CN105969910A - 一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法 - Google Patents

一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105969910A
CN105969910A CN201510996088.1A CN201510996088A CN105969910A CN 105969910 A CN105969910 A CN 105969910A CN 201510996088 A CN201510996088 A CN 201510996088A CN 105969910 A CN105969910 A CN 105969910A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gexp
virus
primer
pcr
csfv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510996088.1A
Other languages
English (en)
Inventor
王印
胡凌
杨泽晓
姚学萍
林星宇
邬旭龙
李桂黎
任梅渗
肖璐
张鹏飞
曾相杰
冷伊依
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Agricultural University
Original Assignee
Sichuan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Agricultural University filed Critical Sichuan Agricultural University
Priority to CN201510996088.1A priority Critical patent/CN105969910A/zh
Publication of CN105969910A publication Critical patent/CN105969910A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP‑PCR方法，采用含7种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV,ASFV,PPV，PRRSV，CSFV,PCV2,JEV嵌合引物和通用引物以适当配比参加PCR反应，PRV,ASFV,PPV上下游特异性嵌合引物的浓度均为1.5μM，PRRSV,CSFV,PCV2,JEV上下游特异性嵌合引物的浓度均为1μM，特异性嵌合引物的最佳退火温度为60℃，通用引物最佳退火温度为50℃。本发明改善了多重PCR过程中不同靶基因的扩增偏好性，从而提高目的基因的检测效率，提高了检测的特异性，大大提高了分辨率和灵敏度，从而实现猪繁殖障碍病毒的快速检测。

Description

一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法
技术领域
本发明属于繁殖障碍病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法。
背景技术
重GeXP-PCR技术是一种基于多重PCR技术、毛细管电泳分离技术与高灵敏激光诱导荧光技术而开发出来的一种检测分析系统。它将荧光标记的通用引物与特异嵌合引物按一定比例同时加入一个PCR反应体系，利用反应中占主导地位的通用引物引发扩增来避免扩增中所产生的偏爱性问题，并用毛细管电泳对多重PCR产物进行检测，根据片段大小分离不同基因，根据荧光信号强度不同显示模板含量的差别，在很大程度上提高了检测的灵敏度和速度，并且仅用极少量总RNA(20ng)即可在同一个体系里对多达40个目的基因进行有效分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，旨在改善多重PCR过程中不同靶基因的扩增偏好性，提高目的基因的检测效率，实现猪繁殖障碍病毒的快速检测。
本发明是这样实现的，一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，所述检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法采用含7种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV,ASFV,PPV，PRRSV，CSFV,PCV2,JEV嵌合引物和通用引物以适当配比参加 PCR反应，PRV,ASFV,PPV上下游特异性嵌合引物的浓度均为1.5μM，PRRSV,CSFV,PCV2,JEV上下游特异性嵌合引物的浓度均为1μM，特异性嵌合引物的最佳退火温度为60℃，通用引物的最佳退火温度为50℃。
进一步，所述检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法包括以下步骤：
待测样品制备，按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病毒的细胞增殖液的全基因组，若为RNA病毒则进行反转录制备用于检测的cDNA；
PCR扩增：25μL PCR反应液包含:ExTaq酶12.5μL、引物Mix 9μL、待测样品DNA 1μL、无核酸酶灭菌水2.5μL；其中，所述引物Mix含有：PRV,ASFV,PPV上下游特异性嵌合引物各1.5μM；PRRSV,CSFV,PCV2,JEV上下游特异性嵌合引物各1μM；上下游通用引物各20μM,共9μL；
按如下步骤进行扩增:95℃30s，60℃30s，72℃25s，12个循环；95℃30s，50℃30s，72℃25s，20个循环；72℃5min；
毛细管电泳：取1μl 10倍稀释了的PCR产物加入到预先配置好的39μl上样缓冲液中(38.75μl SLS+0.25μl DSS-400)，混匀过后再每孔上方滴一滴矿物油以防止液体政法所带来的交叉污染，最后再在上样缓冲板对应的孔中加入大约250μl的分离缓冲液，准备完成后放入GenomeLabTM GeXP System选择Frag-3分离方法进行多重基因表达系统毛细管电泳分析；
使用自定义GeXP片段分析参数对分离后的片段分析，判定结果。
进一步，所述7种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV,ASFV,PPV，PRRSV，CSFV,PCV2,JEV嵌合引物的序列如下：
PRV F:AGGTGACACTATAGAATAAGGGGTTGGACAGGAAGGA
R:GTACGACTCACTATAGGGAGCATCGCCAACTTCTTCCA
CSFV F:AGGTGACACTATAGAATAAGGCCTCACCACTACGTGGA
R:GTACGACTCACTATAGGGAAGGTGGGTAGAGCCCTCTTA
ASFV F:AGGTGACACTATAGAATATGGCCCTCTCCTATGCAA
R:GTACGACTCACTATAGGGATGCGTCCGTAATAGGAGT
PRRSV F:AGGTGACACTATAGAATAACCTCCAGATGCCGTTTGT
R:GTACGACTCACTATAGGGAACAAGGTTTACCACTCCCT
PPV F:AGGTGACACTATAGAATAACCTAAGTCCAAGTGACTGCT
R:GTACGACTCACTATAGGGATAGGTTAGTAGCGATACCCA
PCV2F:AGGTGACACTATAGAATATGCAGAAGCGTGATTGGAAGA
R:GTACGACTCACTATAGGGAACGGGGTCTGATTGCTGGTA
JEV F:AGGTGACACTATAGAATAAGGAGCCATCGTGGTGGAGT
R:GTACGACTCACTATAGGGATCCATCTCGACCAGCACCT。
进一步，所述7种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV,ASFV,PPV，PRRSV，CSFV,PCV2,JEV嵌合引物的各条带大小如下：PRV:156-160bp,CSFV:195-196bp,ASFV:227-288bp,PRRSV:258-261bp,PPV:284-285bp,PCV2:337-341bp and JEV:360-361bp。
进一步，所述检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法：
对PRV的最低检测量为103copies/μl；
对CSFV的最低检测量为102copies/μl；
对ASFV的最低检测量为103copies/μl；
对PRRSV的最低检测量为102copies/μl；
对PPV的最低检测量为103copies/μl；
PCV2的为102copies/μl，JEV的为103copies/μl；
当7种病毒同时存在时，最低检测限度为1000copies/μl。
本发明提供的检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，能在一个反应中方便快速地同时检测7种相关病毒，为猪繁殖障碍病毒的快速鉴别诊断提供了技术支持，对疾病的预防控制提供了理论依据。本方法采用含7种猪繁殖障碍病毒靶基因的嵌合引物和通用引物以适当配比参加PCR反应(通用引物在PCR扩增过程中起主导作用)，改善了多重PCR过程中不同靶基因的扩增偏好性，从而提高目的基因的检测效率；根据荧光标记的PCR产物片段长度来确定目的片段，提高了检测的特异性；采用毛细管电泳对荧光标记的PCR产物进行分离和检测，大大提高了分辨率和灵敏度，从而实现猪繁殖障碍病毒的快速检测。本发明具有良好的方法学特征：建立了一种特异性好、灵敏度高、稳定性强和节时省力的GeXP-PCR检测方法；为混合感染疾病的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效的手段，为今后出入境动物检疫和相应疫病控制提供了技术保障；对满足进出境动物检疫工作的需要，控制繁殖障碍病病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有十分重要的意义。
附图说明
图1是本发明实施例提供的检测猪繁殖障碍病毒的操作流程图。
图2是本发明实施例提供的检测猪繁殖障碍病毒的单重GeXP-PCR引物特异性验证结果图；
图中：a、PRV:156-160bp；b、CSFV:195-196bp；c、ASFV:227-288bp；d、PRRSV:258-261bp；e、PPV:284-285bp；f、PCV2:337-341bp；g、JEV:360-361bp；h、阴性对照。
图3是本发明实施例提供的在多引物体系中每个反应无交叉反应性示意图；
图中：a、模板为PRV+CSFV+PRRSV+PCV2+JEV；b、模板为CSFV+ASFV+PRRSV+PCV2；c、模板为CSFV+PRRSV+PCV2；d、模板为CSFV+ASFV。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例的检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法包括以下步骤：
S101：待测样品制备，按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病毒的细胞增殖液的全基因组，若为RNA病毒则进行反转录制备用于检测的cDNA；
S102：PCR扩增：25μL PCR反应液包含，ExTaq酶12.5μL、引物Mix 9μL、待测样品DNA1μL、无核酸酶灭菌水2.5μL；其中，所述引物Mix含有：PRV,ASFV,PPV上下游特异性嵌合引物各1.5μM；PRRSV,CSFV,PCV2,JEV上下游特异性嵌合引物各1μM；上下游通用引物各20μM,共9μL；
S103：按如下步骤进行扩增:95℃30s，60℃30s，72℃25s，12个循环；95℃30s，50℃30s，72℃25s，20个循环；72℃5min；
S104：毛细管电泳：取1μl 10倍稀释了的PCR产物加入到预先配置好的39μl 上样缓冲液中(38.75μl SLS+0.25μl DSS-400)，混匀过后再每孔上方滴一滴矿物油以防止液体政法所带来的交叉污染，最后再在上样缓冲板对应的孔中加入大约250μl的分离缓冲液，准备完成后放入GenomeLabTM GeXP System选择Frag-3分离方法进行多重基因表达系统毛细管电泳分析；
S105：使用自定义GeXP片段分析参数对分离后的片段分析，判定结果。
下面结合实验对本发明的应用效果作进一步的说明。
1.材料和方法
1.1.病毒
ASFV是由人工合成的质粒，其他阳性样本和阴性样本见表1，所有的疫苗都来自于商业资源。
表1.样本来源和GeXP实验结果
PRV:Pseudorabies；CSFV:Classical Swine Fever Virus；ASFV:African SwineFever Virus；PRRSV:Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus；PPV:Porcine Parvovirus；PCV2:Porcine Circovirus type 2；JEV:Japanese EncephalitisVirus.SAU:Sichuan Agricultural University；MVRI:Military Veterinary ResearchInstitute；NAFU:Northwest A&F University.
1.2.主要试剂及仪器
1.3.主要试剂：克隆宿主菌E.coli DH5α由四川农业大学动物检疫实验室提供；蛋白酶K购于Sigma公司；Premix Taq、DL2000 DNAMarker、pMD19-T载体、反转录试剂盒均购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；琼脂糖购自Biowest；GenomeLabTM Separation Gel、GenomeLabTM GeXP Start Kit、 GenomeLabTM SeparationBuffer、GenomeLab Sample Loading Solution、DNA Size Standard-400and Mineral Oil购自美国Beckman公司，其余试剂均为国产分析纯。
主要仪器：凝胶成像系统和梯度PCR扩增仪，美国BIO-RAD有限公司；GenomeLabTMGeXP遗传分析系统，美国Beckman公司；高速冷冻离心机，Heraens有限公司；DYY-7C电泳仪和电泳槽，北京市六一仪器厂等。
1.3核酸的提取及反转录
按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病毒的细胞增殖液的全基因组，若为RNA病毒则进行反转录制备用于检测的cDNA。
反转录按照反转录试剂盒说明书在10μl体系中进行：2μl 5×PrimeScriptbuffer(包括dNTP Mixture和Mg+)，0.5μl PrimeScript RT Enzyme Mix I，25pmol OligodT Primer，200pmol Random 6mers,3μl模板，2μl RNase Free dH2O。在PCR仪上37℃反应15min，然后再85℃反应5sec。cDNA保存在-20℃。
1.4临床样本，临床病料来自四川齐全等猪场送检的流产胎儿，共58份，包括肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等均由四川农业大学动物检疫实验室保存(表1)。
1.5.GeXP-PCR引物的设计
参照GenBank中PRV gB(JF797219)、CSFV E2(KC533781)、ASFV P72(AY578708)、PRRSV(AY262352)、PPV NS1(AY583318)、PCV2ORF1(AY678532)和JEV E(M55506)基因组序列，选取保守序列，借助DNAStar和Oligo 6.0软件，设计7对引物特异性引物，再将一段通用(非同源性序列)引物标签(TagF:5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’.TagR:5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’)分别加在各病毒特异性引物的5’，构成特异性嵌合引物。上游通用引物的5’用Cy5进行标记，引物由上海生工合成(表2)。
表2.GeXP引物信息
注：下划线表示的是通用引物.
1.5.测序
用不含有通用序列的特异性引物分别扩增7种阳性样本的DNA/cDNA，ddH2O为阴性对照，进行扩增单重PCR扩增。用E.Z.N.A.TM胶回收试剂盒(OMEGA)，按照说明书的操作步骤回收扩增片段，纯化回收的目的片段与pMD19-T载体连接后转化于DH5α受体菌中。阳性克隆产物扩大培养后送交宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。测序结果用DNASTARsoftware进行分析，并GenBank登录的各病毒的基因序列进行比对。其结果显示各病毒基因序列与NCBI中登录的各病毒基因序列的核苷酸同源性均高达99％。
2.1.单重GeXP-PCR实验
以DNA/cDNA为模板进行单重GeXP-PCR反应，确定各靶基因的实际检测大小。在整个实验中都以无核酸酶的水为空白对照，将特异性嵌合引物稀释至1μM，Cy5-Tag F和Tag R稀释至10μM，采用25μl PCR反应体系在Thermo PCR扩增仪上进行扩增(表3)。
取1μl 10倍稀释了的PCR产物加入到预先配置好的39μl上样缓冲液中(38.75μlSLS+0.25μl DSS-400)，混匀过后再每孔上方滴一滴矿物油以防止液体政法所带来的交叉污染，最后再在上样缓冲板对应的孔中加入大约250μl的分离缓冲液，准备完成后放入GenomeLabTM GeXP System选择Frag-3分离方法进行多重基因表达系统毛细管电泳分析。毛细管电泳结束后，使用自定义GeXP片段分析参数对分离后的片段分析，以确定各靶基因对应的实际检测长度(信号值超过2000A.U.即为阳性)。
表3.PCR反应体系及条件
2.2.多重GeXP-PCR检测体系的建立及优化
用已经确定的病毒核酸作为模板，无核酸酶的水为空白对照。等量混合各特异性嵌合引物，使其工作浓度为1μM，其余反应条件同单重GeXP-PCR，建立多重GeXP-PCR检测反应体系。
调节各重组质粒的浓度，以7种病毒的重组质粒混合物(各病毒质粒浓度一致)为模板，以改变某一参数固定其它参数的方式分别对多重GeXP-PCR检测反应进行优化。反应条件中退火温度最为重要，本实验以57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、 62℃为退火温度，做梯度PCR以确定最佳退火温度。多重GeXP-PCR反应体系中各特异性嵌合引物的浓度与比例至关重要，本实验涉及两种引物，预实验中发现通用引物的浓度变化对实验结果影响不大，故将其固定为20μM，针对各病毒嵌合引物设计一个正交实验，用以确定各病毒特异性嵌合引物的最佳浓度比。
取1μl 10倍稀释了的PCR产物进行多重基因表达系统毛细管电泳分析。毛细管电泳结束后，使用自定义GeXP片段分析参数对分离后的片段分析，以确定各靶基因对应的实际检测长度(信号值超过2000A.U.即为阳性)。
2.3GeXP多重PCR反应特异性及灵敏度
根据多重反应体系优化结果，配制多重混合引物工作液，用建立的GeXP多重检测体系分别对表1中的各阳性样本进行PCR反应，产物用毛细管电泳进行检测，验证GeXP多重PCR检测体系的特异性；以随机混合的带目的片段的重组质粒为模板进行PCR反应，测其交叉反应性。
将含有各病毒目的片段的克隆质粒进行10倍连续梯度稀释至：105拷贝/μl，104拷贝/μl，103拷贝/μl，102拷贝/μl，101拷贝/μl，先进行GeXP单重PCR扩增，观察其最低检测限，再以各梯度等比混合液为模板，用最优的GeXP多重PCR进行扩增，观察其最低检测限。
2.4临床样本的检测
对58份已通过国标验证为阳性的临床样品进行多重GeXP-PCR检测(表1)，并对两者的检测结果进行比较。
3结果
3.1单重GeXP-PCR实验
在单重GeXP-PCR实验中，每对特异性引物都能扩增出相应地目的片段，阴性 样本扩增结果均为阴性，各条带大小如下：PRV:156-160bp,CSFV:195-196bp,ASFV:227-288bp,PRRSV:258-261bp,PPV:284-285bp,PCV2:337-341bp and JEV:360-361bp(图2)
3.2多重GeXP-PCR检测体系的建立及优化
正交实验的结果显示：PRV,ASFV,PPV上下游特异性嵌合引物的最适浓度均为1.5μM，PRRSV,CSFV,PCV2,JEV上下游特异性嵌合引物的最适浓度均为1μM,上下游通用引物为20μM。特异性嵌合引物的最佳退火温度为60℃，通用引物的最佳退火温度为50℃。
3.3GeXP多重PCR反应特异性及灵敏度
在多引物体系中，每个反应只出现特异性信号，并且无交叉反应性(图3)
GeXP单重PCR灵敏度结果显示，对PRV的最低检测量为103copies/μl，对CSFV的最低检测量为102copies/μl，对ASFV的最低检测量为103copies/μl，对PRRSV的最低检测量为102copies/μl，对PPV的最低检测量为103copies/μl，PCV2的为102copies/μl，JEV的为103copies/μl。当7种病毒同时存在时，GeXP多重PCR的最低检测限度为1000copies/μl。
3.3临床样本的检测
通过对已验证为阳性的58份临床样品的检测，发现其结果与国标检测结果一致(表1)，本发明可同时检测出7种病原体，在节约人力、物力的同时能够快速对临床样本作出诊断。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法采用含7种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV,ASFV,PPV，PRRSV，CSFV,PCV2,JEV嵌合引物和通用引物以适当配比参加PCR反应，PRV,ASFV,PPV上下游特异性嵌合引物的浓度均为1.5μM，PRRSV,CSFV,PCV2,JEV上下游特异性嵌合引物的浓度均为1μM，特异性嵌合引物的最佳退火温度为60℃，通用引物的最佳退火温度为50℃。
2.如权利要求1所述的检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法包括以下步骤：
待测样品制备，按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病毒的细胞增殖液的全基因组，若为RNA病毒则进行反转录制备用于检测的cDNA；
PCR扩增：25μL PCR反应液包含:ExTaq酶12.5μL、引物Mix 9μL、待测样品DNA 1μL、无核酸酶灭菌水2.5μL；其中，所述引物Mix含有：PRV,ASFV,PPV上下游特异性嵌合引物各1.5μM；PRRSV,CSFV,PCV2,JEV上下游特异性嵌合引物各1μM；上下游通用引物各20μM,共9μL；
按如下步骤进行扩增:95℃30s，60℃30s，72℃25s，12个循环；95℃30s，50℃30s，72℃25s，20个循环；72℃5min；
毛细管电泳：取1μl 10倍稀释了的PCR产物加入到预先配置好的39μl上样缓冲液中(38.75μl SLS+0.25μl DSS-400)，混匀过后再每孔上方滴一滴矿物油以防止液体政法所带来的交叉污染，最后再在上样缓冲板对应的孔中加入大约250μl的分离缓冲液，准备完成后放入GenomeLabTM GeXP System选择Frag-3分离方法进行多重基因表达系统毛细管电泳分析；
使用自定义GeXP片段分析参数对分离后的片段分析，判定结果。
3.如权利要求1所述的检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述7种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV,ASFV,PPV，PRRSV，CSFV,PCV2,JEV嵌合引物的序列如下：
PRV F:AGGTGACACTATAGAATAAGGGGTTGGACAGGAAGGA
R:GTACGACTCACTATAGGGAGCATCGCCAACTTCTTCCA
CSFV F:AGGTGACACTATAGAATAAGGCCTCACCACTACGTGGA
R:GTACGACTCACTATAGGGAAGGTGGGTAGAGCCCTCTTA
ASFV F:AGGTGACACTATAGAATATGGCCCTCTCCTATGCAA
R:GTACGACTCACTATAGGGATGCGTCCGTAATAGGAGT
PRRSV F:AGGTGACACTATAGAATAACCTCCAGATGCCGTTTGT
R:GTACGACTCACTATAGGGAACAAGGTTTACCACTCCCT
PPV F:AGGTGACACTATAGAATAACCTAAGTCCAAGTGACTGCT
R:GTACGACTCACTATAGGGATAGGTTAGTAGCGATACCCA
PCV2F:AGGTGACACTATAGAATATGCAGAAGCGTGATTGGAAGA
R:GTACGACTCACTATAGGGAACGGGGTCTGATTGCTGGTA
JEV F:AGGTGACACTATAGAATAAGGAGCCATCGTGGTGGAGT
R:GTACGACTCACTATAGGGATCCATCTCGACCAGCACCT。
4.如权利要求1所述的检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述7种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV,ASFV,PPV，PRRSV，CSFV,PCV2,JEV嵌合引物的各条带大小如下：PRV:156-160bp,CSFV:195-196bp,ASFV:227-288bp,PRRSV:258-261bp,PPV:284-285bp,PCV2:337-341bp and JEV:360-361bp。
5.如权利要求1所述的检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法：
对PRV的最低检测量为103copies/μl；
对CSFV的最低检测量为102copies/μl；
对ASFV的最低检测量为103copies/μl；
对PRRSV的最低检测量为102copies/μl；
对PPV的最低检测量为103copies/μl；
PCV2的为102copies/μl，JEV的为103copies/μl；
当7种病毒同时存在时，最低检测限度为1000copies/μl。
CN201510996088.1A 2015-12-25 2015-12-25 一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法 Pending CN105969910A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510996088.1A CN105969910A (zh) 2015-12-25 2015-12-25 一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510996088.1A CN105969910A (zh) 2015-12-25 2015-12-25 一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105969910A true CN105969910A (zh) 2016-09-28

Family

ID=56988198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510996088.1A Pending CN105969910A (zh) 2015-12-25 2015-12-25 一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105969910A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115478118A (zh) * 2022-06-28 2022-12-16 四川农业大学 猪圆环病毒Taqman多重荧光定量PCR检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101260442A (zh) * 2007-03-09 2008-09-10 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量pcr方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101260442A (zh) * 2007-03-09 2008-09-10 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量pcr方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LING HU等: "Simultaneous typing of seven porcine pathogens by multiplex PCR with a GeXP analyser", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
张民秀等: "8 种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立", 《中国农业科学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115478118A (zh) * 2022-06-28 2022-12-16 四川农业大学 猪圆环病毒Taqman多重荧光定量PCR检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105925728B (zh) 一种塞内加谷病毒实时荧光定量pcr检测引物及试剂盒
CN104513865B (zh) 反转录pcr检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法
Fischer et al. Detection and differentiation of field and vaccine strains of canine distemper virus using reverse transcription followed by nested real time PCR (RT-nqPCR) and RFLP analysis
CN103981286B (zh) 鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒及其引物组
CN105018646B (zh) 一种检测牛流行热病毒的引物、探针及试剂盒
Zhang et al. Development of a directly visualized recombinase polymerase amplification–sybr green i method for the rapid detection of African swine fever virus
CN103397105B (zh) 一种检测gii型诺如病毒的试剂盒及其用途
CN116676429B (zh) 用于检测穿山甲呼吸道合胞病毒b型的lamp引物组及其应用
CN103468830A (zh) 用于检测猴痘病毒的nasba试剂盒及其应用
CN107488749A (zh) 一种检测猪圆环病毒3型的lamp引物及检测方法
Huang et al. CRISPR/Cas12a technology combined with RPA for rapid and portable SFTSV detection
CN107955840A (zh) 用于检测猪口蹄疫病毒与塞内加谷病毒的双重pcr引物、检测方法及试剂盒
Li et al. Rapid detection of porcine deltacoronavirus and porcine epidemic diarrhea virus using the duplex recombinase polymerase amplification method
CN104673934A (zh) 锦鲤疱疹病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法
CN104774953A (zh) 非洲猪瘟病毒cp530r基因的荧光pcr检测试剂及其制备方法与用途
CN106148572A (zh) 用于盖塔病毒实时荧光定量pcr检测体系及检测方法
CN105969910A (zh) 一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法
CN107287352A (zh) 鸭肠炎病毒和鸭肝炎病毒快速检测的探针引物组及其方法
CN116716415A (zh) 一种用于昆虫细胞dna残留含量定量检测的引物探针及其方法和应用
CN106244730B (zh) 猴嗜t淋巴细胞病毒i型的rt-lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
Kim Improved diagnosis of spring viremia of carp by nested reverse-transcription PCR: development of a chimeric positive control for prevention of false-positive diagnosis
Wei et al. Rapid and visual detection of porcine parvovirus using an ERA-CRISPR/Cas12a system combined with lateral flow dipstick assay
Li et al. Development of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for the detection of porcine pegivirus
Wu et al. New rapid detection by using a constant temperature method for avian leukosis viruses
CN107267666A (zh) 一种基于猪非典型瘟病毒e2基因的荧光定量rt‑pcr检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160928