2.2.15细胞和HepG2.A64细胞接种于96孔培养板，1×10⁵细胞/孔，于37℃度恒温孵厢内孵育18h待细胞贴壁后更换含有不同药物浓度的细胞培养液100μL，药物浓度依次为0、0.5﹑1﹑5﹑10﹑50﹑100μg/mL，48小时后换药一次，药物共作用96小时。之后加入10μL MTT染色液，继续培养4h，弃上清，用PBS洗板2遍，再加入含有MTT的培养液培养4h，弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜置摇床低速震荡10min，使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。同时设立相应调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同药物浓度的药物溶解介质、培养液)。

2.2细胞培养与药物处理方式

HepG2.2.15细胞和HepG2.A64细胞接种于24孔培养板(1×10⁵细胞/孔)含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养18h，待细胞贴壁后，换入含有不同本发明中药组合物(注射液)浓度的新培养液，药物浓度依次为0、0.1、0.5﹑1﹑5﹑10μg/mL，48小时后换药一次，药物共作用96小时。同时设立ETV为阳性对照组，药物浓度为0﹑0.01﹑0.1﹑1﹑10μmol/L，处理方式和作用时间同本发明中药组合物组。

2.3细胞内核心颗粒HBV DNA的提取及定量检测

参照文献(Ji D,Liu Y,Si L,Li L,Chen G,et al.(2011)Variable influence of mutational patterns in reverse-transcriptase domain on replication capacity of hepatitis B virus isolates from antiviral-experienced patients.Clin Chim Acta 412:305–313.)进行，具体步骤如下：培养细胞4天后(移除上清用于测定抗原)，加0.5％NP-40裂解液冰上裂解细胞；离心去除细胞核及胞膜碎片后转移上清加入含EDTA、Tris·HCL、NaCl、蛋白酶K和SDS的消化缓冲液，42℃水浴消化过夜；加入等体积的酚仿/异戊醇混合液抽提，离心；转移上清加入乙酸钠和异丙醇纯化DNA和乙醇脱盐沉淀DNA，开盖晾干；加入去离子水溶解。按照试剂盒操作说明进行实时荧光定量PCR检测HBV DNA载量，计算药物的50％抑制浓度(IC50)与治疗指数(TI＝CC50/IC50)。本发明中药组合物对病毒DNA的抑制率＝(1－加药孔病毒DNA载量/未加药孔病毒DNA载量)×100％。

2.4上清液中HBsAg和HBeAg检测

采用ELISA方法检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌量。药物对抗原的抑制率＝(对照组S/CO值－药物组S/CO值)/对照组S/CO值×100％。其中S(样本OD值)/CO(临界值)大于1认为样本是阳性。

2.5小鼠亚急性实验

将18只C57BL/6小鼠随机分成6组，每组3只。每组小鼠依次每天腹腔注射剂量为30、45、60、90、120mg kg^-1d^-1的本发明中药组合物注射液和生理盐水(NS)两周。每天观测小鼠体重，毛发，摄食和对刺激的反应性的改变。

2.6慢性乙肝小鼠模型的建立

将rAAV8-1.3HBV病毒经小鼠尾静脉注射至20只C57BL/6小鼠体内，这种慢性HBV感染小鼠模型(Dong X,Yu C,Wang G,Tian W,Lu Y,et al.(2010)Establishment of hepatitis B virus(HBV)chronic infection mouse model by in vivo transduction with a recombinant adeno-associated virus 8carrying 1.3copies of HBV genome(rAAV8-1.3HBV).Bing Du Xue Bao(in Chinese)26:425–431.)是建立在Huang LR等(Huang L,Wu H,Chen P,Chen D.(2006)An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci USA 103:17862–17867.)所建立的pAAV-HBV1.2慢性HBV感染小鼠模型基础之上，且被证实能持续稳定表达HBV DNA 6个月以上(Yang D,Liu L,Zhu D,Peng H,Su L,et al.(2013)A mouse model for HBV immunotolerance and immunotherapy.Cell Mol Immunol 11:71–78.)。注射剂量为1×10¹¹vg/200μL/只。注射病毒后每两周经小鼠的尾静脉采血一次检测血清HBV DNA载量，及HBsAg和HBeAg表达水平，共观察6周。若小鼠HBV DNA载量＞10⁴IU/mL，HBsAg和HBeAg水平＞2.0OD值，且持续时间超过4周则认为小鼠建模成功。

2.7动物模型上本发明中药组合物的抗HBV活性实验

将20只造模成功的慢性HBV感染小鼠模型随机分成4组，基于上述小鼠亚急性毒性试验结果，对每组小鼠的处理如下：实验组1为高剂量本发明中药组合物组(45.0mg kg^-1d^-1)，实验组2为低剂量本发明中药组合物组(22.5mg kg^-1d^-1)，阴性对照组为生理盐水组，阳性对照组为ETV组(1.0mg kg^-1d^-1)。处理方式均为每天经腹腔给药1次，连续给药2周。给药期间每周经小鼠的尾静脉采血一次，停药后每两周采血一次，检测小鼠血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg表达水平。整个动物实验在中国人民解放军第302医院实验动物中心完成，所采用的饲养和实验标准均严格按照美国健康研究所实验动物护理与利用指南进行。相应实验也获得了中国人民解放军第302医院伦理委员会的批准。

2.8小鼠肝脏HE染色与免疫组织化学分析

小鼠处死后将肝脏用10％福尔马林固定，石蜡包被，切片，5μm/片，用HE及抗小鼠HBcAg抗体进行染色，显微镜下观察。

2.9统计学分析

测量值以均数±标准差(x±s)表示。两组间的比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析检验。P＜0.05认为差异有显著性意义，所有的计算均在SPSS16.0软件中完成。

二、结果

1、本发明中药组合物的细胞毒性试验

检测药物对HepG2.2.15细胞和HepG2.A64细胞的毒性作用，消除因存活细胞减少而导致HBV DNA水平下降产生的实验误差。结果显示，本发明中药组合物在10μg/mL浓度下，细胞形态学和MTT比色A值在实验组和对照组间无显著性差异，提示在该浓度范围内本发明中药组合物对HepG2.2.15细胞和HepG2.A64细胞无毒性作用(图1)。依据毒性试验结果计算本发明中药组合物对HepG2.2.15细胞和HepG2.A64细胞的CC50分别为18.7μg/mL和19.1μg/mL。

2、本发明中药组合物对HepG2.2.15细胞野生HBV和HepG2.A64细胞ETV耐药HBV株的抑制

在实验浓度范围内，本发明的中药组合物对HepG2.2.15细胞和HepG2.A64细胞胞浆内核心颗粒DNA和细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的分泌均有明显抑制作用，并随着药物浓度的增加而增强(图2)。本发明的中药组合物在浓度为10μg/mL时对HepG2.2.15细胞和HepG2.A64细胞HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制率分别为75.1％、51.0％、64.1％和65.2％、42.9％、63.9％，而ETV在浓度为10μmol/L时抑制率则分别为94.7％、36.6％、19.8％和52.7％、9.4％、14.7％。本发明的中药组合物对野生HepG2.2.15细胞的IC50为1.8μg/mL，对耐药HepG2.A64细胞的IC50为2.1μg/mL，故耐药病毒株对本发明的中药组合物的耐药倍数为1.2倍。而ETV对野生HepG2.2.15细胞的IC50为0.016μmol/L，对耐药HepG2.A64细胞的IC50为11.4μmol/L，故耐药病毒株对ETV的耐药倍数为712.5倍。本发明的中药组合物对HepG2.2.15细胞和HepG2.A64细胞的治疗指数则分别为10.39和9.10。

3、本发明的中药组合物对小鼠的亚急性毒性试验

检测药物对小鼠的亚急性毒性作用，消除因药物毒副作用过大而对动物的生存质量造成明显影响，从而确立最佳的给药剂量。结果显示，本发明的中药组合物在30mg kg^-1d^-1和45mg kg^-1d^-1剂量下对小鼠没有明显的毒副作用。而当剂量≧60mg kg^-1d^-1时有明显的毒副作用，且随着剂量的增加毒副作用增大，甚至可以引起小鼠死亡。

4、本发明的中药组合物在慢性HBV小鼠模型上的抗HBV活性

20只C57BL/6小鼠注射剂量为1×10¹¹vg/只的rAAV8-1.3HBV后，观察6周发现小鼠血清HBV载量均持续表达在10⁴IU/mL以上，故认为造模成功。依据小鼠亚急性毒性试验结果设立本发明的中药组合物如下实验剂量分组：高剂量组-45mg kg^-1d^-1，低剂量组-22.5mg kg^-1d^-1。给药2周后与阴性对照组相比，高剂量组，低剂量组，ETV组的小鼠平均血清HBV DNA载量分别下降1.39、1.04和2.07log10IU/mL(表1)；平均血清HBsAg分别下降了48.68％、19.87％和13.58％；平均血清HBeAg分别下降了51.71％、22.93％和14.63％(表2)。

表1.本发明的中药组合物和ETV对rAAV8-1.3HBV感染小鼠血清HBV DNA(log₁₀IU/mL)的抑制作用

*P<0.05vs.同时间点生理盐水阴性对照组

表2.本发明的中药组合物和ETV注射两周后对rAAV8-1.3HBV感染小鼠血清HBsAg和HBeAg的抑制作用

*P<0.05vs.同时间点生理盐水阴性对照组

5、本发明的中药组合物对小鼠肝脏HBcAg表达阳性的肝细胞的抑制作用

小鼠肝脏HBcAg免疫组织化学分析实验结果显示，与ETV组和生理盐水组小鼠相比，高剂量本发明的中药组合物组小鼠肝脏HBcAg表达阳性的肝细胞数明显减少(图3)。每高倍镜视野下(×200)高剂量本发明的中药组合物组，ETV组和生理盐水组小鼠肝脏切片中HBcAg表达阳性的肝细胞数分别为:18.0±7.3，42.8±13.0和56.7±17.2，差异具有统计学意义。

实施例12本发明的中药组合物在治疗艾滋病中的作用

1、实验材料和方法

患者的选择入选标准：年龄>18岁，HIV抗体经酶联免疫法(EUSA)和Western blot法确认为阳性，自愿参加本试验并签署书面知情同意书。排除标准：HIV脑病、恶病质、或因其它身体或精神疾病导致失去判断能力，不能理解本实验过程和要求并按要求完成实验、正在怀孕或哺乳等。

试验地点和招募方法：试验地点在河南省柘城县，患者来自于柘城县人民医院及各乡镇卫生所门诊，均为农民。按美国疾病控制中心1993年的诊断标准，共招募了28个患者，发病时间在2000-2004年。其中男性10例，女性18例，年龄最大61岁，最小35岁，平均年龄45±8岁。所有患者都曾服过相关机构免费发放的药品，均因为忍受不了药物毒副作用己停药1月以上。

供试药物本发明的中药组合物注射液的冻干粉由实施例9的注射液冻干后得到，每瓶含复方中药提取物500mg，使用前用25m1无菌注射用水溶解后加入500ml 5％葡萄糖注射液中静脉滴注。

实验设计：本试验是一个在柘城县医院门诊部开展的开放试验，为期4周。患者散居于柘城县各乡镇村落，所有患者首先经过7天的洗脱期，在洗脱期停用任何抗HIV病毒药物。然后开始接受供试品单独治疗，剂量1500mg/日，一日1次，不再服用其它任何中、西药物。同时密切观察患者输液时及输液后6小时内的反应；在试验前后采集患者空腹血样检测相应指标。

安全评价：在治疗前后对患者进行详细体检，包括血常规、尿常规、心电图、X线胸透等，以了解患者身体状态和观察毒副作用。每次输液时均有医护人员看护观察；并每天询问患者有无食欲减退、乏力、失眠、消瘦、发热、腹泻等副作用；随时回答和解决患者遇到的各种问题，直至试验结束后2周。试验过程中，如大夫认为治疗对患者不利，可随时终止治疗，患者亦可根据自身判断随时要求退出治疗。血样采集对患者登记编号后，于早11点抽取空腹静脉血5ml做临床常规检查，另取10m1注入加有K3一EDTA抗凝剂(最终浓度为1-5％)的无菌真空采血管中，与抗凝剂充分混合，室温下连夜将血样从河南送到北京，于次日早8点送达北京佑安医院感染科实验室，混匀后取0.2-0.5m1全血立即用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群，剩余血液离心分离血浆置冻存管中，-80℃冰箱保存，留做病毒载量检查。

疗效观察指标：以血浆HIV RNA病毒载量(pVL)和T淋巴细胞亚群变化作为主要的疗效判断指标，治疗前后各测量一次。CD4+和CD8+T细胞计数采用BD公司的流式细胞仪用绝对计数法进行检测。pVL检测采用核酸序列测试(NASBA)法(Organon Teknika公司，最低检测限(LDL)40拷贝/m1)。

数据统计方法：用SPSS统计分析软件分别采用配对方差分析、秩和检验和卡方检验对指标变化进行分析，显著性水平为P<0.05。

2、结果

患者基本情况在2006年10、11月份，共有17名参加者陆续完成治疗，其余11名患者在2008年4、5月份完成试验治疗，治疗前后患者血、尿常规、心电图、X线胸透等均无显著变化，无退出者，无死亡者。pVL检测结果显示在2006年的试验中有7名患者基线pVL<LDL(表3)。

表3患者基本情况

Abbreviations；RBC，ReJ blood cells；WBC，White blood cells；PLT，Plate lets:pVI，PIasma viral load；

LDL，Lower detection limit.

本发明的中药组合物注射液治疗4周后患者pVL显著降低如图4所示，治疗前pVL>LDL的21名患者中有14名(67％)经4周的治疗后pVL下降(图4A，表4)，其中更有4名(19％)降低到了LDL以下(图4C，表2，P＝0.015)，pVL反映病毒在体内繁殖的程度，是临床判断病情进展和药物疗效的主要指标，这个结果显示本发明的中药组合物注射液降低pVL的速度比较快，效果也比较好。

表4治疗前后CD4细胞数和血浆病毒载量水平的变化情况

Abbreviations：ND，Not Detected；pVL，Plasm viral load；LDL，Lower detection limit.

^aData are normally distributed.

CD4+T细胞数变化情况图5B显示治疗4周后CD4+T细胞平均数从治疗前的347.00±205.43个/ul增加到444.29±263.12个/ul。在做了检测的25份血样中有17名(68％)患者的CD4+T细胞数比实验前升高(表2，P＝0.028)，表明患者的细胞免疫功能增强。

CD4，CD8比值变化情况与基线相比，CD4，CD8比值亦升高，但没有统计学显著性意义(图6)。

经本发明的中药组合物治疗4周后患者I临床和自觉症状明显改善治疗期间，患者配合良好，表5和图7显示在2006年完成治疗的17名患者均自述身体状况好转，与艾滋病相关的症状减少或消失。

表5治疗前后自述有与AIDS相关的临床症状的患者人数的变化情况

毒副作用临床检查发现，使用本发明的中药组合物注射液治疗4周对患者血、尿常规、X线胸部透视、心电图、及肾脏、肝脏功能无异常影响。治疗前后各指标平均值均在正常值范围。患者未出现食欲减退、乏力、失眠、消瘦、发热、腹泻等副作用。

对比例

为了说明在本处方配伍中再加上胆汁盐和磷酸三丁酯，对清除或阻断HBV的DNA指标有所增效，本发明进行了以下对比试验：

1、药物

中药组合物1：按照实施例9方法制备的注射剂

中药组合物2：按照实施例10方法制备的注射剂

2、方法

细胞培养与药物处理方式、细胞内核心颗粒HBV DNA的提取及定量检测以及上清液中HBsAg和HBeAg检测方法同实施例11。

3、结果

中药组合物1和2的HBV DNA的定量检测以及上清液中HBsAg和HBeAg检测结果如图8以及图9所示，从图中可以看出，在有效浓度的范围中药组合物1对HBV的最大抑制率为59.20％。对HBV标志物的抑制率为:HBsAg:27.31％；HBeAg:64.46％。中药组合物2对HBV的最大抑制率为82.17％。对HBV标志物的抑制率为: HBsAg:31.09％；HBeAg:29.11％。因此，综合来看，中药组合物2具有比中药组合物1更好的清除或阻断HBV的作用。

Claims

1.一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的各原料药组成：金银花15-45份、五倍子5-30份、牛蒡子15-45份、苦参10-30份、木贼30-60份、肿节风15-45份、黄芩15-45份、土贝母10-30份、余甘子15-45份以及商陆5-30份，优选的，所述的中药组合物，由以下重量份的各原料药组成：金银花30份、五倍子15份、牛蒡子30份、苦参15份、木贼45份、肿节风30份、黄芩30份、土贝母15份、余甘子30份以及商陆10份。

2.一种同时具有抗HIV和HBV感染的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的各原料药组成：金银花15-45份、五倍子5-30份、牛蒡子15-45份、苦参10-30份、木贼30-60份、肿节风15-45份、黄芩15-45份、土贝母10-30份、余甘子15-45份、商陆5-30份、胆汁盐0.2-0.5份以及磷酸三丁酯0.03-0.09份，优选的，所述的中药组合物，由以下重量份的各原料药组成：金银花30份、五倍子15份、牛蒡子30份、苦参15份、木贼45份、肿节风30份、黄芩30份、土贝母15份、余甘子30份、商陆10份、胆汁盐0.3份以及磷酸三丁酯0.06份。

3.如权利要求1或2所述的中药组合物，其特征在于，按照药物制剂的常规方法制成各种临床上适宜的制剂。

4.如权利要求3所述的中药组合物，其特征在于，所述的制剂包括注射剂、水煎剂、颗粒剂、胶囊剂或片剂。

5.一种制备权利要求1所述的中药组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按照权利要求1所述的重量份分别称取各原料药，将原料药粉碎后，混合，用75-85℃的70-90％乙醇回流提取一次，1-2小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；所用乙醇的量为原料药混合后重量的10-15倍；

3)将两次回流提取所得的药液混合一起继续浓缩至相对密度为1:1.1，喷雾干燥，粉碎，加入总质量8-12％的淀粉，混匀，制成颗粒，干燥，灭菌，即得颗粒剂，或将颗粒加入硬脂酸镁，混匀压片，制成片剂。

6.一种制备权利要求1所述的中药组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.一种制备权利要求2所述的中药组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按照权利要求2所述的重量份分别称取以下各原料药：金银花、五倍子、牛蒡子、苦参、木贼、肿节风、黄芩、土贝母、余甘子、商陆，将原料药粉碎后，混合，用75-85℃的70-90％乙醇回流提取一次，1-2小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；所用乙醇的量为原料药混合后重量的10-15倍；

3)将两次回流提取所得的药液混合一起继续浓缩至相对密度为1:1.1，再加入权利要求2所述的重量份的胆汁盐以及磷酸三丁酯，充分搅拌均匀，喷雾干燥，粉碎，加入总质量8-12％的淀粉，混匀，制成颗粒，干燥，灭菌，即得颗粒剂，或将颗粒加入硬脂酸镁，混匀压片，制成片剂。

8.一种制备权利要求2所述的中药组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按照权利要求2所述的重量份分别称取各原料药，将原料药粉碎后，混合，用75-85℃的70-90％乙醇回流提取一次，1-2小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味；所用乙醇的量为原料药混合后重量的10-15倍；

3)将两次回流提取所得的药液混合一起继续浓缩至相对密度为1:1.35，然后将其重量2倍的90℃的70-90％乙醇徐徐兑入浓缩液中，同时搅拌，静置24小时后，滤过500目，回收乙醇，然后加入权利要求2所述重量份的胆汁盐和磷酸三丁酯搅匀，再将药液过滤20微目，滤液灌装小瓶，高温灭菌，即得注射剂。

9.权利要求1或2所述的中药组合物在制备治疗传染性乙型肝炎和/或艾滋病药物中的用途。

10.权利要求3或4所述的中药组合物在制备治疗传染性乙型肝炎和/或艾滋病药物中的用途。